基因工程改造秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫的關(guān)鍵技術(shù)研究

1、課題類型：  探索導(dǎo)向類申請(qǐng)受理編號(hào)：  SQ2006AA05Z109513國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863計(jì)劃）專題課題申請(qǐng)書(shū) 技術(shù)領(lǐng)域名稱：先進(jìn)能源技術(shù)領(lǐng)域?qū)ｎ}名稱：氫能與燃料電池技術(shù)申請(qǐng)指南技術(shù)方向：制氫技術(shù)課題名稱：基因工程改造秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫的關(guān)鍵技術(shù)研究申 請(qǐng) 人：程軍依托單位：浙江大學(xué)中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部2006-09-05序號(hào)姓名性別出生日期職稱職務(wù)專業(yè)為本課題工作時(shí)間(人月)課題組中職務(wù)(組長(zhǎng)、副組長(zhǎng)或成員)在課題中分擔(dān)的任務(wù)所在單位1程軍男 1974年8月 高級(jí)職稱 無(wú) 環(huán)境類 24 組

2、長(zhǎng) 項(xiàng)目負(fù)責(zé)人  浙江大學(xué)  2謝斌飛女 1981年10月 其他人員 無(wú) 環(huán)境類 30 成員 產(chǎn)氫代謝機(jī)理  浙江大學(xué)  3戚峰女 1980年7月 其他人員 無(wú) 環(huán)境類 30 成員 秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫  浙江大學(xué)  4張傳溪男 1960年1月 高級(jí)職稱 副所長(zhǎng) 生物科學(xué)類 18 副組長(zhǎng) 基因改造理論  浙江大學(xué)  5劉建忠男 1965

3、年2月 高級(jí)職稱 無(wú) 環(huán)境類 12 成員 高效產(chǎn)氫工藝  浙江大學(xué)  6李春雨男 1973年5月 中級(jí)職稱 無(wú) 生物科學(xué)類 12 成員 基因改造秸桿  浙江大學(xué)  7宋文路男 1983年7月 其他人員 無(wú) 生物科學(xué)類 30 成員 產(chǎn)氫菌植入抗性基因  浙江大學(xué)  8鮑艷原女 1968年6月 高級(jí)職稱 無(wú) 生物科學(xué)類 3

4、0 成員 基因改造產(chǎn)氫菌  浙江大學(xué)  9蘇會(huì)波男 1983年12月 其他人員 無(wú) 生物科學(xué)類 30 成員 產(chǎn)氫菌剔除不利基因  浙江大學(xué)  10潘華引男 1985年3月 其他人員 無(wú) 環(huán)境類 30 成員 秸桿高效水解  浙江大學(xué)  課題參加總?cè)藬?shù) 10 人。 其中：高級(jí)職稱 4 人， 中級(jí)職稱 1 人， 初級(jí)職稱 0 

5、;人， 無(wú)職稱 5 人； 其中具有：博士學(xué)位 5 人， 碩士學(xué)位 0 人， 學(xué)士學(xué)位 5 人， 其他 0 人； 合計(jì)：投入 246 人月2.1 課題組長(zhǎng)、副組長(zhǎng)資歷情況（從事過(guò)的主要研究任務(wù)及所負(fù)責(zé)任和作用，主要研究成果、發(fā)明專利和獲獎(jiǎng)情況，在國(guó)內(nèi)外主要刊物上發(fā)表論文情況，完成其他科技計(jì)劃課題情況，特別是近五年取得的與本申請(qǐng)課題相關(guān)的研究成果情況，字?jǐn)?shù)要求1000字以內(nèi)）程軍，男，1974年8月生，2002年3月浙江大學(xué)工程熱物理專業(yè)博士畢業(yè)，現(xiàn)為浙江大學(xué)能源清潔利用國(guó)家重點(diǎn)

6、實(shí)驗(yàn)室副教授，研究領(lǐng)域?yàn)槲⑸镏茪湟约澳茉锤咝鍧嵗?。在微生物制氫領(lǐng)域作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人承擔(dān)了1項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“城市固體有機(jī)廢棄物以微生物發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的機(jī)理研究”、1項(xiàng)全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目、1項(xiàng)霍英東優(yōu)選資助基金項(xiàng)目和1項(xiàng)浙江省科技攻關(guān)項(xiàng)目，作為主要參加者完成了10余項(xiàng)國(guó)家和省部級(jí)重點(diǎn)科技攻關(guān)和基金項(xiàng)目。2001年和2004年兩次獲得國(guó)家科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)，2003年獲得浙江省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)，2004年獲得全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文獎(jiǎng)。曾合編高校教材1部，在國(guó)內(nèi)外重要學(xué)術(shù)期刊上發(fā)表論文50余篇。致力于對(duì)生物質(zhì)及固體有機(jī)廢棄物的高效水解及微生物法產(chǎn)氫研究，提出了發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)

7、氫氣和甲烷的新工藝，探索了發(fā)酵和光合耦合法高效產(chǎn)氫體系，并對(duì)秸桿生長(zhǎng)細(xì)胞和產(chǎn)氫菌株的基因工程改造進(jìn)行了可行性研究，使系統(tǒng)的能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高，取得了一定的研究成果，已發(fā)表和錄用重要期刊論文5篇。 張傳溪，男，1960年1月生，教授，博導(dǎo)。1985年畢業(yè)于浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)系獲碩士學(xué)位，1991年赴日本京都工纖大應(yīng)用生物學(xué)科從事生理生化研究，1993年任浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)副教授，1994.1-97.6在職攻讀博士學(xué)位，在中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所從事分子生物學(xué)和基因工程研究，博士學(xué)位論文“桿狀病毒Ph、PK基因研究及人EPO基因在桿狀病毒-昆蟲(chóng)系統(tǒng)中的表達(dá)”被評(píng)為全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文。199

8、8年浙江大學(xué)應(yīng)用昆蟲(chóng)研究所任教授、副所長(zhǎng)。2001.5-2003.8年日本學(xué)術(shù)振興會(huì)特別研究員?，F(xiàn)為浙江大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室教授、博導(dǎo)，主要從事分子生物學(xué)和基因工程研究。近年來(lái)除從事病毒基因功能研究外，還致力于原核和真核表達(dá)、產(chǎn)氫菌株的基因工程改造研究，在產(chǎn)氣腸桿菌剔除乳酸基因片段和表達(dá)產(chǎn)氫酶基因方面取得了一定的研究成果。學(xué)術(shù)兼職：應(yīng)邀任美國(guó)國(guó)家自然科學(xué)基金會(huì)（NSF）評(píng)審專家、中國(guó)病毒學(xué)編委。曾先后主持4項(xiàng)有關(guān)功能基因分析的國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目和1項(xiàng)教育部專項(xiàng)基金；參加 “863”、“973”有關(guān)分子生物學(xué)和基因工程項(xiàng)目多項(xiàng)。已先后在國(guó)內(nèi)外學(xué)術(shù)刊物發(fā)表有關(guān)研究論文100余篇（其中SCI收錄3

