厭氧菌的培養(yǎng)方法

1、厭氧菌的培養(yǎng)方法厭氧菌的培養(yǎng)方法 祁紅兵n物理方法包括遮斷空氣法、煮沸法、真空法、空氣置換法、氣體噴射法或轉管法等n化學方法包括焦性沒食子酸法、鐵絲絨法、保險粉法等 n生物學方法包括與需氧菌共生好氧法、燕麥發(fā)芽法等 n混合法包括厭氧罐（袋）法、厭氧手套箱法或厭氧室法、空氣置換鐵絲絨法、空氣置換鈀粒法等。 1 液體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法液體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法n培養(yǎng)基煮沸：驅氣后置流水中急速冷卻 n添加還原劑： 0.030.05L-鹽酸半胱氨酸 0.010.02硫乙醇鈉 0.51葡萄糖 0.1抗壞血酸 其它還原劑 n添加瓊脂 2 固體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法固體培養(yǎng)基的厭氧培養(yǎng)法n厭氧罐法 n簡易厭氧罐和厭

2、氧袋法 n鋼絲絨法 n焦性沒食子酸法n抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法 n生物好氧厭氧培養(yǎng)法 n轉管技術和氣體噴射培養(yǎng)法 n厭氧手套箱法 （又稱厭氧室法） 2.1 Gas-pak法 原理氣體發(fā)生袋： 檸檬酸和碳酸氫鈉 H2O CO2 硼氫化鈉 H2O H2 觸媒 ： 鈀粒 H2O 厭氧罐中的O2 厭氧指示劑 11111 厭氧指示劑 n亞甲基蘭 指示劑n盧卡斯固體厭氧指示劑 n布魯氏指示劑 亞甲基蘭 指示劑n6葡萄糖水溶液 2n0.1N氫氧化鈉水溶液 0.1n0.05亞甲基蘭水溶液 0.2 厭氧 無色 殘存有氧氣 藍色 盧卡斯固體厭氧指示劑 n2硼砂溶液 5毫升n9硫乙醇酸 1毫升n酚紅溶液 0.10.2毫升

3、n0.02美蘭溶液 10毫升n瓊脂 1 厭氧 無色 殘存有氧氣 藍色 布魯氏指示劑 n60羥甲基氨基甲酯 1n4葡萄糖 1n0.02美藍 1 厭氧 無色 殘存有氧氣 藍色Gas-Pak罐的使用操作程序 n平皿培養(yǎng)基裝入平皿架中置厭氧罐內；n打開內蓋居中金屬網袋，裝入觸媒鈀粒；n打開錫箔紙袋，取出厭氧指示劑片；n剪開氣體發(fā)生袋一角，注入10毫升水，迅速緊閉罐蓋，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。n約經510分鐘后，放入厭氧指示劑片。2.2.1 簡易厭氧罐 干燥器容內徑（厘米） 容器1 容器2 容器3 容積（毫升） 硼氫鈉 氯化鈷 0.2克 檸檬酸0.6克 15cm（約2150毫升） 或 和 0.6克 鈀粒1.5克

4、 碳酸氫鈉0.7克18cm（約3500毫升） 硼氫鈉 氯化鈷0.33克 檸檬酸1克 或 和 1克 鈀粒2克 碳酸氫鈉1.15克2.2.2 厭氧袋法 聚碳酸酯（復合塑料膜）制厭氧袋 n產氣袋n厭氧指示劑n觸媒 2.2.3 保險粉的厭氧罐培養(yǎng)法 n二亞硫酸鈉（Na2S2O4） 碳酸氫鈉 無水硫酸鈉 n不用觸媒2.3 鋼絲絨法 酸性硫酸銅溶液 鋼(鐵)絲絨 銅和鐵的絡合物 O2 厭氧指示劑 n酸性硫酸銅溶液： 將自來水1升加硫酸銅60g，吐溫-80 20ml，加熱溶解后，又加入2N的硫酸90ml，最后加水至6升 ；n方法： 取56g鋼絲絨/ L，于11.5升酸性硫酸銅溶液浸泡3060s，鋼絲絨變成紅

5、銅色，擠凈液體置鋁質或玻璃容器中，放入厭氧罐內。隨后將厭氧指示劑放入，密封厭氧罐，14h后可達厭氧狀態(tài) 2.4 焦性沒食子酸法 焦性末食子酸粉末，NaHCO3或NaOH溶液 無菌玻片 已接種細菌的平板倒扣在上面 融化的白蠟封邊2.5 抽氣換氣厭氧培養(yǎng)法 n玻璃干燥罐 n混合氣鋼瓶: 10二氧化碳、10的氫氣、80的氮氣 n三通閥n觸媒:鈀粒 / 浸泡鋼絲絨 / 氯化鈷 n厭氧指示劑1：厭氧培養(yǎng)罐 2：混合氣體（CO2：H2：N2=1：1：8）鋼瓶3：壓力表 4：三通閥 5：緩沖瓶 6：真空泵2.6 生物好氧厭氧培養(yǎng)法 n皰肉培養(yǎng)基: 牛肉渣 0.5g 牛肉浸液 7ml 液面上加蓋34mm厚的融

6、化凡士林，滅菌。n生物好氧厭氧培養(yǎng)方法 2.7 轉管技術和氣體噴射培養(yǎng)法 360鋼瓶進氣 銅柱 除氧氣體 （亮黃色）微量O2 H2源 CuO （黑色） 接種或移植2.8厭氧手套箱法n又稱厭氧室法3 厭氧培養(yǎng)方法的選擇厭氧培養(yǎng)方法的選擇n亨格特的預還原滅菌厭氧培養(yǎng)基的轉管技術、氣體噴射培養(yǎng)法 n厭氧手套箱培養(yǎng)法 用于要求嚴格的厭氧培養(yǎng)法的微生態(tài)學（正常菌群）的研究工作 n厭氧罐(袋)法結合其它厭氧培養(yǎng)方法 不適用于對氧極其敏感的厭氧菌。但是在臨床細菌的檢驗工作中，可以充分使用此法分離感染癥中的厭氧病原菌。 4 厭氧菌的保存厭氧菌的保存4.1繼代保存： 以GAM半固體流動培養(yǎng)基和TEP半固體培養(yǎng)基作傳代培養(yǎng)保存。用毛細吸管吸菌進行繼代培養(yǎng)，使用白金接種環(huán)移菌接種，可以避免有的菌在操作中接觸空氣或氧化物而死亡。數周作一次繼代培養(yǎng)。新分離的的菌種，在幾個月內，每34星期傳代一次。被保存的菌種，放室溫下暗處。最好是不同菌用不同培養(yǎng)基保存。 4.2 冷凍保存： 20脫脂牛奶0.5ml分注在帶螺旋塞的玻璃瓶中，經110、15分鐘高壓滅菌，冷卻后，先用毛細吸管取半固體高層培養(yǎng)基2448h生長茂盛部位的厭氧菌液0.5ml，加入玻璃瓶中，直接置于80冰庫中保存。 厭氧菌較理想的保存方法是液氮保存法。厭氧菌較理想的保存方法是液氮保存法。將將10