核酸擴(kuò)增檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)及工作流程

1、核酸擴(kuò)增檢測(cè)設(shè)計(jì)及工作流程臨床檢驗(yàn)中心Tel.: 2014.9.11-14 長沙問題？l 核酸檢測(cè)到底要分多少個(gè)區(qū)？l 緩沖間有何作用？l 使用什么樣的生物安全柜？l “無l 核酸檢測(cè)是什么？”或“無核酸”概念？最有效的“防污染措施”血液標(biāo)本的接收l 通常的工作流程：標(biāo)本血清分離編號(hào)保存或檢測(cè)四個(gè)測(cè)定區(qū)域之外的地方或區(qū)域內(nèi)接收l 接收的標(biāo)本應(yīng)收集在原始容器中l(wèi)l 在核酸提取時(shí)帶入至標(biāo)本區(qū)標(biāo)本的接收區(qū)的儀器設(shè)備要求l 如果在標(biāo)本接收區(qū)分離血清（漿）標(biāo)本，有1臺(tái)分離血清（漿）用離心機(jī)、1臺(tái)生物安全柜、1臺(tái)冰箱、加樣器及相應(yīng)經(jīng)高壓處理的消耗品如帶濾芯吸頭、標(biāo)本接收編號(hào)及記號(hào)筆等即可。本以l 如果不在

2、標(biāo)本接收區(qū)分離血清（漿）標(biāo)本，只是簡單的接收，則就不需要分離血清（漿）用離心機(jī)、生物安全柜、加樣器及其消耗品。設(shè)計(jì)A理想的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向 擴(kuò)增區(qū)空氣流向標(biāo)本區(qū)空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向設(shè)計(jì)B理想的核酸擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向 擴(kuò)增區(qū)空氣流向標(biāo)本區(qū)空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向核酸擴(kuò)增檢測(cè)設(shè)計(jì)的一般原則(1)在物理空間上，必須是完全相互的，各l 各區(qū)區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài); (2)不能有空氣的直接相通。l 注意風(fēng)向由清潔區(qū)域向污染區(qū)域l 因地制宜“十六字口訣”l 方便工作A門外走廊門B門門外走廊擴(kuò)增

3、及產(chǎn)物 分析區(qū)標(biāo)本區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)門門標(biāo)本區(qū)擴(kuò)增區(qū)門門產(chǎn)物分析區(qū)門試劑準(zhǔn)備區(qū)門標(biāo)本區(qū)空氣流向門擴(kuò) 增 及 產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)門門擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向其他試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向其他其他走廊走廊其他空氣流向標(biāo)本區(qū)其他其他其他標(biāo)本區(qū)空氣流向+門擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向空氣流向+試劑準(zhǔn)備區(qū)門門門擴(kuò)增和產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向+其他試 劑 準(zhǔn) 備區(qū)空氣流向其他其他空氣流向走廊走廊其他空氣流向+標(biāo) 本區(qū)其他其他其他產(chǎn)物分析區(qū)擴(kuò)增區(qū)標(biāo)本區(qū)試劑準(zhǔn)備區(qū)傳遞窗傳遞窗傳遞窗空氣流向空氣流向空氣流向 空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向核酸檢測(cè)設(shè)計(jì)“各區(qū)注意風(fēng)向因地制宜方便工作”應(yīng)根據(jù)空間大小。所采用的檢測(cè)

4、技術(shù)平臺(tái)和工作量來決定分區(qū)的多少及各區(qū)域的緩沖間的功能是“空氣的流向”。生物安全柜可考慮“A2”。產(chǎn)物分析區(qū)空氣流向擴(kuò)增區(qū)空氣流向標(biāo)本區(qū)空氣流向試劑準(zhǔn)備區(qū)空氣流向緩沖間緩沖間緩沖間走廊工作流向關(guān)于“區(qū)域”合并l 如使用擴(kuò)增和產(chǎn)物分析同時(shí)完成的實(shí)時(shí)熒光PCR儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)，擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析以合并。l 如使用核酸提取、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析等均在一臺(tái)儀器上完成的全自動(dòng)核酸檢測(cè)分析儀，標(biāo)本區(qū)、擴(kuò)增區(qū)和產(chǎn)物分析合并?！盁o”或“無核酸”概念的重要性！尊敬的您好！來信請(qǐng)教一個(gè)問題，具體情況是這樣的：我這兒使用的PCR儀是ABI 7300，用的是達(dá)安公司的HBV- DNA試劑，去年12月中旬的一次試：劉大夫：P