9、2篇），主編著作2本，參編5本，授權(quán)專利4項(xiàng)。 2.2 課題組長(zhǎng)、副組長(zhǎng)目前承擔(dān)863計(jì)劃和其它國(guó)家科技計(jì)劃課題情況（包括人員姓名、承擔(dān)課題名稱、課題經(jīng)費(fèi)數(shù)、課題起止時(shí)間、所屬科技計(jì)劃名稱等信息）姓名承擔(dān)課題名稱課題經(jīng)費(fèi)數(shù)(萬(wàn)元)課題開(kāi)始時(shí)間課題結(jié)束時(shí)間所屬科技計(jì)劃張傳溪 基因工程表達(dá)AChE基因及其在綠色農(nóng)藥先導(dǎo)物篩選應(yīng)用 50 2003-9-1 2008-8-30 973計(jì)劃 程軍 城市固體有機(jī)廢棄物以微生物發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷研究 24 2005-1-1 2007-12-30 &

10、#160;其他說(shuō)明事項(xiàng)：程軍副教授負(fù)責(zé)的該國(guó)家基金項(xiàng)目與本次申請(qǐng)863項(xiàng)目的研究目的和內(nèi)容完全不同，但是都屬于微生物發(fā)酵產(chǎn)氫研究領(lǐng)域，所具備的科研支撐條件、主要儀器設(shè)備以及積累的發(fā)酵產(chǎn)氫理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可以為本次項(xiàng)目的順利完成提供良好的平臺(tái)。 張傳溪教授負(fù)責(zé)的該973項(xiàng)目二級(jí)課題與本次申請(qǐng)863項(xiàng)目的研究目的和內(nèi)容完全不同，但是都屬于基因工程研究領(lǐng)域，所具備的科研支撐條件、主要儀器設(shè)備以及積累的基因工程理論知識(shí)和實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，可以為本次項(xiàng)目的順利完成提供良好的平臺(tái)。 2.3 課題組長(zhǎng)及課題組主要成員是否曾就相同或類似課題863計(jì)劃和國(guó)家其他科技計(jì)劃提出申請(qǐng)（如有，請(qǐng)說(shuō)明申請(qǐng)人姓名、申請(qǐng)科技計(jì)劃

11、名稱、申請(qǐng)課題名稱、申請(qǐng)時(shí)間、申請(qǐng)結(jié)果等情況，并說(shuō)明與本課題申請(qǐng)的關(guān)系）無(wú)。 3.1、課題簡(jiǎn)介（簡(jiǎn)要說(shuō)明課題的目的意義、主要研究?jī)?nèi)容、預(yù)期目標(biāo)等，字?jǐn)?shù)要求1000字以內(nèi)）能源與環(huán)境是當(dāng)今世界兩大主題，化石能源的日趨匱乏以及燃燒對(duì)環(huán)境產(chǎn)生的巨大危害要求人類加速研發(fā)潔凈高效和可再生的新能源。由于氫氣具有很高的能量密度，燃燒產(chǎn)物是水，并且沒(méi)有污染性，故是一種理想的清潔能源。近年來(lái)，世界范圍內(nèi)以氫為原料的燃料電池的迅猛發(fā)展加速了氫能經(jīng)濟(jì)的進(jìn)程，而以氫的制備、儲(chǔ)存和利用為內(nèi)容的研究開(kāi)發(fā)已成為世界各國(guó)竟相爭(zhēng)奪的高科技制高點(diǎn)之一。另一方面，我國(guó)農(nóng)村存在量大面廣的廢棄生物質(zhì)，如秸稈等大部分直接焚燒的能源利用效

12、率不到30%，造成嚴(yán)重的環(huán)境污染和資源浪費(fèi)。因此，如何高效清潔地利用生物質(zhì)能成為我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。利用秸桿等生物質(zhì)以微生物法制取氫氣對(duì)發(fā)展清潔高效的可再生能源和減少環(huán)境污染具有重要意義，是一個(gè)處于國(guó)際學(xué)術(shù)前沿的熱點(diǎn)研究課題，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。 如何使富含纖維素的秸桿等生物質(zhì)高效降解成可資利用的還原糖是利用其發(fā)酵產(chǎn)氫的首要技術(shù)難點(diǎn)和重大關(guān)鍵點(diǎn)。而其能否獲得產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題是過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，目前國(guó)際上最新的研究方向是通過(guò)基因工程改造產(chǎn)氫菌種和氫酶，并開(kāi)發(fā)高效產(chǎn)氫反應(yīng)器。因此，本項(xiàng)目提出基因工程改造秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫的關(guān)鍵技術(shù)研究。首先構(gòu)建轉(zhuǎn)基因水稻，在水稻中轉(zhuǎn)入能在秸桿特異

13、組織中表達(dá)（對(duì)活體植物莖桿本身無(wú)害）的纖維素酶和半纖維素酶等基因，在獲得高產(chǎn)量稻谷的同時(shí)又能獲得在加工過(guò)程中被自身植株生長(zhǎng)產(chǎn)生的酶高效水解為還原糖的秸稈。其次培養(yǎng)篩選高效產(chǎn)氫菌株，通過(guò)knock out 技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過(guò)程中形成乳酸等的有效途徑；同時(shí)通過(guò)克隆Fe-hydrogenase基因，在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase基因，提高產(chǎn)氫酶表達(dá)水平。并且將高效產(chǎn)氫菌Enterobacter aerogenes的產(chǎn)氫酶重組入非產(chǎn)氫抗性菌的基因組，獲得耐酸性和其它對(duì)環(huán)境耐受力強(qiáng)的產(chǎn)氫菌株。研究

