醫(yī)學(xué)微生物學(xué)試驗(yàn)報(bào)告

1、微生物實(shí)驗(yàn)報(bào)告題目膿汁和糞便標(biāo)本中病原菌的檢測(cè)成績(jī)年級(jí)專業(yè)實(shí)驗(yàn)者學(xué)號(hào)組號(hào)小組成員指導(dǎo)老師一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?,了解細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)條件以及培養(yǎng)基的種類。2.掌握培養(yǎng)基制備的原則和一般方法。3,掌握無菌操作技術(shù)。4,掌握病原菌的分離與培養(yǎng)方法。5,掌握油鏡的正確使用。6,掌握細(xì)菌涂片標(biāo)本的制備以及革蘭氏染色法。7,熟悉幾種常用的細(xì)菌生化反應(yīng)的名稱、原理、方法、結(jié)果分析及用途8,掌握血漿凝固酶試驗(yàn)的原理、方法及用途。9,掌握紙片擴(kuò)散法檢測(cè)藥物敏感性原理及應(yīng)用。10.掌握玻片凝集試驗(yàn)的原理方法、方法、結(jié)果觀察與判斷。二、實(shí)驗(yàn)器材1 .藥品與試劑：營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉、營(yíng)養(yǎng)肉湯粉、半固體瓊脂粉、蒸儲(chǔ)水、膿汁標(biāo)本、糞

2、便標(biāo)本、普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板、伊紅美藍(lán)瓊脂平板、斜面培養(yǎng)基管、液體培養(yǎng)基管、半固體培養(yǎng)基管、結(jié)晶紫染液（第 1 液）、盧戈氏碘液（第2 液）、95%酉精（第 3 液）、稀釋石炭酸復(fù)紅（第 4 液）、香柏油、二甲苯、葡萄糖發(fā)酵微量管、乳糖發(fā)酵微量管、兔血漿、生理鹽水、診斷血清、Muller-Hinton 瓊脂平板、青霉素濾紙片、鏈霉素濾紙片、慶大霉素濾紙片2 .器材：1500W 電爐、天平、稱量紙、藥勺、三角燒瓶、量筒、試管、刻度吸管、洗耳球、棉塞、牛皮紙、硫酸紙、橡皮筋、試管筐、尺、平皿、酒精燈、電爐、接種環(huán)、接種針、染色架、吸水紙、擦鏡紙、打火機(jī)、筆、顯微鏡、小砂輪、載玻片、銀子、試管刷、冰箱、

3、包溫培養(yǎng)箱三、方法與步驟1、培養(yǎng)基的制備:稱量干粉培養(yǎng)基（g）水量（ml）煮沸（次）分裝（ml）備注營(yíng)養(yǎng)瓊脂11.43002 瓶， 500ml錐形瓶，平板營(yíng)養(yǎng)瓊脂2.9753515 支,中試管，斜面營(yíng)養(yǎng)肉湯1.1501115 支小試管，液體半固體瓊脂1.7603315 支，小試管，高層干粉培養(yǎng)基一蒸儲(chǔ)水一加熱溶化一分裝一集中放在試管筐里，然后罩上硫酸紙、牛皮紙，用橡皮筋扎好一放入講臺(tái)邊的滅菌桶或滅菌筐內(nèi)一送到高壓蒸汽滅菌室一滅菌（用于倒平板的培養(yǎng)基不用加熱溶解，搖勻即可）2、細(xì)菌的分離培養(yǎng)平板劃線分離法甲一膿汁標(biāo)本一營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色）乙一膿汁標(biāo)本一營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板（黃色）內(nèi)一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平

4、板（紫色）丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板（紫色）方法：（1）右手拿接種環(huán)（如握筆式），燒灼滅菌，欲伸入試管內(nèi)的接種環(huán)桿部分亦要迅速通過火焰 23 次，以殺滅其表面細(xì)菌；（2）左手握住盛有標(biāo)本的試管的下端，右手以無名指、小指與手掌在火焰旁拔出試管棉塞并挾住之，將管口迅速通過火焰三次滅菌；（3）立即將已滅冷卻的接種環(huán)伸入試管內(nèi)，沾取標(biāo)本（或菌液）一環(huán)，試管口火焰滅菌后塞好棉塞；（4）左手斜持平板，略開蓋，在酒精燈火焰左前方約 56cm 處，將接種環(huán)上的菌液涂抹于平板表面的邊緣部分；（5）燒灼接種環(huán)，冷卻后，從原涂抹部分開始，連續(xù)平行劃線，每次只劃平板的 1/41/5,劃畢后接種環(huán)再經(jīng)火焰滅菌，冷卻后用

