分子生物學課件PCR

1、PCR: polymerase chain reaction 聚合酶鏈式反應聚合酶鏈式反應PCRPCR技術(shù)的基本原理技術(shù)的基本原理 模板DNA95PCR循環(huán)過程50引物1引物2DNA引物PCR循環(huán)過程引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶PCR循環(huán)過程第1輪結(jié)束95第2輪開始PCR循環(huán)過程72TaqTaqTaqTaqPCR循環(huán)過程509572第2輪結(jié)束PCR循環(huán)過程模板DNA第1輪擴增第2輪擴增第3輪擴增第4輪擴增第5輪擴增PCR循環(huán)過程第6輪擴增PCRPCR的反應動力學的反應動力學 PCRPCR的三個反應步驟反復進行，使的三個反應步驟反復進行，使DNADNA擴增量擴增量呈指數(shù)上升。平均擴

2、增效率的理論值為呈指數(shù)上升。平均擴增效率的理論值為100%100%，但，但在實際反應中平均效率達不到理論值。在實際反應中平均效率達不到理論值。反應初期，反應初期，靶序列靶序列DNADNA片段的增加呈指數(shù)形式，隨著片段的增加呈指數(shù)形式，隨著PCRPCR產(chǎn)產(chǎn)物的逐漸積累，物的逐漸積累，被擴增的被擴增的DNADNA片段片段不再呈指數(shù)增不再呈指數(shù)增加加，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)，而進入線性增長期或靜止期，即出現(xiàn)“停滯停滯效應效應”，這種效應期稱這種效應期稱平臺期平臺期。大多數(shù)情況下，大多數(shù)情況下，平臺期的到來是不可避免的。平臺期的到來是不可避免的。 PCR擴增體系擴增體系模板模板 3TTAGG

3、CCTGGATAAGCGCCTGGA 5引物引物 5TCCGG C TaqDNATaqDNA聚合酶聚合酶底物底物 PCR PCR 反應體系反應體系PCRPCR反應五要素：反應五要素：引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和Mg2+Mg2+ 標準的標準的PCRPCR反應體系：反應體系：1010擴增緩沖液擴增緩沖液 10ul10ul4 4種種dNTPdNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ug Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMg2+Mg2+ 1

4、.5mmol/L1.5mmol/L加雙或三蒸水至加雙或三蒸水至 100ul100ul引物引物 引物是人工合成的引物是人工合成的兩段寡核苷酸單鏈，兩段寡核苷酸單鏈，是是PCRPCR特異性反應特異性反應的關(guān)鍵，擴增產(chǎn)物的大小也由的關(guān)鍵，擴增產(chǎn)物的大小也由特異引物限定。特異引物限定。3 3 設(shè)計引物應遵循以下原則：設(shè)計引物應遵循以下原則：引物引物長度長度： 15-30bp15-30bp，常用為，常用為20-27bp20-27bp左右。在做長片段左右。在做長片段PCRPCR或或做某些特殊的做某些特殊的PCRPCR時應使用較長的引物，但最多不超時應使用較長的引物，但最多不超過過5050個核苷酸個核苷酸引

5、物引物堿基堿基： G+CG+C含量以含量以40-60%40-60%為宜，過高或過低均不利于引為宜，過高或過低均不利于引發(fā)。發(fā)。ATGCATGC最好隨機分布最好隨機分布，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。，避免聚嘌呤或嘧啶核苷酸。避免引物自身互補避免引物自身互補，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因空間位阻而，形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，因空間位阻而影響其與模板結(jié)合。影響其與模板結(jié)合。兩條引物間之間也不能互補兩條引物間之間也不能互補，否，否則會形成則會形成引物二聚體引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶或降低，產(chǎn)生非特異的擴增條帶或降低引物有效濃度。引物有效濃度。引物引物33端的堿基端的堿基，應嚴格要求配對，應嚴格要求配對，不可修飾，不可修飾，

6、以避免因末端堿基不配對而導致以避免因末端堿基不配對而導致PCRPCR失敗。考慮到失敗?？紤]到密密碼子的簡并性碼子的簡并性，引物，引物33端不終止于密碼子第三個堿端不終止于密碼子第三個堿基基。因該位置由于密碼子的簡并性影響擴增的特異性。因該位置由于密碼子的簡并性影響擴增的特異性。 引物的引物的5 5端可以修飾端可以修飾，它，它對擴增特異性影響不對擴增特異性影響不大。大。如增加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等；如增加酶切位點；標記生物素、熒光、地高辛等；引入點突變、啟動子序列等。引入點突變、啟動子序列等。引物的引物的特異性特異性： 引物應該與引物應該與核酸序列數(shù)據(jù)庫的核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無