14、轉(zhuǎn)基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝過(guò)程中NADH含量，通過(guò)控制代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力，以增強(qiáng)其產(chǎn)氫效率。設(shè)計(jì)高效產(chǎn)氫反應(yīng)器并優(yōu)化其運(yùn)行條件，研究pH值、氧化還原電勢(shì)和溫度等對(duì)轉(zhuǎn)基因秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程的影響規(guī)律和控制機(jī)理。預(yù)期目標(biāo)是使轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高。  3.2、課題主要研究技術(shù)的國(guó)內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀與趨勢(shì)，課題主要研究技術(shù)國(guó)內(nèi)外專利申請(qǐng)和授權(quán)情況國(guó)際上許多國(guó)家投入巨資研究的微生物制氫是一項(xiàng)利用微生物的生理代謝作用分解有機(jī)物從而生產(chǎn)氫氣的生物工程技術(shù)，它是一種符合可持續(xù)發(fā)展戰(zhàn)略的可再生能源技術(shù)。它克服

15、了常規(guī)制氫方法（如從煤、石油、天然氣等化石燃料中提取或通過(guò)水電解法制取等）需要消耗大量化石燃料和能量、并且產(chǎn)生大量污染的弊病。目前在生物法制氫研究方面主要分為發(fā)酵法和光合法兩大類，其中發(fā)酵法具有產(chǎn)氫細(xì)菌生長(zhǎng)速率快、產(chǎn)氫能力高、反應(yīng)無(wú)需光源、發(fā)酵底料來(lái)源廣等優(yōu)點(diǎn)，所以更容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)產(chǎn)氫和工業(yè)化生產(chǎn)。因此，利用秸桿等生物質(zhì)以微生物法制氫對(duì)發(fā)展清潔高效的可再生能源和減少環(huán)境污染具有重要意義，是一個(gè)處于國(guó)際學(xué)術(shù)前沿的十分活躍的熱點(diǎn)課題，具有重要的學(xué)術(shù)價(jià)值和應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者關(guān)于發(fā)酵法產(chǎn)氫的研究范圍主要局限于反應(yīng)機(jī)理相對(duì)簡(jiǎn)單的富含水溶性碳水化合物（尤其是葡萄糖）的有機(jī)廢水，對(duì)于主要由復(fù)雜大分子有機(jī)

16、質(zhì)即不溶性的大分子碳水化合物、脂類物和蛋白質(zhì)組成的生物質(zhì)及固體有機(jī)廢棄物的發(fā)酵產(chǎn)氫問(wèn)題較少研究。后者的厭氧消化產(chǎn)氫過(guò)程可分為水解、酸化和產(chǎn)氫產(chǎn)乙酸三個(gè)階段，由于其降解產(chǎn)氫過(guò)程的復(fù)雜性，國(guó)內(nèi)外在該領(lǐng)域的研究方興未艾，目前已逐步引起許多學(xué)者的高度重視。國(guó)外已有部分相關(guān)報(bào)道，如日本在90年代末到本世紀(jì)初，在暗發(fā)酵制氫方面的科研投入大大增加，尤其在2001-2004年產(chǎn)生了大量基礎(chǔ)性的研究結(jié)果。日本東北大學(xué)曾將餐廳剩菜與糞便污泥混合配成培養(yǎng)基料，利用加熱預(yù)處理的厭氧活性污泥和大豆粉倉(cāng)中富含的產(chǎn)氫菌進(jìn)行發(fā)酵制氫，發(fā)現(xiàn)底料的產(chǎn)氫潛力分別高達(dá)140ml/g和180ml/g，而厭氧活性污泥的接種產(chǎn)氫速率可高達(dá)

17、45ml/（gVSSh），2004年日本產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究所的廢棄食物產(chǎn)氫項(xiàng)目已經(jīng)進(jìn)入中試階段。另外，韓國(guó)、新加坡、印度在此領(lǐng)域的研究也比較活躍。而國(guó)內(nèi)對(duì)于固體有機(jī)廢棄物發(fā)酵產(chǎn)氫的研究才剛剛起步，如中國(guó)科學(xué)院、清華大學(xué)、中國(guó)科技大學(xué)、廈門大學(xué)、哈爾濱工業(yè)大學(xué)、鄭州大學(xué)等曾對(duì)固體廢棄物發(fā)酵產(chǎn)氫進(jìn)行了一些探索性研究，取得了一定的研究成果。眾多專家一致認(rèn)為：如何使生物質(zhì)及固體廢棄物高效降解成可資利用的還原糖是利用其發(fā)酵產(chǎn)氫的首要技術(shù)難點(diǎn)和重大關(guān)鍵點(diǎn)。而生物質(zhì)發(fā)酵產(chǎn)氫能否獲得產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的瓶頸問(wèn)題是過(guò)程的經(jīng)濟(jì)性，即如何降低發(fā)酵制氫的成本，使之可以和化石能源催化重整制氫的經(jīng)濟(jì)性相比擬，或者可以與其他生物能源過(guò)程

18、（即生物制甲烷、燃料酒精、生物柴油）相競(jìng)爭(zhēng)。其核心問(wèn)題是如何提高氫氣從葡萄糖的轉(zhuǎn)化率、如何降低底物成本、以及如何在生物反應(yīng)器水平上實(shí)現(xiàn)高效產(chǎn)氫。目前國(guó)際上最新的研究方向是從現(xiàn)有產(chǎn)氫純菌的工藝優(yōu)化中走出來(lái)，開(kāi)發(fā)新的產(chǎn)氫菌種，通過(guò)基因工程改造產(chǎn)氫菌及氫酶，并開(kāi)發(fā)高效的產(chǎn)氫反應(yīng)器。利用富含纖維素的秸桿等生物質(zhì)大規(guī)模高效低成本地發(fā)酵轉(zhuǎn)化為燃料乙醇、甲烷或氫氣等清潔能源是目前國(guó)際上的一大熱點(diǎn)課題。若能通過(guò)基因工程手段在目標(biāo)植株細(xì)胞中成功表達(dá)降解不同生物體高分子的酶，如將纖維素酶基因片段植入水稻的基因組中，而在收獲的水稻秸稈中獲得大量纖維素酶，使得秸桿在后續(xù)的加熱到90左右水解過(guò)程中不需要酸堿預(yù)處理和外加

19、纖維素酶等，即能高效降解成產(chǎn)乙醇細(xì)菌或產(chǎn)氫細(xì)菌直接可資利用的小分子還原糖，則能大幅度降低秸桿水解糖化和發(fā)酵利用的處理成本，并大幅度提高其轉(zhuǎn)化效率，取得巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。目前美國(guó)麻省理工學(xué)院、密歇根州立大學(xué)、加州大學(xué)Davis分校、杜邦公司和Syngenta公司等正在加緊開(kāi)展相關(guān)的研究探索，主要在玉米、甘蔗等植株生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶，以獲得更有利于秸稈高效水解的農(nóng)作物，但至今很少見(jiàn)到公開(kāi)的文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)1。厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫中起主要作用的是氫酶，氫酶分為放氫酶和吸氫酶，分別催化反應(yīng)的正逆反應(yīng)。作為一種有機(jī)金屬酶類，氫酶對(duì)氫代謝至關(guān)重要，研究其基因結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)、催化中心、電子載體種類和傳遞