5、同樣方法在平板其余部分劃線，每次劃線要與前次劃線重疊 1-3條，共計(jì) 3A次（區(qū)）；（6）接種完畢，將接種環(huán)燒灼滅菌后方可放下；（7）將培養(yǎng)皿倒置，37C培養(yǎng) 34 小時(shí)后，觀察結(jié)果。3、細(xì)菌的純培養(yǎng)斜面接種分工甲一普通平板一黃色菌落一 1 支斜面乙一普通平板一白色菌落一 1 支斜面丙一 EMW 板一紫黑菌落一 1 支斜面丁一 EMB 平板一粉紅菌落一 1 支斜面方法：接種環(huán)一套住菌落一輕刮取菌一接種環(huán)取菌后，伸入斜面底部，自下向上先拉一條細(xì)菌接種線一再伸入底部，自下向上，作蜿蜒劃線一細(xì)菌涂布接種在斜面培養(yǎng)基的表面一斜面正面上 2/3 作標(biāo)記：組號(hào)、顏色一收集平板-滅菌桶內(nèi)（平板底部朝下，蓋朝

6、上放置）一速送滅菌室一高壓蒸汽滅菌一洗刷。4、細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查涂片一干燥一固定一染色（1）涂片一干燥一固定甲一黃色，紫黑。乙一白色，粉紅。內(nèi)一黃色，紫黑。丁一白色，粉紅。方法：涂片：接種環(huán)取鹽水 3ulX2 滴，水滴間距小于 2cm;取菌苔少許（1mm、菌落半個(gè)）與鹽水混勻，涂成大于 lcm2;涂畢一環(huán)移至涂膜中央側(cè)立，待環(huán)內(nèi)菌膜破裂，接種環(huán)燒灼滅菌。一干燥一固定：手持載玻片一端，涂膜朝上，兩個(gè)涂膜快速通過火焰外層 3 次，時(shí)間 2?3 秒鐘。革蘭染色涂片一干燥一固定一結(jié)晶紫一初染 1 分鐘一水洗一盧戈碘液一媒染 1 分鐘一水洗一 95%乙醇一脫色約 20秒鐘一 7 尺洗一稀釋品紅一復(fù)染 1

7、分鐘一水洗一吸干，鏡檢。油鏡使用方法：10X 物鏡一看清標(biāo)本一滴加香柏油一 100X 油鏡一浸泡油中一模糊物象一細(xì)調(diào)節(jié)調(diào)焦，觀察物像一記錄結(jié)果一關(guān)閉電源一擦鏡紙拭去香柏油一擦鏡紙沾少許乙醇和乙醴（7:3）混合液擦拭一擦鏡紙擦拭油鏡。5、液體培養(yǎng)基接種（肉湯接種）甲一黃色，乙一白色，丙一紫黑，丁一粉紅。方法：（1）接種環(huán)斜面取菌，在靠近液面的管壁上，上下研磨接種；（2）在管壁上，將接種環(huán)內(nèi)的菌膜拍破。退出接種環(huán)，燒灼滅菌；（3）標(biāo)記：組號(hào)，顏色6、細(xì)菌的生化試驗(yàn)等a.細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)甲一紫黑菌苔一葡萄糖乙一紫黑菌苔一乳糖內(nèi)一粉紅菌苔一葡萄糖丁一粉紅菌苔一乳糖方法：用砂輪在糖發(fā)酵管液面上方 2?3