7、明顯的其它序列無明顯的同源性，同源性，以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合。以減少引物與基因組的非特異性結(jié)合。簡并引物簡并引物 如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸如果引物的序列是從基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的氨基酸序列序列反推反推出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要出來的，就必須考慮密碼的簡并性。需要合成合成多種序列的引物多種序列的引物，彼此間只有一個或幾個堿基彼此間只有一個或幾個堿基差異差異。這樣的。這樣的混合引物稱簡并引物混合引物稱簡并引物。 簡并性簡并性(degeneracy)(degeneracy) 遺傳密碼中，除色氨酸和蛋氨酸僅有一個密碼遺傳密碼中，除色氨酸和蛋氨酸僅有一個密碼子外，其余氨基酸

8、均有多個密碼子。子外，其余氨基酸均有多個密碼子。例如，例如， 序列序列1 1：tg tg a a atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列2 2：tg tg c c atgcatgcatgc atgcatgcatgc 序列序列3 3：tg tg t t atgcatgcatgcatgcatgcatgc 若樣品并不能明確是若樣品并不能明確是1 1，2 2還是還是3 3，為了能從不，為了能從不確定序列來源的樣本中，擴增出同源序列來，你的確定序列來源的樣本中，擴增出同源序列來，你的引物實際上就是引物實際上就是針對序列針對序列1 1，2 2，3 3設(shè)計的混合物設(shè)計的混合物。這樣不論

9、是這樣不論是1 1，2 2還是還是3 3，采用你的引物均能有效擴，采用你的引物均能有效擴增。增。 套嵌引物套嵌引物 設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物設(shè)計多組引物，結(jié)合位點依次位于前一組引物之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。之間。增加擴增產(chǎn)物的特異性。1324 引物的溶解與保存：引物的溶解與保存： 引物量：引物量： DNADNA聚合酶聚合酶 Taq DNA聚合酶聚合酶 熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性最大特點是最大特點是熱穩(wěn)定性熱穩(wěn)定性，耐高溫，非常適合，耐高溫，非常適合PCRPCR過程過程的反復高溫變性要求。的反復高溫變性要求。 最適溫度高最適溫度高最適溫度：最適溫度： 74-80 74-80 o oC (

10、PCRC (PCR延伸：延伸：7272-）延伸速度：延伸速度： 約約35-150nt/s.35-150nt/s.酶分子酶分子 最長延伸長度：最長延伸長度： 6.7kb6.7kb Taq酶的功能缺點酶的功能缺點具有具有5 53 3聚合酶活性和聚合酶活性和5 53 3外切酶活性，外切酶活性，但沒有但沒有3 35 5外切酶活性。外切酶活性。 因此不能修復錯誤的堿基配對！因此不能修復錯誤的堿基配對！ 合成超過合成超過600bp長度的長度的DNA就有可能出現(xiàn)錯配，用就有可能出現(xiàn)錯配，用于克隆基因時必須測序。于克隆基因時必須測序。 金屬離子敏感（尤其是金屬離子敏感（尤其是MgMg2+ 2+ ）。）。 1.

11、 1. 不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有不同的公司或不同批次的產(chǎn)品常有很大的很大的差異差異，由于酶的濃度對，由于酶的濃度對PCRPCR反應影響極大，因此反應影響極大，因此應當作應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度預試驗或使用廠家推薦的濃度。 2. 2. 濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低濃度過高可引起非特異性擴增，濃度過低則合成產(chǎn)物量減少則合成產(chǎn)物量減少. .底物：底物：dNTPdNTP1. dNTP1. dNTP小量分裝，小量分裝，-20-20冰凍保存。冰凍保存。多次凍融會使多次凍融會使dNTPdNTP降解。降解。在在PCRPCR反應中，反應中，dNTPdNTP應為應為5050200umol/L