20、順序等具有很高的理論價(jià)值，深入發(fā)掘這些生物信息對(duì)于人們定向改進(jìn)氫酶性能，獲得高產(chǎn)氫菌種具有指導(dǎo)意義。目前已經(jīng)有超過(guò)100種的氫酶基因序列可以在基因庫(kù)上獲得，但是仍然有大量已知產(chǎn)氫菌株的氫酶基因尚未克隆，獲得更多的氫酶基因也是生物制氫研究的重要方向。Mishra2等分離出高產(chǎn)氫菌陰溝腸桿菌Enterobacter cloacae IIT BT08的氫酶基因進(jìn)而進(jìn)行了酶分子特性研究。大腸桿菌的氫酶基因都屬于NiFe氫酶，梭菌屬的氫酶都屬于鐵氫酶，目前其中3株所具有的鐵氫酶得到測(cè)序，但是關(guān)于其附屬基因、調(diào)控機(jī)制還不清楚。梭菌的鐵氫酶已經(jīng)成功的克隆，并異源表達(dá)到光合細(xì)菌內(nèi)，強(qiáng)化了光合菌的產(chǎn)氫過(guò)程。雖然

21、一部分氫酶基因得到解析，但是整體進(jìn)展仍然比較緩慢而且不系統(tǒng)，有很大的研究探索空間。無(wú)論是純種還是混菌培養(yǎng)，提高關(guān)鍵菌株產(chǎn)氫效率都是最重要的工作。單純的條件優(yōu)化手段已不能滿足這一要求，需要運(yùn)用分子生物學(xué)的手段對(duì)菌種進(jìn)行改造，以達(dá)到高效產(chǎn)氫的目的。由于產(chǎn)氫細(xì)菌內(nèi)的氫酶種類繁多，通過(guò)敲掉基因片段的方法是一個(gè)可行策略。Lindblad3已將這一策略應(yīng)用到光合細(xì)菌Anabaena PCC7120中，敲掉了其中的吸氫酶HupL基因片段，使產(chǎn)氫速度比野生型高出了兩倍。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)工程手段對(duì)氫酶進(jìn)行強(qiáng)化，包括增加其活性、耐氧性也都是可行策略。通過(guò)復(fù)合誘變選育，得到遺傳穩(wěn)定好的高效產(chǎn)氫突變株，并提高菌種對(duì)環(huán)

22、境的耐受力，在高產(chǎn)氫菌種的選育中耐高溫或耐酸菌是值得重視的一個(gè)育種方向。有報(bào)道對(duì)產(chǎn)氣腸桿菌進(jìn)行激光誘變，篩選得到一株能夠耐受pH3.0的高產(chǎn)氫突變株，產(chǎn)氫量較出發(fā)菌提高了484。任南琪教授在其CSTR反應(yīng)器中分離出一株產(chǎn)氫發(fā)酵細(xì)菌ZGX4，以其為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行紫外和亞硝酸復(fù)合誘變選育，經(jīng)過(guò)連續(xù)傳代得到一株遺傳穩(wěn)定很好的高效產(chǎn)氫突變株YR1，產(chǎn)氫能力提高35，平均產(chǎn)氫速率提高235。此外，也可將產(chǎn)氫能力高的菌株的氫化酶植入一些雖然不產(chǎn)氫但是對(duì)環(huán)境耐受力高（如酸堿度、溫度、底物濃度）的菌株，如在非產(chǎn)氫菌Escherichia coli中植入丁酸梭菌的氫化酶，產(chǎn)氫量可達(dá)到3.12molH2/mo

23、l葡萄糖，高于原丁酸梭菌2.2molH2/mol葡萄糖的產(chǎn)氫量6。運(yùn)用代謝工程手段等現(xiàn)代生物技術(shù)手段對(duì)產(chǎn)氫細(xì)菌進(jìn)行改造的研究目前在生物制氫領(lǐng)域還沒(méi)有展開(kāi)，是很值得深入研究的方向。Jonathan Wood Ward7 用10種商業(yè)用酶使戊糖磷酸鹽循環(huán)與氫酶產(chǎn)氫過(guò)程相耦合，使產(chǎn)氫達(dá)到11.6molmol葡萄糖，充分展示了人工構(gòu)建代謝途徑對(duì)于產(chǎn)氫的巨大潛力。但是這一方法目前還只能在體外進(jìn)行，成本相當(dāng)高。通過(guò)細(xì)菌的代謝工程改造和控制，將會(huì)是突破暗發(fā)酵制氫低轉(zhuǎn)化率的重要突破口。目前已知的發(fā)酵制氫的產(chǎn)氫途徑包括甲酸途徑、丙酮酸途徑和NADH途徑。其中NADH途徑是最具開(kāi)發(fā)潛力的方向，多篇文獻(xiàn)中提到提高N

24、ADH的含量是有利于產(chǎn)氫的。目前普通的產(chǎn)氣腸桿菌產(chǎn)氫量?jī)H為1.58 molH2/mol葡萄糖，但是Tanisho等推測(cè)通過(guò)加入一種抑制劑使NADH脫氫酶絡(luò)合物不能形成則NADH的氧化步驟被阻斷而FADH2的氧化不受影響，從而使三羧酸循環(huán)所產(chǎn)生的NADH用于產(chǎn)氫，從理論上可望實(shí)現(xiàn)每摩爾葡萄糖產(chǎn)10 mol氫氣8-9。核心問(wèn)題是如何把細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生大量NADH，通過(guò)代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力進(jìn)行產(chǎn)氫。現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展已經(jīng)可以操作電子呼吸鏈，因此通過(guò)基因工程手段改變代謝途徑，從而大大提高產(chǎn)氫效率的夢(mèng)想是完全有可能實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)檢索表明，國(guó)內(nèi)外關(guān)于在轉(zhuǎn)基因水稻秸桿中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶

