蛋白質分子基礎4蛋白質制備 ppt課件

1、蛋白質的電泳電泳分別的原理電泳分別的原理: 蛋白質是兩性電解質蛋白質是兩性電解質,在一定的在一定的pH下下,可以可以解離為帶電荷的離子。在電場中可以電泳挪解離為帶電荷的離子。在電場中可以電泳挪動。動。電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的電泳遷移率：帶電顆粒在溶液中遷移速度的快慢，用電泳遷移率快慢，用電泳遷移率(M)表示：表示： M為遷移率；為遷移率；dL為顆粒挪動的間隔；為顆粒挪動的間隔；L為為通電的時間。通電的時間。E為兩個電極之間的電勢差。為兩個電極之間的電勢差。M=EtdL蛋白質分子的性質。蛋白質分子的性質。 分子的電荷、大小和外形。分子的電荷、大小和外形。電場電場 與電流和電壓成正比

2、。與電流和電壓成正比。緩沖液和離子強度緩沖液和離子強度 緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降緩沖液離子強度增大，樣品所帶電荷降低，樣品的泳動速度會減緩。低，樣品的泳動速度會減緩。支持介質支持介質 紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作紙的吸附作用最大，醋酸纖維素吸附作用較小。用較小。自在界面電泳自在界面電泳運用支持物的區(qū)帶電泳。運用支持物的區(qū)帶電泳。 區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質上加一個點或區(qū)帶電泳是在半固相或膠狀介質上加一個點或一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質一薄層樣品溶液，然后加電場，分子在支持介質上或支持介質中遷移。支持介質的作用主要是為上或支持介質中遷移。支持介質的作用主要是為了防

3、止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液了防止機械干擾和由于溫度變化以及大分子溶液的高密度而產生的對流。的高密度而產生的對流。 區(qū)帶電泳運用不同的支持介質，早期有濾紙、區(qū)帶電泳運用不同的支持介質，早期有濾紙、玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯玻璃珠、淀粉粒、纖維素粉、海砂、海綿、聚氯乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖乙烯樹脂；以后有淀粉凝膠、瓊脂凝膠、醋酸纖維素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺維素膜，如今那么多用聚丙烯酰胺PAGE和和瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠。SDS-PAGE凝膠等電聚焦凝膠等電聚焦在蛋白質中參與摩爾比為在蛋白質中參與摩爾比為1.4：1(SDS:蛋白質蛋白質)的的SDS(

4、十二烷基硫酸鈉十二烷基硫酸鈉)。使一切蛋白質都帶上負。使一切蛋白質都帶上負電。電。SDS是陰離子去污劑，能與蛋白質的疏水部分結是陰離子去污劑，能與蛋白質的疏水部分結合，并且把大部分蛋白質拆成組成他的亞基方式。合，并且把大部分蛋白質拆成組成他的亞基方式。在上樣緩沖液中參與巰基乙醇，可以使二硫鍵復在上樣緩沖液中參與巰基乙醇，可以使二硫鍵復原為巰基。使不同的蛋白質分子的短軸一致，長原為巰基。使不同的蛋白質分子的短軸一致，長軸與蛋白質的分子量成正比。軸與蛋白質的分子量成正比。SDS-PAG中，蛋白質電泳的速度不再取決于蛋中，蛋白質電泳的速度不再取決于蛋白質的電荷與外形，只與蛋白質的分子量有關。白質的電

5、荷與外形，只與蛋白質的分子量有關。當分子量在當分子量在15KD15KD到到200KD200KD之間時，蛋白之間時，蛋白質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，質的遷移率和分子量的對數呈線性關系，符合下式：符合下式：logM=K-bXlogM=K-bX M M為分子量，為分子量，X X為遷移率，為遷移率，k k、b b均為常均為常數，假設將知分子量的規(guī)范蛋白質的遷移數，假設將知分子量的規(guī)范蛋白質的遷移率對分子量對數作圖，可獲得一條規(guī)范曲率對分子量對數作圖，可獲得一條規(guī)范曲線，未知蛋白質在一樣條件下進展電泳，線，未知蛋白質在一樣條件下進展電泳，根據它的電泳遷移率即可在規(guī)范曲線上求根據它的電泳遷移率即可

