酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ ELISA ） 免疫標(biāo)記技術(shù)放射物標(biāo)記技術(shù)酶標(biāo)技術(shù)免疫熒光技術(shù)其他標(biāo)記技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)酶免疫組化技術(shù)雙抗體夾心法雙抗體夾心法競(jìng) 爭(zhēng) 法雙抗原夾心法間 接 法雙位一點(diǎn)法實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膐 掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的基本原理掌握酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)的基本原理o 了解利用雙抗體夾心法測(cè)定甲胎蛋白（了解利用雙抗體夾心法測(cè)定甲胎蛋白（AFPAFP）的方法的方法ELISA簡(jiǎn)介簡(jiǎn)介 1971年瑞典學(xué)者年瑞典學(xué)者 Engvall 和和Perlmann，荷蘭學(xué)者，荷蘭學(xué)者Van Weeman和和 Schuurs分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)分別報(bào)道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測(cè)體液中微量物質(zhì)

2、的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)體液中微量物質(zhì)的固相免疫測(cè)定方法，稱(chēng)為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA） ELISA原理原理o 使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 o 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性o 結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān) ELISA原理圖原理圖ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程o 包被：將已知抗原或抗體通過(guò)物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化o 抗原抗體反應(yīng)：先后加入被檢標(biāo)本和酶結(jié)

3、合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應(yīng)而被結(jié)合固定o 酶促反應(yīng)：在反應(yīng)體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應(yīng)而顯色ELISA基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程基本的實(shí)驗(yàn)過(guò)程實(shí)實(shí)驗(yàn)材料o AFPAFP診斷試劑盒診斷試劑盒o AFPAFP陽(yáng)性品，陰性對(duì)照品，待檢品陽(yáng)性品，陰性對(duì)照品，待檢品o 微量加樣器微量加樣器o 標(biāo)記筆標(biāo)記筆 實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟（示意圖）（示意圖）實(shí)驗(yàn)步驟實(shí)驗(yàn)步驟1. 將包被孔編號(hào)，分別加入陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照及待測(cè)樣品各100ul，37溫育30分鐘2. 各孔分別加入洗滌液2滴，搖勻，棄去，用蒸餾水或自來(lái)水加滿(mǎn)各孔甩掉，反復(fù)5次，然后在吸水紙上吸干（倒扣在吸水紙上）3. 在各孔內(nèi)加入酶結(jié)合物2滴，37

4、溫育15分鐘4. 重復(fù)步驟25. 各孔內(nèi)加入底物1滴，隨即加入顯色劑1滴，輕輕搖動(dòng)混勻，室溫避光反應(yīng)25min，觀察結(jié)果結(jié)果判定結(jié)果判定o 若待檢孔顯色淺于或等于陰性對(duì)照判定為陰性o 若待檢孔顯色深于或等于陽(yáng)性對(duì)照孔則判定為陽(yáng)性o 若待檢孔顯色介于陰性對(duì)照孔和陽(yáng)性對(duì)照孔之間則判定為弱陽(yáng)性臨床意義臨床意義o 可以用作原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查可以用作原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查 陰陰 性性: : 一般不考慮一般不考慮 弱陽(yáng)性弱陽(yáng)性: : 建議動(dòng)態(tài)觀察建議動(dòng)態(tài)觀察. . 陽(yáng)陽(yáng) 性性: : 結(jié)合病史、臨床癥狀及體癥結(jié)合病史、臨床癥狀及體癥等綜合判斷等綜合判斷o 可以用作檢測(cè)胎兒畸形和畸胎瘤可以用作檢測(cè)胎兒畸形

5、和畸胎瘤注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)o 加樣應(yīng)加在板孔的底部，避免產(chǎn)生氣泡并迅速完成o 洗滌必須徹底，防止產(chǎn)生假陽(yáng)性o 溫浴的時(shí)間要嚴(yán)格控制一、原理一、原理 CFT是根據(jù)任何抗原抗體復(fù)合物可激活、固定補(bǔ)體的特性，用一定量的補(bǔ)體與致敏紅細(xì)胞來(lái)檢測(cè)抗原、抗體間有無(wú)特異性結(jié)合的一類(lèi)實(shí)驗(yàn)。 1、參與本實(shí)驗(yàn)的成分包括、參與本實(shí)驗(yàn)的成分包括 已知抗原（或抗體） 待檢抗體（或抗原） SRBC SRBC相應(yīng)的溶血素 補(bǔ)體 2、參與本實(shí)驗(yàn)的五種成分分為兩個(gè)系統(tǒng)、參與本實(shí)驗(yàn)的五種成分分為兩個(gè)系統(tǒng) 待檢系統(tǒng)待檢系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）和待檢 抗體（或抗原） 指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)： SRBC和SRBC相應(yīng)溶血素雙方不對(duì)應(yīng)（或缺少一方

6、）不形成IC 不能激活并固定補(bǔ)體 加入SRBC和溶血素 出現(xiàn)溶血雙方相對(duì)應(yīng)形成IC 激活并固定補(bǔ)體 加入SRBC和溶血素 不出現(xiàn)溶血 二、材料二、材料 Ag：1:10稀釋的傷寒桿菌 1:10稀釋的痢疾桿菌 Ab: 1:10稀釋的傷寒診斷血清 補(bǔ)體補(bǔ)體 2%SRBC 溶血素溶血素 三、操作方法三、操作方法 加樣加樣(如下圖如下圖),37度水浴箱度水浴箱15分鐘（標(biāo)記為無(wú)）分鐘（標(biāo)記為無(wú)）試管號(hào)傷寒血清傷寒血清傷寒桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌痢疾桿菌補(bǔ)體補(bǔ)體NS10.2ml0.2ml*0.2ml*20.2ml*0.2ml0.2ml*30.2ml*0.2ml0.2ml4*0.2ml*0.2ml0.2ml5*0.2ml0.4ml6*0.6ml各管中加SRBC0.2ml、溶血素0.2ml,37