25、促進(jìn)其高效水解的相關(guān)專利尚未見(jiàn)到，關(guān)于在產(chǎn)氣腸桿菌中剔除乳酸等不利于產(chǎn)氫的基因片段并且導(dǎo)入產(chǎn)氫酶Fe-hydrogenase基因片段的相關(guān)專利也沒(méi)有見(jiàn)到。日本專利JP2003102482 10報(bào)道了從梭菌Clostridium paraputrificum中得到一種具有特殊堿基序列的氫化酶基因，將其植入寄主細(xì)胞進(jìn)行基因重組可提高產(chǎn)氫量。日本專利JP62134091 11 將一種在檸檬酸細(xì)菌的染色體DNA上表達(dá)的氫化酶基因植入普通的DNA單元質(zhì)粒，從而形成一種混合的DNA質(zhì)粒能使產(chǎn)氫能力顯著提高。歐洲專利WO2006062130 12 在一株含有甲酸鹽脫氫酶基因 (formate dehydro

26、genase gene)和氫化酶基因的菌株內(nèi)植入一種活性劑基因，從而提高了甲酸的產(chǎn)氫量。美國(guó)專利僅有一篇關(guān)于改造藻類基因強(qiáng)化其光合作用產(chǎn)氫的報(bào)道，中國(guó)專利主要集中于氫酶的鑒定和基因測(cè)序，美國(guó)和中國(guó)專利都沒(méi)有關(guān)于發(fā)酵產(chǎn)氫細(xì)菌基因改造方面的報(bào)道。參考文獻(xiàn)：1 Gadab C. Ghosh Biswas, Callista R, et al. Expression of biologically active Acidothermus cellulolyticus endoglucanase in transgenic maize plants. Plant Science, 2006 (In pr

27、ess).2 J. Mishra, N. Kumar, A.K. Ghosh, D. Das. Isolation and molecular characterization of hydrogenase gene from a high rate of hydrogen-producing bacterial strain Enterbacter cloacue IIT-BT 08. International Journal of Hydrogen Energy 27 (2002) 1475 1479.3 Lindblad P, Christensson K, Lindberg P,et

28、 al. Photoproduction of H2 by wildtype Anabaena PCC 1720 and a hydrogen uptake deficient mutant; from laboratory to outdoor culture. International Journal of Hydrogen Energy,2002,27:1271-1281. 4 Lu WY. Wen JP. Jia XQ.et al. Effect of He-Ne laser irradiation on hydrogen production by Enterobacter aer

29、ogenes. International Journal of Hydrogen Energy (in press).5 鄭國(guó)香，任南琪，林海龍等. 誘變菌種選育高效產(chǎn)氫菌株. 第六屆全國(guó)氫能學(xué)術(shù)會(huì)議論文集. 2005；11：137.6 G. Chittibabu, Kaushik Nath, Debabrata Das. Feasibility studies on the fermentative hydrogen production by recombinant Escherichia coli BL-21. Process Biochemistry 41 (2006) 682688

30、7 H Yokoi, T Tokushige, J Hirose, et al. H2 production from starch by a mixed culture of Clostridium butyricum and Enterobacter oerogenes. Biotechnology Letters, 1998, 20: 143-147.8 Tanisho S, Ishiwata Y, Takahashi K. Hydrogen production by fermentation and a trial for improment on the yield of hydr

31、ogen, Hydrogen energy Progress. Proceedings of the Ninth World Hydrogen Energy conference. 1992:583-590.9 Tanishio S, in Biohydrogen,ed, O R Zaborsky. Hydrogen production by Facultative Anaerobe Enterobacter aerogenes. Plenum press M. 1998:273-27910 日本專利，Gene, Protein, Recombinant, and Method for Pr

32、oducing Hydrogen，公開(kāi)號(hào)：JP200310248211 日本專利，Novel Hybrid Plasmid and Microorganism Capable of Highly Producing Hydrogen，公開(kāi)號(hào)：JP6213409112 歐洲專利，Microorganism having improved gene participating in hydrogen production ability and method of producing hydrogen by using the microorganism，公開(kāi)號(hào)：WO20060621303.3、課

33、題主要研究?jī)?nèi)容、擬解決的技術(shù)難點(diǎn)和主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)，現(xiàn)有研究基礎(chǔ)主要研究?jī)?nèi)容（1）轉(zhuǎn)基因植物秸桿的構(gòu)建和利用：在水稻中轉(zhuǎn)入纖維素酶和半纖維素酶等基因，在獲得高產(chǎn)量稻谷的同時(shí)又能獲得在加工過(guò)程中被自身產(chǎn)生的纖維素酶和半纖維素酶高效水解為還原糖的秸稈。（2）培養(yǎng)篩選高效產(chǎn)氫菌株，研究其發(fā)酵產(chǎn)氫的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，對(duì)其進(jìn)行純化、分離和鑒定，研究其生理生態(tài)學(xué)特征以及最佳的代謝反應(yīng)條件。（3）通過(guò)knock out 技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過(guò)程中形成乳酸等的有效途徑，從而達(dá)到加強(qiáng)產(chǎn)氫途徑的效應(yīng)，測(cè)定基因改造后產(chǎn)氫細(xì)菌的產(chǎn)氫效率和性

34、狀。（4）同時(shí)通過(guò)克隆Fe-hydrogenase基因，在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase基因，提高產(chǎn)氫酶表達(dá)水平，進(jìn)一步增強(qiáng)產(chǎn)氫效率。（5）將高效產(chǎn)氫菌Enterobacter aerogenes的產(chǎn)氫酶重組入非產(chǎn)氫抗性菌的基因組，獲得耐酸性和其它對(duì)環(huán)境耐受力強(qiáng)的產(chǎn)氫菌株。（6）研究轉(zhuǎn)基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝過(guò)程中NADH含量，通過(guò)控制代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力，以增強(qiáng)其產(chǎn)氫效率。（7）設(shè)計(jì)高效產(chǎn)氫反應(yīng)器，研究轉(zhuǎn)基因秸桿的發(fā)酵產(chǎn)氫過(guò)程，考察pH值、氧化還原電勢(shì)和溫度等參數(shù)對(duì)產(chǎn)氫過(guò)程的影響，優(yōu)化反應(yīng)器運(yùn)行條件。（8）研究轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)