12、200umol/L，不能，不能低于低于101015mol/L15mol/L。濃度過高濃度過高，與與MgMg2+2+結(jié)合，使結(jié)合，使游離的游離的MgMg2+2+濃度降低，抑制濃度降低，抑制Taq DNATaq DNA聚合酶的活聚合酶的活性。性。濃度過低濃度過低又會降低又會降低PCRPCR產(chǎn)物的產(chǎn)量。產(chǎn)物的產(chǎn)量。2. 2. 尤其是注意尤其是注意4 4種種dNTPdNTP的濃度要相等的濃度要相等( ( 等摩爾配制等摩爾配制) )，如其中任何一種濃度不同于其它幾種時，就會引如其中任何一種濃度不同于其它幾種時，就會引起錯配。降低合成速度，過早終止反應。起錯配。降低合成速度，過早終止反應。 模板模板( (

13、靶基因靶基因) )要求：要求：1. 1001. 100 l l反應體系中質(zhì)粒反應體系中質(zhì)粒DNA 1-10ngDNA 1-10ng，基因組，基因組DNA DNA 50-100ng 50-100ng 足夠。足夠。2. 2. 純度要求不太嚴格，可以是粗品，純度要求不太嚴格，可以是粗品，但不能混有但不能混有SDSSDS、有機溶劑酚、氯仿等、有機溶劑酚、氯仿等蛋白質(zhì)變性劑蛋白質(zhì)變性劑以及任何以及任何蛋白酶、核酸酶蛋白酶、核酸酶、Taq DNATaq DNA聚合酶抑制劑以及能結(jié)聚合酶抑制劑以及能結(jié)合合DNADNA的蛋白。的蛋白。 模板的種類：模板的種類：DNADNA或或RNARNA。1. RNA1. R

14、NA：先通過：先通過反轉(zhuǎn)錄得到反轉(zhuǎn)錄得到cDNAcDNA。2. 2. 質(zhì)粒：線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實際質(zhì)粒：線性化的比環(huán)狀的效果好，但在實際操作中，往往不需要將質(zhì)粒線性化，而操作中，往往不需要將質(zhì)粒線性化，而直接用做直接用做模板模板。3. 3. 高分子量高分子量的脫氧核糖核酸（如基因組脫氧核的脫氧核糖核酸（如基因組脫氧核糖核酸）做模板時，如果用糖核酸）做模板時，如果用適當?shù)拿赶冗M行消化適當?shù)拿赶冗M行消化再作為模板，擴增效果會更好。再作為模板，擴增效果會更好。Mg2+ Mg2+Mg2+對對PCRPCR擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的擴增的特異性和產(chǎn)量有顯著的影響。影響。 Mg2+ Mg2+可以可

15、以與與dNTPdNTP結(jié)合結(jié)合，易化，易化4 4種種dNTPdNTP的的協(xié)作，而且可以促進和穩(wěn)定引物協(xié)作，而且可以促進和穩(wěn)定引物- -模板的相互作模板的相互作用。因此，用。因此，Mg2+Mg2+濃度濃度過高，可出現(xiàn)非特異擴增過高，可出現(xiàn)非特異擴增。 濃度過低會降低濃度過低會降低Taq DNATaq DNA聚合酶的活性聚合酶的活性，使反應產(chǎn)物減少。在一般的使反應產(chǎn)物減少。在一般的PCRPCR反應中，反應中，各種各種dNTPdNTP濃度為濃度為200200 mol/Lmol/L時，時，Mg2+Mg2+終濃度為終濃度為1.51.52.0mmol/L2.0mmol/L為宜。為宜。 PCRPCR反應條件

16、的選擇反應條件的選擇 基于基于PCRPCR原理三步驟而設(shè)置原理三步驟而設(shè)置變性變性- -退火退火- -延伸延伸三三個溫度點。標準反應中采用三溫度點法個溫度點。標準反應中采用三溫度點法 對于對于較短靶基因較短靶基因( (長度為長度為100100300bp300bp時時) )可采用可采用二溫度點法，除二溫度點法，除變性溫度變性溫度外、外、退火與延伸溫度可退火與延伸溫度可合二為一合二為一，一般采用，一般采用9494變性，變性，6565左右退火與左右退火與延伸延伸( (此溫度此溫度Taq DNATaq DNA酶仍有較高的催化活性酶仍有較高的催化活性) )。 - 溫度與時間的設(shè)置溫度與時間的設(shè)置變性溫度

17、與時間變性溫度與時間： 變性溫度低，解鏈不完全變性溫度低，解鏈不完全是導致是導致PCRPCR失敗失敗的最主要原因。的最主要原因。 一般情況下，一般情況下，939394 1min94 1min足以使模板足以使模板DNADNA變性，若低于變性，若低于9393則需延長時間，則需延長時間，但溫度但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。退火溫度與時間：退火溫度與時間： 退火溫度與時間，取決于退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基因序列的長度成及其濃度，還有靶基因序列的長度。 TmTm值值( (解鏈溫度解鏈溫度)=)=4(