8、cm 處切割，然后，向切口外側(cè)分離掰斷，管口燒灼滅菌。接種針斜面取菌，伸入培養(yǎng)基內(nèi)，在管壁上，上下研磨接種。退出接種針，燒灼滅菌。管口朝向相同，放置在平皿內(nèi)。b.抗菌素敏感性試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法甲一黃色菌液乙一白色菌液內(nèi)一紫黑菌液丁一粉紅菌液方法：先取一環(huán)菌液；沿平板直徑拉一條細(xì)菌接種線；再取一環(huán)菌液；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，拉另一條接種線，使兩條細(xì)菌接種線呈“十字形”；然后在平板上半部，作連續(xù)來回密集劃線，每次劃二分之一平板；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，二次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，三次密集劃線；旋轉(zhuǎn)平板 90 度角，四次密集劃線；設(shè)三點(diǎn)，呈等邊三角距離；點(diǎn)距離平板邊緣約 15mm?作標(biāo)記：青、先、

9、慶；？銀子尖嘴朝下，夾取相應(yīng)藥物紙片的邊緣，平貼在已設(shè)定的位置上，輕輕按壓紙片。c.血漿凝固酶試驗(yàn)兔血漿+黃色，白色方法：取二滴兔血漿(rabbitplasma)置于潔凈的玻片上。分別用接種環(huán)取白色和黃色菌苔(約 2?3 個(gè)菌落的菌量)與血漿研磨混合成直徑 8?10mm 勺一層薄菌膜，立即觀察結(jié)果。菌液出現(xiàn)明顯凝塊者為陽性，否則為陰性。d.半固體穿刺接種法甲一白色乙一金黃色內(nèi)一紫黑丁一粉紅方法：接種針斜面取菌，從半固體中心，垂直刺入，到達(dá)培養(yǎng)基底部 5 分之 4 處，再循原來的路線，退出接種針；管口、接種針經(jīng)火焰燒灼滅菌；標(biāo)記：組號(hào)，顏色。7、細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)、結(jié)果分析玻片凝集試驗(yàn)方法：(1)

10、取潔凈的載玻片一張，將磨面近端設(shè)為對(duì)照區(qū)，滴加生理鹽水 15ul。遠(yuǎn)端設(shè)為試驗(yàn)區(qū)，滴加福氏志賀菌診斷血清 15ul;(2)用接種環(huán)分別取粉紅色菌苔，約 2 個(gè)小菌落的菌量，研磨于鹽水或血清內(nèi)，混合均勻四、結(jié)果與討論（一）實(shí)驗(yàn)結(jié)果1 1 . .洗手前后對(duì)比:空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果（實(shí)驗(yàn)室內(nèi)，暴露在手機(jī)下）：圖 1.11.1 甲乙洗手前后圖 1.21.2 丙丁洗手前后圖 1.31.3 空氣的細(xì)菌學(xué)檢查結(jié)果CFU/m3CFU/m3= =50000N+AT=5000(X13X(3.14X3.5cm2)X40/m3=1118/m350000N+AT=5000(X13X(3.14X3.5cm2)X40/m3

11、=1118/m32 2 . .細(xì)菌的分離培養(yǎng)結(jié)果：(1)(1)膿汁標(biāo)本在普通平板上有黃色、白色兩種菌落，菌落的色素是脂溶性的，是細(xì)菌本身的顏色。菌落直徑 2m2m 在右、圓形、隆起、表面光滑、濕潤(rùn)、邊緣整齊、不透明。(2)(2)糞便標(biāo)本在伊紅美藍(lán)平板上，有紫黑色、淡粉紅色兩種菌落，菌落色素是水溶性的，不是細(xì)菌本身的顏色，紫黑色菌落具有金屬光澤、大而隆起、不透明的菌落,菌落直徑 2?2?3mm3mm 粉紅色菌落淡粉紅色，半透明，直徑 1?1?2mm.2mm.(3)(3)從四張平板畫線的結(jié)果上來看，四張均有不足，得不到特別典型的菌落。第一二張膿汁的營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，前面兩區(qū)涂抹太密集，而板的其他部位未