35、基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫量、速率和濃度等，探索實(shí)現(xiàn)其最大能源轉(zhuǎn)化率的控制原理。擬解決的技術(shù)難點(diǎn)（1）獲得轉(zhuǎn)基因水稻種子和植株，在獲得高產(chǎn)量稻谷的同時(shí)能產(chǎn)生成功表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶的秸稈。（2）在產(chǎn)氫菌中剔除乳酸等不利于產(chǎn)氫的基因片段，導(dǎo)入產(chǎn)氫酶Fe-hydrogenase基因片段。主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)（1）利用轉(zhuǎn)基因植物自身表達(dá)的酶達(dá)到植物細(xì)胞壁的自身降解，省去傳統(tǒng)方法中的酸或堿預(yù)處理。通過(guò)轉(zhuǎn)基因在植物中表達(dá)纖維素酶和運(yùn)用表達(dá)纖維素結(jié)合蛋白改變纖維素的結(jié)構(gòu)來(lái)降低在生物質(zhì)降解中酶制劑的用量。（2）通過(guò)基因剔除和導(dǎo)入，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌代謝通道中乳酸等不利于產(chǎn)氫的代謝途徑，增強(qiáng)產(chǎn)氫酶Fe-hydrogenase的

36、基因表達(dá)水平，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率?，F(xiàn)有研究基礎(chǔ)浙江大學(xué)能源清潔利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室在生物質(zhì)能源化利用方面具有深厚的研究基礎(chǔ)，在生物質(zhì)的能源化高效轉(zhuǎn)化和清潔利用方面取得了突出業(yè)績(jī)。申請(qǐng)者程軍副教授和劉建忠教授長(zhǎng)期從事生物質(zhì)和化石能源的高效轉(zhuǎn)化和清潔利用研究工作，曾經(jīng)承擔(dān)和參加了多項(xiàng)國(guó)家及省部級(jí)重大科研項(xiàng)目，具有較強(qiáng)的科研工作能力，并積累了豐富的研究經(jīng)驗(yàn)。在生物質(zhì)及固體有機(jī)廢棄物的微生物法產(chǎn)氫研究領(lǐng)域，承擔(dān)了一項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目“城市固體有機(jī)廢棄物以微生物發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的機(jī)理研究”、1項(xiàng)全國(guó)優(yōu)秀博士學(xué)位論文作者專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目、1項(xiàng)霍英東優(yōu)選資助基金項(xiàng)目和1項(xiàng)浙江省科技攻關(guān)項(xiàng)目。并已

37、取得了一定的研究成果：實(shí)驗(yàn)研究了產(chǎn)氣腸桿菌在不同固定化條件下的發(fā)酵產(chǎn)氫特性；研究了富含碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪等三類大分子有機(jī)質(zhì)的廢棄食物發(fā)酵產(chǎn)氫特性；研究了不同來(lái)源的活性污泥對(duì)不同方法預(yù)處理的稻草秸桿發(fā)酵產(chǎn)氫特性的影響規(guī)律；研究了以厭氧活性污泥為接種物時(shí)各種反應(yīng)條件對(duì)水葫蘆發(fā)酵產(chǎn)氫的影響規(guī)律。提出了一種發(fā)酵法聯(lián)產(chǎn)氫氣和甲烷的新工藝，探索了發(fā)酵和光合耦合法高效產(chǎn)氫體系，并對(duì)秸桿生長(zhǎng)細(xì)胞和產(chǎn)氫菌株的基因工程改造進(jìn)行了可行性研究，使系統(tǒng)的能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高。在該領(lǐng)域目前已發(fā)表和錄用學(xué)術(shù)論文7篇，其中EI收錄1篇，中文重要期刊4篇。1 周俊虎，戚峰，程軍等，秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫的預(yù)處理方法研究，太陽(yáng)能

38、學(xué)報(bào)，2006（已錄用）2 周俊虎，謝琳，程軍等，富含三類大分子有機(jī)質(zhì)的廢棄食物發(fā)酵產(chǎn)氫特性，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2006（已錄用）3 周俊虎，戚峰，程軍等，不同來(lái)源的活性污泥對(duì)稻草發(fā)酵產(chǎn)氫影響的實(shí)驗(yàn)研究，浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（工學(xué)版），2006（已錄用）4 周俊虎，戚峰，程軍等，秸稈發(fā)酵產(chǎn)氫的影響因素研究，環(huán)境科學(xué)，2006（已錄用）5 程軍，潘華引，戚峰等，污泥和水葫蘆混合發(fā)酵產(chǎn)氫的影響因素分析，武漢理工大學(xué)學(xué)報(bào)，2006（已錄用）6 程軍，周俊虎，謝斌飛等，Biohydrogen production from food waste by anaerobic fermentation. Pr

39、oceedings of the ASME Power Conference. Chicago, USA, April, 2005: 1433-1436.（EI收錄）7 程軍，謝琳，謝斌飛等，Biohydrogen production from solid organic wastes by heat-shock digested sludge. Proceedings of the 8th Asian Hydrogen Energy Conference. Beijing China, May, 2005: 13-19.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)生物學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室張傳溪教授和鮑艷原副教授長(zhǎng)期從事分

40、子生物學(xué)和基因工程研究，對(duì)多種病毒進(jìn)行基因組分析，基因表達(dá)、調(diào)控、刪除、蛋白互作等進(jìn)行了深入的研究，發(fā)表了一系列SCI收錄文章。在細(xì)菌和病毒基因組基因剔除研究方面，建立了高效的ET重組系統(tǒng)和pBAD-gba-A重組系統(tǒng),并在大腸桿菌中構(gòu)建了桿狀病毒人工染色體，通過(guò)ET重組，在大腸桿菌Bacmid中剔除了Bm79, Bm118、Bm9, chitinase等一系列基因。近年來(lái)致力于產(chǎn)氫菌株和水稻秸桿的基因工程改造研究，在產(chǎn)氣腸桿菌剔除乳酸基因片段方面取得了一定的研究成果。浙江大學(xué)種質(zhì)創(chuàng)新和分子育種平臺(tái)具有良好的分子育種條件，是“211”和“985”建設(shè)平臺(tái)。目前高標(biāo)準(zhǔn)的水稻、玉米等農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因?qū)?/p>

41、驗(yàn)室能夠全年產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物。擁有300平方米的智能溫室。本項(xiàng)目組成員李春雨博士后長(zhǎng)期從事植物轉(zhuǎn)基因改良農(nóng)作物的研究和開(kāi)發(fā)，目前參加的國(guó)家杰出青年基金和國(guó)際合作項(xiàng)目主要研究目標(biāo)是農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因改良研究，直接與生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化有關(guān)的研究包括：1）植物細(xì)胞壁降解酶（polygalacturonase and pectinesterase）的分離和克??；2) 在水稻中通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)纖維素酶，目前已經(jīng)獲得了成功表達(dá)纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。因此，本課題組對(duì)于產(chǎn)氫細(xì)菌和水稻秸桿的基因改造研究具有深厚的專業(yè)理論背景和扎實(shí)的研究實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)。3.4、課題預(yù)期達(dá)到的目標(biāo)、主要技術(shù)指標(biāo)，可獲得專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)及人才培養(yǎng)情況預(yù)期