5、CR一旦出現(xiàn)嚴(yán)重污染，消除將會(huì)比較，通常可采用下述方法：（1）開窗;（2）采用次氯酸鈉溶液擦地面及實(shí)驗(yàn)臺(tái)驗(yàn)中發(fā)生了爆管，發(fā)生后， 處理，;（3）增長紫外面，甚至已經(jīng)按照SOP規(guī)程進(jìn)行了照射時(shí)間；（4）用75%乙醇空中噴霧，然后用于次氯酸鈉溶液擦地面及實(shí)驗(yàn)臺(tái)面。上述措施每天都要進(jìn)行，直至污染消除。不知你是否按上述方法進(jìn)行？如沒有，你可以這樣試，并請(qǐng)將效果告訴我。到現(xiàn)在已經(jīng)有半年了，可還是不能消除污染。PCR在三樓，現(xiàn)在即使加樣操作放在同一幢樓房的一，其余如混勻、離心等還放在原來的，擴(kuò)增也對(duì)照孔所加在原來的對(duì)照，標(biāo)本一樣處理（因此暴露在空氣中的時(shí)間很短），陰性對(duì)照有擴(kuò)增，大約在21個(gè)循此外，在出現(xiàn)

6、嚴(yán)重污對(duì)照顯示的Ct環(huán)的時(shí)候開始，染后，如還要進(jìn)行工作，則可臨時(shí)更換一個(gè)廠家試劑， 應(yīng)就可以。約為26左右。請(qǐng)問這是什么，怎么處理才能消除污染。盼指點(diǎn)！劉X2013050820130508尊敬的：您好！我是上次您好！您所說的措施我向您請(qǐng)教PCR污染都實(shí)行過，只不過除外，如何清除的小劉，我們按照您的指點(diǎn)進(jìn)行處理，現(xiàn)其余措施僅實(shí)施過很少幾次，我將按您所說措施處理一段時(shí)間再看看。另外，再請(qǐng)教兩個(gè)問題：（1）上述措施在污染已經(jīng)完全清除，非常感謝！以后我們會(huì)更加注意操作的規(guī)范及相關(guān)知識(shí)的學(xué)習(xí)！要在三個(gè)進(jìn)行嗎？（2）樓房第三層污染，在第一層操作怎么也會(huì)受到影響？您撥冗指教！劉X2013.7.1820130

7、508原來是在作怪2011年五大科學(xué)The Scientist符合基本要求的核酸擴(kuò)增檢測(cè)的條件（1）試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本區(qū)和擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等三l個(gè)或四個(gè)區(qū)域在物理空間上，必須是完全相互的，各區(qū)域無論是在空間還是在使用中，應(yīng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。（2）各區(qū)的可移動(dòng)的儀器設(shè)備及各種物品包括實(shí)驗(yàn)l本、記號(hào)筆、試管架及清潔用具等必須。（3）標(biāo)本區(qū)、擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)等相對(duì)有可能l出現(xiàn)“污染物”的區(qū)域安裝排風(fēng)扇或其它排風(fēng)和有效的裝置，以使空氣按試劑準(zhǔn)備區(qū)®標(biāo)本區(qū)®擴(kuò)增（及產(chǎn)物分析）區(qū)方向。核酸擴(kuò)增的工作流程試劑準(zhǔn)備區(qū)標(biāo)本區(qū)擴(kuò)增區(qū)及擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)試劑貯存準(zhǔn)備區(qū)l 核

8、酸擴(kuò)增中最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在，包括試劑中所帶的標(biāo)準(zhǔn)品和陽性對(duì)照。l 所有實(shí)驗(yàn)用潔凈物品如離心管、吸頭等的存放和準(zhǔn)備處。l 商品試劑盒： 75%乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）處理水、等可能需要自配試劑：一次較大量配制，然后分裝成小瓶保存，每次檢測(cè)時(shí)，取出一小瓶使用，未用完的即棄掉，不再使用。ll 儀器設(shè)備主樣器、天平、離心機(jī)和冰箱等，最好配備超凈工作臺(tái)。標(biāo)本區(qū)儀器設(shè)備主要有設(shè)備、核酸提取儀、生物安l全柜、加樣器、高速臺(tái)式（冷凍）離心機(jī)、加熱模塊或水浴箱、冰箱等。生物安全柜不應(yīng)放在實(shí)驗(yàn)室門口等易受對(duì)分體式空調(diào)。走動(dòng)影響的地方，也不應(yīng)直主要是用于血液樣本的加樣器吸頭必須帶濾芯。、核酸樣本的提取。ll使用加熱模塊時(shí)，如在模塊砂，然后將標(biāo)本管置于細(xì)砂中填入二氧化硅細(xì)，可得到較為l一致的溫度。擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)l 擴(kuò)增反應(yīng)體系的配制和提取核酸的加入，可在標(biāo)本區(qū)也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行，關(guān)鍵是要防止產(chǎn)物的污染。如果空間區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。的話，也可在一個(gè)的l 加樣時(shí)，先加提取的核酸模板樣本，每加完一個(gè)即標(biāo)本蓋子，然后加陽性質(zhì)控核酸模板，再就是質(zhì)控和僅含按樣本一樣稀釋的主反應(yīng)混合液的擴(kuò)增質(zhì)控，這樣做的目的是，最大可能地測(cè)出以前擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染。擴(kuò)增及產(chǎn)物分析區(qū)l 熱循環(huán)儀的電源應(yīng)