12、充分利用，得不到十分明顯的菌落。第三糞便的平板涂布時(shí)，用力過大劃破平板，而第四張糞便的平板第一區(qū)太稀疏，未充分利用平板，故在培養(yǎng)后未見到數(shù)量較少的粉紅菌落，原因是初次劃線時(shí)，力度與劃線的密度均未能很好地掌握，動(dòng)作不熟練，不能連續(xù)劃線。圖 2.12.1 甲，乙一膿汁標(biāo)本一營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板圖 2.22.2 丙，丁一糞便標(biāo)本一伊紅美藍(lán)平板3 3 . .細(xì)菌的純培養(yǎng)：在斜面培養(yǎng)基上得到四種菌體的純培養(yǎng)標(biāo)本，從普通平板上挑取的金黃色或白色菌落接種的斜面，菌苔的顏色，還是原來菌落的顏色，金黃色或白色。從伊紅美藍(lán)平板上挑取的紫黑色或粉紅色菌落接種的斜面，菌苔已經(jīng)沒有原來菌落的顏色。菌苔灰白色、表面濕潤(rùn)、光滑、前

13、者不透明，后者透明。圖 3.13.1 四種菌落在斜面培養(yǎng)基上生長(zhǎng)情況右左向右依次為金黃，白色，紫黑，粉紅菌苔4.4.細(xì)菌的形態(tài)學(xué)檢查圖 4.14.1 膿汁菌苔（左邊為金黃色菌苔，右圖為白色菌苔）圖 4.24.2 糞便菌苔（左圖為紫黑色菌苔，右圖為粉紅菌苔）鏡下觀察：用普通平板，從濃汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，這兩株細(xì)菌，顯微鏡油鏡下土勻?yàn)镚+G+求菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素,這兩株葡萄球菌可能是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本分離、獲得紫黑色和粉紅色半透明兩種菌落。紫黑色菌落可能是能分解乳糖的非致病菌大腸埃希菌。粉紅色菌落是不能分

14、解乳糖的致病菌。顯微鏡下，均為 G-G-桿菌，散在排列，從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。5 5、液體培養(yǎng)基接種圖 6.16.1 半固體穿刺圖 5.15.1 液體培養(yǎng)基接種結(jié)果從左至右分別為： (黃色細(xì)菌白色細(xì)菌紫黑色細(xì)菌粉紅色細(xì)菌6 6 .細(xì)菌的生化試驗(yàn)等：(1)(1)半固體穿刺接種法結(jié)果觀察及討論：表 1,1,動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果菌苔半固體實(shí)驗(yàn)紫黑細(xì)菌 1+1+紫黑細(xì)菌 2+2+粉紅細(xì)菌 1-1-粉紅細(xì)菌 2-2-+:陽性-:陰性1 1、紫黑細(xì)菌 1 1 和 2 2 細(xì)菌自接種部位向四周移動(dòng)、擴(kuò)散生長(zhǎng)，培養(yǎng)基略微呈毛刷狀或云霧狀混濁狀態(tài)，表明其有鞭毛。結(jié)合其他組的結(jié)果，我們認(rèn)為紫黑菌苔應(yīng)當(dāng)是動(dòng)力陽性的。

15、2 2、粉紅細(xì)菌菌苔均沿著直線生長(zhǎng)，可看出其無鞭毛。(2)(2)細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)編號(hào)菌苔糖發(fā)酵管反應(yīng)現(xiàn)象結(jié)果描述符號(hào)甲紫黑糖發(fā)酵管艾黃色有氣泡分解 X X 糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣乙紫黑糖發(fā)酵管艾黃色有氣泡分解 X X 糖產(chǎn)酸又產(chǎn)氣丙粉紅糖發(fā)酵管艾黃色無氣泡分解 X X 糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣+ +丁粉紅糖發(fā)酵管仍紫色無氣泡分解 X X 糖不產(chǎn)酸不產(chǎn)氣- -+:產(chǎn)酸或陽性：產(chǎn)酸產(chǎn)氣- -:陰性紫黑細(xì)菌微型發(fā)酵關(guān)內(nèi)液體變黃，產(chǎn)生氣泡，氣泡的高度分別為 10m10m 咻口 17mm17mm 說明紫黑色菌苔既分解葡萄糖也分解乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅細(xì)菌只分解葡萄糖，不產(chǎn)氣，不分解乳糖。(3)(3)抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果菌苔青霉素