42、目標(biāo)構(gòu)建能表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻，獲得能被自身植株生長(zhǎng)產(chǎn)生的酶高效水解為還原糖的秸稈。篩選培養(yǎng)高效產(chǎn)氫菌株，通過(guò)knock out 技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過(guò)程中形成乳酸等的有效途徑；同時(shí)通過(guò)克隆Fe-hydrogenase基因，在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase基因，提高產(chǎn)氫酶表達(dá)水平。提高產(chǎn)氫菌的耐酸性等對(duì)環(huán)境耐受力，提高產(chǎn)氫代謝過(guò)程中NADH含量，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率。設(shè)計(jì)出高效產(chǎn)氫反應(yīng)器并優(yōu)化其運(yùn)行條件，使轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫能力和能源轉(zhuǎn)化率獲得突破性提高。

43、主要技術(shù)指標(biāo)1、 在水稻等種子和植株莖桿中成功表達(dá)纖維素酶等高效降解酶的基因，獲得能夠在加熱到90左右環(huán)境中自身高效水解的轉(zhuǎn)基因秸桿，從而省掉成本高而且污染大的酸堿預(yù)處理，并且在水解過(guò)程中能夠減少外加纖維素酶制劑的用量50%以上。2、 在產(chǎn)氣腸桿菌的基因組中通過(guò)基因剔除和導(dǎo)入，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌代謝通道中乳酸等不利于產(chǎn)氫的代謝途徑，增強(qiáng)產(chǎn)氫酶Fe-hydrogenase的基因表達(dá)水平，從而獲得高效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氣腸桿菌，發(fā)酵產(chǎn)氫量提高到3 molH2/mol葡萄糖以上，產(chǎn)氫效率提高50%以上。知識(shí)產(chǎn)權(quán) 擬申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專利2項(xiàng)。人才培養(yǎng) 擬培養(yǎng)1名青年骨干教師列入教育部新世紀(jì)人才或省級(jí)151人才以上計(jì)劃；

44、擬培養(yǎng)博士研究生4名，碩士研究生4名。3.5、課題擬采取的研究方法，課題技術(shù)路線（或?qū)嵤┓桨福┘捌淇尚行苑治觯ㄈ缬袇f(xié)作單位，請(qǐng)說(shuō)明課題的任務(wù)分工）研究方法和技術(shù)路線（1） 通過(guò)轉(zhuǎn)基因改變植物纖維素的結(jié)構(gòu)。在植物中表達(dá)熒光蛋白質(zhì)與纖維素結(jié)合蛋白的融合蛋白質(zhì)，使其與纖維素結(jié)合，從而使秸稈中的纖維結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。因融合蛋白質(zhì)的存在改變了纖維素與纖維素的結(jié)合關(guān)系，從而為纖維素的酶降解提供了切入點(diǎn)。在植物中表達(dá)抗高溫纖維素酶和半纖維素酶，表達(dá)了這些酶的農(nóng)作物秸稈在收獲過(guò)程中或者其后經(jīng)過(guò)高溫（90左右）處理，實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素和半纖維素高效水解成直接可供產(chǎn)氫菌利用的小分子還原糖，從而為秸稈的高效轉(zhuǎn)化提供更好的起始

45、材料。（2） 篩選培養(yǎng)高效產(chǎn)氫菌株，進(jìn)行純化、分離和鑒定。通過(guò)分子生物學(xué)中應(yīng)用成熟的細(xì)菌ET重組修飾系統(tǒng)，轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫細(xì)菌，構(gòu)建可重組產(chǎn)氫細(xì)菌?？寺‘a(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因及其側(cè)翼序列，以CAT為報(bào)告基因，構(gòu)建基因重組片段。利用knock out 等技術(shù)，剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因，抑制產(chǎn)氫細(xì)菌在代謝過(guò)程中形成乳酸等的途徑，從而達(dá)到加強(qiáng)產(chǎn)氫途徑的效應(yīng)。（3） 克隆Fe-hydrogenase基因，通過(guò)ET系統(tǒng)在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase基因，提高產(chǎn)氫酶表達(dá)水平，進(jìn)一步增

46、強(qiáng)產(chǎn)氫效率。通過(guò)CAT抗性標(biāo)記，篩選重組的產(chǎn)氫細(xì)菌，通過(guò)系列PCR，鑒定ldh被剔除的產(chǎn)氫細(xì)菌并轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase，測(cè)定基因改造后產(chǎn)氫細(xì)菌的產(chǎn)氫效率和性狀。（4） 將高效產(chǎn)氫菌Enterobacter aerogenes的產(chǎn)氫酶重組入非產(chǎn)氫抗性菌的基因組，獲得耐酸性和其它對(duì)環(huán)境耐受力強(qiáng)的產(chǎn)氫菌株。研究轉(zhuǎn)基因新型產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫機(jī)制及其代謝條件，加入抑制劑提高產(chǎn)氫代謝過(guò)程中NADH含量，通過(guò)控制代謝途徑的導(dǎo)向直接為氫酶提供還原力，以增強(qiáng)其產(chǎn)氫效率。（5） 設(shè)計(jì)高效產(chǎn)氫反應(yīng)器，研究轉(zhuǎn)基因秸桿水解產(chǎn)物的發(fā)酵產(chǎn)氫代謝過(guò)程，及時(shí)抽取發(fā)酵氣，以防止氫分壓過(guò)高對(duì)酸化過(guò)程造成抑制作用。對(duì)各個(gè)階段

47、產(chǎn)氫反應(yīng)器的終端氣相和液相產(chǎn)物定期取樣，送入氣相色譜儀和色質(zhì)聯(lián)機(jī)分析成分，考察pH值、氧化還原電勢(shì)和溫度等參數(shù)對(duì)產(chǎn)氫過(guò)程的影響，優(yōu)化反應(yīng)器運(yùn)行條件。研究轉(zhuǎn)基因秸桿接種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)氫菌的發(fā)酵產(chǎn)氫量、速率和濃度等，探索實(shí)現(xiàn)其最大能源轉(zhuǎn)化率的控制原理。可行性分析 目前美國(guó)麻省理工學(xué)院、密歇根州立大學(xué)、加州大學(xué)Davis分校、杜邦公司和Syngenta公司等正在加緊研究在玉米、甘蔗等植株中表達(dá)纖維素酶和半纖維素酶，以獲得更有利于秸稈高效水解糖化的農(nóng)作物。2006年秋即將出版的國(guó)際期刊Plant Science報(bào)道了密歇根州立大學(xué)的最新研究成果，將纖維素酶通過(guò)電擊轉(zhuǎn)入玉米中得到轉(zhuǎn)基因植株，在葉片的總可溶性蛋

