酶聯(lián)免疫吸附實驗

1、酶聯(lián)免疫吸附實驗酶聯(lián)免疫吸附實驗（ ELISA ） 免疫標記技術放射物標記技術酶標技術免疫熒光技術其他標記技術酶聯(lián)免疫吸附技術酶免疫組化技術雙抗體夾心法雙抗體夾心法競 爭 法雙抗原夾心法間 接 法雙位一點法實驗目的實驗目的o 掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本原理掌握酶聯(lián)免疫吸附實驗的基本原理o 了解利用雙抗體夾心法測定甲胎蛋白（了解利用雙抗體夾心法測定甲胎蛋白（AFPAFP）的方法的方法ELISA簡介簡介 1971年瑞典學者年瑞典學者 Engvall 和和Perlmann，荷蘭學者，荷蘭學者Van Weeman和和 Schuurs分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測分別報道將免疫技術發(fā)展為檢測體液中微量物質

2、的固相免疫測定方法，稱體液中微量物質的固相免疫測定方法，稱為酶聯(lián)免疫吸附實驗（為酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA） ELISA原理原理o 使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性 o 使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性o 結合在固相載體上的酶量與標本中受檢物質的量成一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關 ELISA原理圖原理圖ELISA基本的實驗過程基本的實驗過程o 包被：將已知抗原或抗體通過物理吸附到固相載體表面，使抗原或抗體固相化o 抗原抗體反應：先后加入被檢標本和酶結

3、合物，使之與固相抗原或抗體發(fā)生免疫反應而被結合固定o 酶促反應：在反應體系中加入酶作用的底物，使發(fā)生酶促反應而顯色ELISA基本的實驗過程基本的實驗過程實實驗材料o AFPAFP診斷試劑盒診斷試劑盒o AFPAFP陽性品，陰性對照品，待檢品陽性品，陰性對照品，待檢品o 微量加樣器微量加樣器o 標記筆標記筆 實驗步驟實驗步驟（示意圖）（示意圖）實驗步驟實驗步驟1. 將包被孔編號，分別加入陽性對照、陰性對照及待測樣品各100ul，37溫育30分鐘2. 各孔分別加入洗滌液2滴，搖勻，棄去，用蒸餾水或自來水加滿各孔甩掉，反復5次，然后在吸水紙上吸干（倒扣在吸水紙上）3. 在各孔內加入酶結合物2滴，37

4、溫育15分鐘4. 重復步驟25. 各孔內加入底物1滴，隨即加入顯色劑1滴，輕輕搖動混勻，室溫避光反應25min，觀察結果結果判定結果判定o 若待檢孔顯色淺于或等于陰性對照判定為陰性o 若待檢孔顯色深于或等于陽性對照孔則判定為陽性o 若待檢孔顯色介于陰性對照孔和陽性對照孔之間則判定為弱陽性臨床意義臨床意義o 可以用作原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查可以用作原發(fā)性肝癌的大規(guī)模普查 陰陰 性性: : 一般不考慮一般不考慮 弱陽性弱陽性: : 建議動態(tài)觀察建議動態(tài)觀察. . 陽陽 性性: : 結合病史、臨床癥狀及體癥結合病史、臨床癥狀及體癥等綜合判斷等綜合判斷o 可以用作檢測胎兒畸形和畸胎瘤可以用作檢測胎兒畸形

5、和畸胎瘤注意事項注意事項o 加樣應加在板孔的底部，避免產生氣泡并迅速完成o 洗滌必須徹底，防止產生假陽性o 溫浴的時間要嚴格控制一、原理一、原理 CFT是根據任何抗原抗體復合物可激活、固定補體的特性，用一定量的補體與致敏紅細胞來檢測抗原、抗體間有無特異性結合的一類實驗。 1、參與本實驗的成分包括、參與本實驗的成分包括 已知抗原（或抗體） 待檢抗體（或抗原） SRBC SRBC相應的溶血素 補體 2、參與本實驗的五種成分分為兩個系統(tǒng)、參與本實驗的五種成分分為兩個系統(tǒng) 待檢系統(tǒng)待檢系統(tǒng)：已知抗原（或抗體）和待檢 抗體（或抗原） 指示系統(tǒng)指示系統(tǒng)： SRBC和SRBC相應溶血素雙方不對應（或缺少一方

6、）不形成IC 不能激活并固定補體 加入SRBC和溶血素 出現(xiàn)溶血雙方相對應形成IC 激活并固定補體 加入SRBC和溶血素 不出現(xiàn)溶血 二、材料二、材料 Ag：1:10稀釋的傷寒桿菌 1:10稀釋的痢疾桿菌 Ab: 1:10稀釋的傷寒診斷血清 補體補體 2%SRBC 溶血素溶血素 三、操作方法三、操作方法 加樣加樣(如下圖如下圖),37度水浴箱度水浴箱15分鐘（標記為無）分鐘（標記為無）試管號傷寒血清傷寒血清傷寒桿菌傷寒桿菌痢疾桿菌痢疾桿菌補體補體NS10.2ml0.2ml*0.2ml*20.2ml*0.2ml0.2ml*30.2ml*0.2ml0.2ml4*0.2ml*0.2ml0.2ml5*0.2ml0.4ml6*0.6ml各管中加SRBC0.2ml、溶血素0.2ml,37