6、在規(guī)范曲線上求得分子量。得分子量。繪制規(guī)范曲線：繪制規(guī)范曲線： 按下式計算相對遷移率：按下式計算相對遷移率： 以每個蛋白規(guī)范的分子量對數對它的相對遷移以每個蛋白規(guī)范的分子量對數對它的相對遷移率作圖得規(guī)范曲線，量出未知蛋白的遷移率即可率作圖得規(guī)范曲線，量出未知蛋白的遷移率即可測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠測出其分于量，這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性。上的樣品的分子量測定才具有可靠性。= 蛋白樣品距加樣端遷移距離（cm）溴酚藍區(qū)帶中心距加樣端距離（cm） 相對遷移率PAGEPAGE根據其有無濃縮效應，分為延續(xù)系統(tǒng)和不根據其有無濃縮效應，分為延續(xù)系統(tǒng)和不延續(xù)

7、系統(tǒng)兩大類，延續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液延續(xù)系統(tǒng)兩大類，延續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度一樣，帶電顆粒在電場作用下，值及凝膠濃度一樣，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應。主要靠電荷和分子篩效應。不延續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，不延續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pHpH，凝膠，凝膠濃度及電位梯度的不延續(xù)性，帶電顆粒在電場中濃度及電位梯度的不延續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因此其分別條帶明晰度及分辨率均較前者效應，因此其分別條帶明晰度及分辨率均較前者佳。佳。 分離膠分離膠(10%.5ml) 濃縮膠濃縮

8、膠(5%.3ml) H2O 2.6ml 0.7ml 30%Acr 1.7ml 1.5ml Buffer 3.0mol/L pH=8.8 Tris-HCl 0.6ml 0.5mol/L pH=6.8 Tris-HCl 0.75ml 10%SDS 0.05ml 0.03ml 10%Ap 0.05ml 0.03ml TEMED 5l 4l 不延續(xù)不延續(xù)SDS-PAGE各部分凝膠配制各部分凝膠配制電泳槽中參與緩沖液，接通電源，進展電泳，開場電流恒電泳槽中參與緩沖液，接通電源，進展電泳，開場電流恒定在定在10mA，當進入分別膠后改為，當進入分別膠后改為20mA，溴酚藍距凝膠，溴酚藍距凝膠邊緣約邊緣約5m

9、m時，停頓電泳。時，停頓電泳。Figure 6.2.4 SDS-PAGE results of fraction S1 (SRA)制備凝膠時，制備凝膠時，TEMED要加膠之前再加。要加膠之前再加。電泳之前蛋白質要溶解在含電泳之前蛋白質要溶解在含1%的的SDS和和1%的巰的巰基乙醇的磷酸緩沖液基乙醇的磷酸緩沖液(0.01 mol/L, pH 7.2),1000C加熱加熱25分鐘。分鐘。如凝膠中含有雜質，可以在參與樣品前先預電泳如凝膠中含有雜質，可以在參與樣品前先預電泳0.51小時。小時。SDS與蛋白質分子結合后，蛋白質分子的構象發(fā)與蛋白質分子結合后，蛋白質分子的構象發(fā)生變化，解離為亞單位，電泳結

10、果顯示的只是亞生變化，解離為亞單位，電泳結果顯示的只是亞單位的大小，同時蛋白質也會失去原來的活性。單位的大小，同時蛋白質也會失去原來的活性。已發(fā)現有些蛋白質不能用已發(fā)現有些蛋白質不能用SDS-PAGE測定分子量。測定分子量。如電荷異常或構象異常的蛋白質，帶有較大輔基如電荷異?；驑嬒螽惓５牡鞍踪|，帶有較大輔基的蛋白質某些糖蛋白以及一些構造蛋白，如的蛋白質某些糖蛋白以及一些構造蛋白，如膠原蛋白等。膠原蛋白等。 蛋白質是帶有電荷的兩性生物大分子，其正負電荷的數量隨所處環(huán)境酸堿度的變化而變化 。在電場存在下的一定pH溶液中，帶正電的蛋白分子將向負極挪動而帶負電的蛋白分子將向正極挪動，在某一pH時，蛋白