18、G+C)4(G+C)2(A+T)2(A+T)退火溫度退火溫度=Tm=Tm值值- (5- (510)10)在在TmTm值允許范圍內(nèi)值允許范圍內(nèi)，選擇，選擇較高的退火溫度較高的退火溫度可大可大大大減少減少引物和模板間的引物和模板間的非特異性非特異性結(jié)合。結(jié)合。 退火時間一般為退火時間一般為303060sec60sec，足以使引物與模板，足以使引物與模板之間完全結(jié)合。之間完全結(jié)合。 延伸溫度與時間延伸溫度與時間 Taq DNA Taq DNA聚合酶的生物學活性：聚合酶的生物學活性： 707080 150 80 150 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 70 60 70 60 核苷酸核苷酸/S/S/

19、酶分子酶分子 55 24 55 24 核苷酸核苷酸/S/S/酶分子酶分子 高于高于9090時，時， DNADNA合成幾乎不能進行合成幾乎不能進行延伸溫度一般選擇在延伸溫度一般選擇在70707575之間，之間，常用溫度為常用溫度為7272。 反應時間，可據(jù)擴增片段的長度而定：反應時間，可據(jù)擴增片段的長度而定： 一般一般1Kb1Kb以內(nèi)的以內(nèi)的DNADNA片段，延伸時間片段，延伸時間1min1min足夠。足夠。 3 34kb4kb的靶序列需的靶序列需3 34min4min； 10Kb 10Kb需延伸至需延伸至15min15min 循環(huán)次數(shù)循環(huán)次數(shù) 循環(huán)次數(shù)影響循環(huán)次數(shù)影響PCRPCR擴增程度。擴增

20、程度。PCRPCR循環(huán)次數(shù)主循環(huán)次數(shù)主要取決于要取決于模板模板DNADNA的的濃度濃度。一般為。一般為25-3025-30次，次，3535次次左右時，達到平臺期左右時，達到平臺期。循環(huán)。循環(huán)次數(shù)越多次數(shù)越多，非特異性非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多產(chǎn)物的量亦隨之增多。 PCR擴增產(chǎn)物分析擴增產(chǎn)物分析 1.1.凝膠電泳分析凝膠電泳分析：PCRPCR產(chǎn)物電泳，產(chǎn)物電泳，EBEB染色染色, ,紫外儀下紫外儀下觀察觀察.PCR.PCR產(chǎn)物片段的大小應與預計的一致。產(chǎn)物片段的大小應與預計的一致。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：通常應用：通常應用1 12%2%的瓊脂糖的瓊脂糖凝膠，供檢測用。凝膠，供檢測用。聚丙烯

21、酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：6 610%10%聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠電泳分辨率高，分辨率高，分離效果比瓊脂糖好，條帶分離效果比瓊脂糖好，條帶比較集中，而且比較集中，而且DNADNA回收純度高?；厥占兌雀摺?. 2. 酶切分析酶切分析：根據(jù)：根據(jù)PCRPCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點，用相應的用相應的酶切、電泳分離后酶切、電泳分離后，獲得，獲得符合理論的片段，符合理論的片段，此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還此法既能進行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進行變異性研究。能進行變異性研究。3. 3. 分子雜交分子雜交：如：如SouthernSouth

22、ern印跡雜交：在兩引物之間另印跡雜交：在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈，標記后做探針，與合成一條寡核苷酸鏈，標記后做探針，與PCRPCR產(chǎn)物雜產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，還可知其分子量。交。此法既可作特異性鑒定，還可知其分子量。4. 4. 斑點雜交斑點雜交：將：將PCRPCR產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜產(chǎn)物點在硝酸纖維素膜或尼龍膜薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探針雜交，薄膜上，再用放射性或非放射性寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點，主要用于觀察有無著色斑點，主要用于PCRPCR產(chǎn)物特異性鑒定及產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。變異分析。5.5.核酸序列分析：核酸序列分析：是是檢測檢測PCR

23、PCR產(chǎn)物特異性的最可靠產(chǎn)物特異性的最可靠方法。方法。 陽性對照陽性對照: : 是是PCRPCR反應是否反應是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。要的參考標志。PCR反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有反應的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有: 模板的制備，模板的制備， 引物的質(zhì)量與特異性，引物的質(zhì)量與特異性， 酶的質(zhì)量及活性酶的質(zhì)量及活性 PCR循環(huán)條件循環(huán)條件 PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以以內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于內(nèi)，有些最好于當日電泳檢測，大于48h后后帶型不規(guī)則甚致消失帶型不規(guī)則甚致消失 注意注意1、PCR常見問

