考馬斯亮藍法

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上實驗7 考馬斯亮藍G-250染色法測定蛋白質含量一、目的1、學習一種蛋白質染色測定的方法2、掌握考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的基本原理和方法二、原理蛋白質的存在影響酸堿滴定中所用某些指示劑的顏色變化，從而改變這些染料的光吸收。在些基礎上發(fā)展了蛋白質染色測定方法。涉及的指示劑有甲基橙、考馬斯亮藍、溴甲酚綠和溴甲酚紫。目前廣泛使用的染料是考馬斯亮藍?？捡R斯亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質通過范德華鍵結合后，變?yōu)樗{色，且在蛋白質一定濃度范圍內(nèi)符合比爾定律，可在595nm處比色測定。25分鐘即呈最大光吸收，至少穩(wěn)定1小時。在0.011.0 mg蛋白質/

2、ml范圍內(nèi)均可。該法操作簡便迅速，消耗樣品量少，但不同蛋白質之間差異大，且標準曲線線性差。高濃度的Tris、EDTA、尿素、甘油、蔗糖、丙酮、硫酸銨和去污劑時測定有干擾。緩沖液濃度過高時，改變測定液pH值會影響顯色?？捡R斯亮藍染色能力強，比色杯不洗干凈會影響光吸收值，不可用石英懷測定。三、材料、試劑與器具（一）試劑1、染色液：取考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加100ml 85%磷酸，加水稀釋至1升。該染色液可保存數(shù)月，若不加水可長期保存，用前稀釋。2、標準蛋白溶液：0.5mg/ml牛血清白蛋白。3、未知濃度的蛋白質溶液用酪蛋白配制，濃度控制在1030mg/ml（二

3、）器具1、試管及試管架2、移液管（1ml,5ml）3、可見光分光光度計四、操作步驟（一）標準曲線的制作1、取7支試管，按下表加入試劑 試管編號試劑(ml)01234561mg/ml牛血清蛋白00.10.20.40.60.81蒸餾水10.90.80.60.40.20考馬斯亮藍試劑5555555 2、將試管搖勻，放置20分鐘。 3、用分光光度計比色測定吸光值A595nm。 4、以A595nm為縱坐標，標準蛋白色質濃度為橫坐標，繪制標準曲線。（二）樣品的測定1、取一支試管，加入未知濃度的蛋白質溶液0.2ml，蒸餾水0.8ml考馬斯亮藍試劑5ml.2、將試管搖勻，放置20分鐘。3、比色測定吸光值A59

4、5nm，對照標準曲線求得蛋白質的濃度。五、注意事項1、由于染料本身的兩種顏色形式的光譜有重疊，試劑背景值會因與蛋白質結合的染料增加而不斷降低，因而當?shù)鞍踪|濃度較大時，標準曲線稍有彎曲，但直線彎曲程度很輕，不致影響測定2、測定工作應在蛋白質染料混合后2min開始，力爭1hr內(nèi)完成，否則會因蛋白質一染料復合物發(fā)生凝集沉淀而影響測定結果。六、實驗報告繪制標準曲線，并將實驗結果與其他蛋白質測定方法比較分析。七、思考題1、考馬斯亮藍法測定蛋白質的含量的原理是什么？2、考馬斯亮藍法有什么優(yōu)缺點？一、原理雙縮脲法（Biuret法）和Folin酚試劑法（Lowry法）的明顯缺點和許多限制，促使科學家們?nèi)ふ腋?/p>

5、好的蛋白質溶液測定的方法。由Bradford建立的考馬斯亮蘭法（Bradford法），是根據(jù)蛋白質與染料相結合的原理設計的，這種蛋白質測定法具有超過其他幾種方法的突出優(yōu)點，因而正在得到廣泛的應用。因此考馬斯亮藍法是目前靈敏度最高的蛋白質測定法。考馬斯亮藍G-250（Coomassie G-250）是一種藍色染料，在465nm處有最大吸收值。但考馬斯亮藍G-250能與蛋白質通過范得華相互作用形成的復合物是藍色溶液，使該染料的最大吸收max的位置從465變成了595，在595nm處有最大吸收值。蛋白質考馬斯亮藍復合物溶液顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比，因此利用溶液顏色的差異進行比色測定，適合于蛋白