11、分子在電場中不再挪動，此時的pH值即為該蛋白質的等電點。 等電聚焦(IEF電泳就是在凝膠中參與兩性電解質從而構成從正極到負極pH逐漸添加的pH梯度，處在其中的蛋白分子在電場的作用下運動，最后各自停留在其等電點的位置上，測出蛋白分子聚焦位置的pH值，便可以得到它的等電點。根據要分別的蛋白質的根據要分別的蛋白質的pI的不同，訂購不同的不同，訂購不同pH梯度的凝膠，可以對蛋白質樣品進展分別。梯度的凝膠，可以對蛋白質樣品進展分別。 如如3.59.5、2.56.0、5.08.5、7.510等。等。凝膠的凝膠的pH值范圍越窄，分辨力越高?？煞謩e等值范圍越窄，分辨力越高?？煞謩e等電點相差電點相差0.01個個

12、pH單位的蛋白質，最高可以分單位的蛋白質，最高可以分辨辨0.0025個個pH單位的蛋白質。單位的蛋白質。等電凝膠可以抵消分散作用，蛋白質可以富集在等電凝膠可以抵消分散作用，蛋白質可以富集在很窄的區(qū)帶上。很窄的區(qū)帶上。適用于少量蛋白質樣品的分析鑒定，不適用于大適用于少量蛋白質樣品的分析鑒定，不適用于大量制備。量制備。要求用無鹽的溶液，而蛋白質在無鹽溶液中容易要求用無鹽的溶液，而蛋白質在無鹽溶液中容易沉淀；在等電點發(fā)生沉淀和變性的蛋白質也不適沉淀；在等電點發(fā)生沉淀和變性的蛋白質也不適宜用次方法分別。宜用次方法分別?？梢杂萌旧ú炜吹鞍踪|，然后用外表電可以用染色法察看蛋白質，然后用外表電極直接丈量極

13、直接丈量pH值。值?；驅⒛z切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝或將凝膠切成小塊，加蒸餾水，再搗碎凝膠塊并且丈量膠塊并且丈量pH。雙向電泳雙向電泳:由第一向等電聚焦由第一向等電聚焦(IEF)電泳和第二向電泳和第二向SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)組成，組成，第一向使等電點不同的蛋白得到分別，第二向使第一向使等電點不同的蛋白得到分別，第二向使分子量不同的蛋白得到分別，兩向結合便得到高分子量不同的蛋白得到分別，兩向結合便得到高分辨率的蛋白圖譜。分辨率的蛋白圖譜。1975年，年，OFarrell首先運用雙向電泳技術將大首先運用雙向電泳技術將大腸桿菌總蛋白分別出腸桿菌總蛋白分別

14、出1100多個蛋白點。后來此多個蛋白點。后來此技術不斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。技術不斷用于原核生物和真核生物總蛋白的分別。目前，隨著蛋白質組學的開展，雙向電泳技術越目前，隨著蛋白質組學的開展，雙向電泳技術越來越廣泛的用于發(fā)現未知蛋白。來越廣泛的用于發(fā)現未知蛋白?？捡R斯亮藍染色法考馬斯亮藍染色法 可檢出可檢出0.31ug的蛋白質。的蛋白質。銀染色法銀染色法 銀離子與蛋白質以鹽或配價絡鹽的方式結合，銀離子與蛋白質以鹽或配價絡鹽的方式結合，用甲醛將銀離子復原為可見的銀顆粒。可檢測用甲醛將銀離子復原為可見的銀顆粒?？蓹z測ng程度的蛋白質。程度的蛋白質。熒光染色技術熒光染色技術 熒光合成物質