48、白質(zhì)中纖維素酶含量達(dá)到2.1%，而在根系中含量達(dá)2.08%。本課題組長(zhǎng)期致力于農(nóng)作物轉(zhuǎn)基因改良研究，對(duì)在水稻中通過(guò)轉(zhuǎn)基因表達(dá)纖維素酶進(jìn)行了多年富有成效的研究，承擔(dān)了相關(guān)的國(guó)家杰出青年基金和國(guó)際合作項(xiàng)目，目前已經(jīng)成功獲得表達(dá)了纖維素酶的轉(zhuǎn)基因水稻苗。目前通過(guò)基因工程改造產(chǎn)氫菌和氫酶已成為在微生物制氫研究領(lǐng)域國(guó)際上最新的熱點(diǎn)課題，已引起許多研究機(jī)構(gòu)的高度重視并成為技術(shù)競(jìng)爭(zhēng)的制高點(diǎn)之一。本課題組長(zhǎng)期從事分子生物學(xué)和基因工程研究，對(duì)多種細(xì)菌進(jìn)行基因組分析，基因表達(dá)、調(diào)控、刪除、蛋白互作等進(jìn)行了深入的研究。建立了高效的ET重組系統(tǒng)和pBAD-gba-A重組系統(tǒng)，并在大腸桿菌中構(gòu)建了桿狀病毒人工染色體，通

49、過(guò)ET重組，在大腸桿菌Bacmid中剔除了Bm79, Bm118、Bm9, chitinase等一系列基因。近年來(lái)致力于產(chǎn)氫菌株的基因工程改造研究并取得了一定成果。本項(xiàng)目提出通過(guò)ET重組修飾系統(tǒng)剔除產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因，同時(shí)在產(chǎn)氫細(xì)菌中轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase基因增強(qiáng)產(chǎn)氫酶表達(dá)水平，從而顯著提高發(fā)酵產(chǎn)氫效率。項(xiàng)目研究目標(biāo)明確，技術(shù)路線合理，實(shí)驗(yàn)方案可行，關(guān)于該項(xiàng)目基因工程改造所涉及的關(guān)鍵技術(shù)本課題組已完全掌握，因此能夠順利完成研究任務(wù)，實(shí)現(xiàn)研究目標(biāo)。構(gòu)建進(jìn)行生物質(zhì)能轉(zhuǎn)化的相關(guān)基因在水稻中表達(dá)載體。（包括纖維素結(jié)合蛋白質(zhì)，纖維素

50、酶等基因）產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因植物，檢測(cè)轉(zhuǎn)入基因在水稻中的表達(dá)水平和生物化學(xué)活性。利用轉(zhuǎn)基因作物作為生物質(zhì)材料研究微生物產(chǎn)氫的轉(zhuǎn)化能力。并與非轉(zhuǎn)基因作物比較，研究轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)化成本的差異。繁殖轉(zhuǎn)基因水稻，獲得轉(zhuǎn)基因秸稈克隆產(chǎn)氫細(xì)菌Enterobacter aerogenes的乳酸脫氫酶（ldh）等基因及其側(cè)翼序列，以CAT為報(bào)告基因，構(gòu)建基因重組片段將含rec, rec, rec的ET重組系統(tǒng)轉(zhuǎn)入產(chǎn)氫細(xì)菌，構(gòu)建可重組產(chǎn)氫細(xì)菌。通過(guò)CAT抗性標(biāo)記，篩選重組的產(chǎn)氫細(xì)菌，通過(guò)系列PCR，鑒定ldh被剔除并且轉(zhuǎn)入Fe-hydrogenase的產(chǎn)氫細(xì)菌不同重組的產(chǎn)氫細(xì)菌株系的產(chǎn)氫效率檢測(cè)，篩選高產(chǎn)氫細(xì)菌電擊轉(zhuǎn)化3

51、.6、課題預(yù)期研究成果對(duì)相關(guān)技術(shù)發(fā)展的影響和應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景的預(yù)測(cè)（包括國(guó)內(nèi)外應(yīng)用或市場(chǎng)現(xiàn)狀、潛在用戶、市場(chǎng)前景，經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)作用等）我國(guó)的生物質(zhì)資源非常豐富，資源潛力折合7億噸標(biāo)煤左右，而目前實(shí)際使用量為2.2億噸標(biāo)煤左右，因此還有很大的開(kāi)發(fā)潛力。各種主要農(nóng)作物（稻桿、麥桿、玉米桿等）總量為7.05億噸，農(nóng)業(yè)加工廢棄物（稻殼、蔗渣等）約為0.84億噸，薪材及林業(yè)加工剩余物合理資源量為1.58億噸，人畜糞便生物質(zhì)資源總量為4.43億噸，城市生活垃圾污水中的有機(jī)物約0.56億噸。目前生物質(zhì)能主要作為一次能源在農(nóng)村被利用，約占農(nóng)村總能耗的70%，占發(fā)達(dá)地區(qū)總能耗的1535%。大部分生物質(zhì)被直接燃燒或廢棄，利用水平低，浪費(fèi)嚴(yán)重，并且污染環(huán)境，因此如何高效清潔地利用生物質(zhì)能成為我國(guó)經(jīng)濟(jì)社會(huì)可持續(xù)發(fā)展的迫切需求。利用農(nóng)村量大面廣的富含纖維素的秸稈等生物質(zhì)，以微生物發(fā)酵法制取氫氣新能源，其生產(chǎn)工藝高效清潔并且?guī)缀醪缓哪芰?，得到的氫氣產(chǎn)品具有廣闊的應(yīng)用前景，這樣除了能夠治理污染而具有良好的環(huán)保效益外，還能產(chǎn)生一定的經(jīng)濟(jì)效益，從而變廢為寶。通過(guò)本項(xiàng)目研究，在水稻等種子和植株莖桿中成功表達(dá)纖維素酶等高效降解酶的基因片段，獲得能夠在加熱到90左右環(huán)境中自身高效水解的轉(zhuǎn)基因秸桿，從而省掉成本高而且污染大的酸堿預(yù)