24、題：常見問題： 出現(xiàn)非特異性擴增帶出現(xiàn)非特異性擴增帶 無特異性擴增帶無特異性擴增帶2、出現(xiàn)非特異性擴增帶可能原因、出現(xiàn)非特異性擴增帶可能原因 酶量過多酶量過多 Mg2+濃度過高濃度過高 dNTP濃度過高濃度過高 引物濃度過高，引物設(shè)計特異性差引物濃度過高，引物設(shè)計特異性差 模板純度差模板純度差 退火溫度過低退火溫度過低 循環(huán)次數(shù)過多循環(huán)次數(shù)過多片狀拖帶或涂抹帶片狀拖帶或涂抹帶 其原因往往由于酶量過多或酶其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，的質(zhì)量差，dNTPdNTP濃度過高，濃度過高，Mg2+Mg2+濃濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。過多引起。 對策：對策

25、： 減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。 減少減少dNTPdNTP的濃度。的濃度。 適當降低適當降低Mg2+Mg2+濃度。濃度。 減少循環(huán)次數(shù)。減少循環(huán)次數(shù)。 假陰性假陰性 模板：模板：模板中含有模板中含有TaqTaq酶抑制劑酶抑制劑. . 提取制備提取制備模板時模板時丟失丟失過多，或過多，或吸入酚吸入酚. . 模板模板變性不徹變性不徹底底. .對策：配制有效而穩(wěn)定的消化處理液對策：配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦其程序亦應固定不宜隨意更改應固定不宜隨意更改 酶失活酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因以分析是否因

26、酶的活性喪失或不夠酶的活性喪失或不夠而導致假陰性。而導致假陰性。（有時忘加有時忘加TaqTaq酶）酶）. .3. 3. 引物引物：引物的設(shè)計、質(zhì)量、濃度、兩條引物：引物的設(shè)計、質(zhì)量、濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是的濃度是否對稱，是PCRPCR失敗或擴增條帶不理失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。想、容易彌散的常見原因。 對策為：對策為： 選定好的引物合成單位。選定好的引物合成單位。 引物的濃度不僅要看引物的濃度不僅要看ODOD值，值，更要注重引物原更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應大體一致。如一條引物而且

27、兩引物帶的亮度應大體一致。如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做有條帶，一條引物無條帶，此時做PCRPCR有可能有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。其濃度。 引物應引物應高濃度小量分裝保存高濃度小量分裝保存, ,防止多次凍融防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分或長期放冰箱冷藏部分, ,導致引物降解失效。導致引物降解失效。假陰性假陰性4.Mg2+4.Mg2+濃度濃度：濃度：濃度過高可降低過高可降低PCRPCR擴增的擴增的特異性特異性，濃度濃度過低則影響過低則影響

28、PCRPCR擴增產(chǎn)量，擴增產(chǎn)量，甚至使甚至使PCRPCR擴增失擴增失敗而不出擴增條帶。敗而不出擴增條帶。5.5.反應體積的改變反應體積的改變：在做小體積如在做小體積如20ul20ul后，再做大后，再做大體積時體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。，一定要模索條件，否則容易失敗。6.6.物理原因物理原因：如變性溫度低，變性時間短，極有可：如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性能出現(xiàn)假陰性; ;退火溫度過低，可致非特異性擴退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率增而降低特異性擴增效率. .退火溫度過高影響引退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低物與模板的結(jié)合而降低PCRPCR擴增效

29、率。擴增效率。7.7.靶序列變異：靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其物與模板失去互補序列，其PCRPCR擴增是不會成功擴增是不會成功的。的。 假陽性假陽性 現(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物?，F(xiàn)象：空白對照出現(xiàn)目的擴增產(chǎn)物。 出現(xiàn)的出現(xiàn)的PCRPCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，擴增條帶與目的靶序列條帶一致，但其條帶更整齊，亮度更高但其條帶更整齊，亮度更高引物設(shè)計不合適：引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增選擇的擴增序列與非目的擴增序列有序列有同源性同源性，因而可能擴增出的，因而可能擴增出的PCRPCR產(chǎn)物為非產(chǎn)物為非目的性的序列。目