15、與熒光合成物質與PAGE上的蛋白質發(fā)生反響，上的蛋白質發(fā)生反響，發(fā)出劇烈的熒光，可檢測到發(fā)出劇烈的熒光，可檢測到PAGE中的蛋白質。中的蛋白質。蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進展檢測。對蛋白質轉移到膜上，然后利用抗體進展檢測。對知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進展檢測，知表達蛋白，可用相應抗體作為一抗進展檢測，對新基因的表達產物，可經過交融部分的抗體檢對新基因的表達產物，可經過交融部分的抗體檢測。測。采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質，質，“探針是抗體，探針是抗體，“顯色用標志的二抗。顯色用標志的二抗。詳細操作為經過詳細操作為經過PAGE分別

16、的蛋白質樣品，轉移分別的蛋白質樣品，轉移到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上，固相載到固相載體例如硝酸纖維素薄膜上，固相載體以非共價鍵方式吸附蛋白質。以固相載體上的體以非共價鍵方式吸附蛋白質。以固相載體上的蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反蛋白質或多肽作為抗原，與對應的抗體起免疫反響，再與酶或同位素標志的第二抗體起反響，經響，再與酶或同位素標志的第二抗體起反響，經過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分別的特異過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分別的特異性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛運用性目的基因表達的蛋白成分。該技術也廣泛運用于檢測蛋白程度的表達。于檢測蛋白程度的表達。抗原包被的實驗膜條抗

17、原包被的實驗膜條 特異性人抗體特異性人抗體標志的二抗標志的二抗標志標志蛋白質的結晶蛋白質的結晶可以作為蛋白質提純的方法之一。蛋白質可以作為蛋白質提純的方法之一。蛋白質純度到達一定值時可以結晶。經過反復重純度到達一定值時可以結晶。經過反復重結晶可以除去其中的雜質，使蛋白質得到結晶可以除去其中的雜質，使蛋白質得到更大程度的純化。更大程度的純化。蛋白質結晶體是比較穩(wěn)定的構造，所以結蛋白質結晶體是比較穩(wěn)定的構造，所以結晶可以作為一個穩(wěn)定的儲存的方法。晶可以作為一個穩(wěn)定的儲存的方法。在蛋白質結晶之后，可以提供作在蛋白質結晶之后，可以提供作X射線衍射線衍射分析用的資料，來分析蛋白質的構造等射分析用的資料，

18、來分析蛋白質的構造等數據。數據。蛋白質溶液在適宜的過飽和形狀，溶質分子經過分散、旋轉、碰撞等運動方式，可以構成晶核。溶質分子以相互碰撞的作用方式有序而反復地堆砌在晶核上，直到晶核生長到晶體，最后從溶液中析出。蛋白質純度越高，結晶越容易，至少要在蛋白質純度越高，結晶越容易，至少要在50%以以上。上。蛋白質濃度。濃度越高，結晶時機越大。但過大蛋白質濃度。濃度越高，結晶時機越大。但過大會因雜質存在而導致晶形不好。普通結晶的蛋白會因雜質存在而導致晶形不好。普通結晶的蛋白質濃度在質濃度在1050 mg/mL。溫度。蛋白質結晶溫度在溫度。蛋白質結晶溫度在0400C。普通在。普通在40C冷室或冷室或250C

19、溫箱中進展。溫箱中進展。pH。普通在蛋白質的等電點的。普通在蛋白質的等電點的pH附近結晶。附近結晶。金屬離子和離子強度。一些二價離子可以引起或金屬離子和離子強度。一些二價離子可以引起或有利于蛋白質的結晶過程。有利于蛋白質的結晶過程。沉淀劑。沉淀劑沉淀劑。沉淀劑(如鹽類和各種有機溶劑如鹽類和各種有機溶劑)可改動可改動蛋白質的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇蛋白質的溶解度。理想的沉淀劑有：聚乙二醇(PEG)和和2-甲基甲基-2，4-戊二醇戊二醇(MPD)。鹽析法鹽析法 在蛋白質溶液中參與鹽，使蛋白質溶解度降低，在蛋白質溶液中參與鹽，使蛋白質溶解度降低，之后以結晶方式從溶液中析出。之后以結晶方式從溶