6、質類的定量分析，尤其適合于稀有蛋白質的微量分析?？捡R斯亮藍G-250試劑呈色反應顏色穩(wěn)定、靈敏度高，最低測試蛋白質量在1ug左右。優(yōu)點：（1）靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍。（2）測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。染料與蛋白質結合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。注：測定時要在染色后5-20分鐘內(nèi)測定光吸收，不可太快，我之前就不小心吃了這個虧，弄得數(shù)據(jù)很不穩(wěn)定。（3）干擾物質少。如干擾Lowry法的K+、Na+、Mg2+離子、T

7、ris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。缺點：（1）由于各種蛋白質中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質測定時有較大的偏差，在制作曲線時通常選用 g球蛋白為標準蛋白質，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質干擾此法的測定，主要的干擾物質有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。（3）標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質的濃度。二、操作方法1.試劑（1）標準蛋白質溶液，用 g球蛋白或牛血清清蛋白

8、(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1mg/ml的標準蛋白質溶液。（2）考馬斯亮蘭G250染料試劑：稱100mg考馬斯亮蘭G250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀釋至1升。（顏色是褐紅色，不能用R-250，R-250的顏色是藍色的，要小心別弄錯哦）2. 標準曲線測定法注：樣品的添加量問題要注意一下，我之前看有的資料說加1ml,有的資料加0.1ml,我都給弄混了，現(xiàn)在終于弄明白，其實：樣品的添加量取決于你要測的蛋白的濃度，要濃度稀時，加1ml的量(即加樣品后，用水補充到1ml)；濃度較大或適中時，加0.1ml3.操作過程：（加至1ml的）分別取六只試管，

9、其中一只加入1.0ml蒸餾水做空白，5只分別加入不同體積的濃度為100ug/ml牛血清清蛋白標準液，補充水到1.0ml。然后每只試管加入5.0ml考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻放置5min，在紫外-可見分光光度計595nm處測定吸光值。以A595吸光值為縱坐標，牛血清清蛋白的ug數(shù)量為橫坐標繪制標準曲線。具體操作見下表。蛋白質標準曲線測定加樣試劑 空白 1 2 3 4 5100ug/ml牛血清清蛋白/ml 1.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8牛血清清蛋白/ug 0 10 20 40 60 80去離子水/ml 0 0.9 0.8 0.6 0.4 0.2考馬斯亮藍G-250試劑/ml 5

10、.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0吸光值A595 加至0.1ml的，基本過程同上，數(shù)據(jù)是上面的1/10：各試管的試劑添加量如下，試管編號0123456標準蛋白溶液（mL）00.010.020.030.040.050.060.15mol/L NaCl（mL）0.10.090.080.070.060.050.04考馬斯亮藍試劑（mL）5mL4. 測量蛋白樣品配制濃度約100ug/ml的待測蛋白質溶液。取一只試管加入1.0ml蒸餾水做空白，一支加入0.5ml待測蛋白質溶液，補充水到1.0ml。然后每支試管加入5.0ml考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻放置5min后，在紫外-可見分光光度計595nm處測定吸光值。用測得的吸光值從標準曲線上查得相當于牛血清清蛋白的ug數(shù)量，計算出待測蛋白質的含量。在標準蛋白質和蛋白質樣品的測定時，為了減小誤差，每一個濃度的蛋白質做3支平行管。3.試劑配置a.牛血清清蛋白標準液 結晶牛血清清蛋白或酪蛋白，預先經(jīng)微量凱氏定氮法標定該蛋白質的百分含量或者根據(jù)牛血清清蛋白的消