20、液中析出。有機溶劑法有機溶劑法 有機溶劑可以使蛋白質介電常數降低，導致蛋有機溶劑可以使蛋白質介電常數降低，導致蛋白質結晶析出。白質結晶析出。等電點結晶。等電點結晶。 蛋白質在等電點時溶解度最小，可以構成結晶。蛋白質在等電點時溶解度最小，可以構成結晶。脫鹽結晶。脫鹽結晶。 一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶一些球蛋白溶于鹽而幾乎不溶于水，可將溶于鹽溶液的蛋白質結晶而出，然后透析除鹽。于鹽溶液的蛋白質結晶而出，然后透析除鹽。溫差除鹽。適用于一些對溫度敏感的蛋白質，不溫差除鹽。適用于一些對溫度敏感的蛋白質，不同溫度溶解度變化大?？蛇\用此法。同溫度溶解度變化大?？蛇\用此法。金屬離子。在某些蛋白質溶

21、液中參與金屬離子，金屬離子。在某些蛋白質溶液中參與金屬離子，可以促進晶體的構成?？梢源龠M晶體的構成。蛋白質提純過程中的定量蛋白質提純過程中的定量定氮法丈量蛋白質含量定氮法丈量蛋白質含量蛋白質含量克蛋白質含量克% =每克生物樣品中含氮的克數每克生物樣品中含氮的克數 6.25雙縮脲法雙縮脲法 第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法。 雙縮脲試劑的成分是質量濃度為雙縮脲試劑的成分是質量濃度為0.1 g/mL的的氫氧化鈉溶液和質量濃度為氫氧化鈉溶液和質量濃度為0.01 g/mL的硫酸的硫酸銅溶液。在堿性溶液銅溶液。在堿性溶液(NaOH)中中,雙縮脲雙縮脲(H2NOCNH

22、CONH2)能與能與Cu2+作用作用,構成構成紫色或紫紅色的絡合物紫色或紫紅色的絡合物,這個反響叫做雙縮脲這個反響叫做雙縮脲反響。反響。 由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲構造類由于蛋白質分子中含有很多與雙縮脲構造類似的肽鍵似的肽鍵,因此因此,含兩個或亮個以上的肽鍵化合含兩個或亮個以上的肽鍵化合物尤其是蛋白質都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反物尤其是蛋白質都可與雙縮脲試劑發(fā)生顏色反響。響。福林福林- -酚試劑法：酚試劑法： 在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試在堿性條件下磷鉬酸、磷鎢酸混合試劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反響，生成藍色劑與酪氨酸上的酚發(fā)生反響，生成藍色化合物，在化合物，在600 nm 600 nm 下

23、測光吸收。可根據下測光吸收?？筛鶕y得的規(guī)范曲線計算出蛋白質的含量。測得的規(guī)范曲線計算出蛋白質的含量。靈敏度較高，可達靈敏度較高，可達2525g-250 g-250 g/mlg/ml。靈敏度比靈敏度比280 nm 280 nm 處的紫外吸收法靈敏處的紫外吸收法靈敏1010倍，比雙縮脲法靈敏倍，比雙縮脲法靈敏100100倍。倍。 紫外吸收法紫外吸收法A.280nmA.280nm光吸收法光吸收法 根據得到的根據得到的280 nm280 nm的光吸收值與蛋白的光吸收值與蛋白質的濃度正比，可以丈量蛋白質溶液中質的濃度正比，可以丈量蛋白質溶液中的濃度。的濃度。B.280nmB.280nm和和260nm260nm的吸收差法的吸收差法 用用280nm280nm下的紫外吸收減去下的紫外吸收減去260nm260nm下的下的紫外吸收，可以排除紫外吸收，可以排除260nm260nm下由于核酸吸下由于核酸吸光帶來的干擾。光帶來的干擾。蛋白質濃度蛋白質濃度(mg/mL)=1.45(mg/mL)=1.45* *A280nm-A280nm-0.740.74* *A260nmA26