16、頭抱曲松慶大霉素金黃色354235423232白色282128213434紫黑30302727粉紅35353030表 4.4.藥敏試驗(yàn)結(jié)果分析表 3 3 各菌抑菌圈直徑（mmmm 表圖 6.36.3 抗菌素敏感試驗(yàn)結(jié)果青霉素頭抱曲松慶大霉素金黃色+白色土土+ +紫黑-+粉紅-+:敏感:中度敏感+ +金黃細(xì)菌對(duì)青霉素敏感，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感白色細(xì)菌對(duì)青霉素中度敏感，對(duì)頭抱曲松中度敏感，對(duì)慶大毒素敏感紫黑細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感粉紅細(xì)菌對(duì)青霉素耐藥，對(duì)頭抱曲松敏感，對(duì)慶大毒素敏感（4 4）血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果：圖 6.46.4 白色（左）與金黃色（右）菌苔1 1、

17、白色菌苔不發(fā)生凝塊，容易涂抹。呈均勻乳白狀態(tài)。2 2、黃色菌苔能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白附著于菌體表面，形成凝塊，涂抹不開。說明黃色細(xì)菌為致病菌。7 7 . .細(xì)菌的血清學(xué)試驗(yàn)結(jié)果：圖 6.56.5 粉紅菌苔（右）凝集結(jié)果（左側(cè)為對(duì)照）1 1、由實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖可看到，生理鹽水一端不出現(xiàn)凝集，福氏志賀菌診斷血清一端菌液渾濁，少量絮狀，為陽性。說明粉紅菌為福氏志賀菌。8 8 . .結(jié)論：腸道桿菌科各菌屬生化反應(yīng)鑒別表葡萄糖乳糖麥芽糖甘露醇蔗糖半固體埃希國(guó)屬V+志賀菌屬+VV+/-/+-沙門菌屬/+-+霍亂弧菌+-+變形桿菌屬-rv-V+注：+產(chǎn)酸或陽性，產(chǎn)酸產(chǎn)氣，-陰

18、性，+/-多數(shù)陽性，-/+多數(shù)陰性V不確定。常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征葡萄糖乳糖半固體大腸埃布國(guó)+福氏志賀菌+傷寒沙門菌+霍亂弧菌+幽門螺桿菌不分解糖類+變形桿菌+對(duì)照常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，血清學(xué)分析，說明黃色菌落是金黃色葡萄球菌；白色菌落是白色葡萄球菌；紫黑色菌落是大腸埃希菌；粉紅色菌落是福氏志賀菌。（二）實(shí)驗(yàn)綜合討論1 1 . .分析：（1 1）、用普通平板，從膿汁標(biāo)本中分離得到黃色、白色兩種菌落，油鏡下均為 G+G+球菌，排列不規(guī)則，呈葡萄串狀，是典型的葡萄球菌。結(jié)合菌落色素，這兩株葡萄球菌分別是金黃色葡萄球菌和白色葡萄球菌。致病性葡萄球菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，可使血漿中的

19、纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄岳w維蛋白，附著于菌體表面，形成凝塊。通過血漿凝固酶實(shí)驗(yàn)，金黃色葡萄球菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽性，為致病菌。用伊紅美藍(lán)平板，從糞便標(biāo)本中分離出紫黑色具有金屬光澤和粉紅色半透明菌落，顯微鏡下均為 G-G-桿菌，散在排列。紫黑色金屬光澤的產(chǎn)生是因?yàn)槿樘潜环纸猱a(chǎn)酸，酸使伊紅美和藍(lán)紫結(jié)合，產(chǎn)生紫黑金屬光澤菌落。紫黑色菌落是能分解乳糖的大腸埃希菌。致病菌不能分解乳糖，菌落呈現(xiàn)伊紅的顏色。粉紅色菌落是不能分解乳糖的致病菌。從形態(tài)上不能鑒別是什么細(xì)菌。經(jīng)糖發(fā)酵試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種分解葡萄糖和乳糖，產(chǎn)酸產(chǎn)氣；粉紅色菌落菌種只能分解葡萄糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣）半固體動(dòng)力試驗(yàn)（紫黑色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陽性

20、，有鞭毛；粉紅色菌落菌種半固體動(dòng)力試驗(yàn)結(jié)果陰性，無鞭毛）。對(duì)照常見腸道感染細(xì)菌主要生化反應(yīng)特征，判定它們分別是大腸埃希菌和福氏志賀菌。通過血清學(xué)實(shí)驗(yàn)，粉紅色菌落菌種與福氏志賀菌診斷血清發(fā)生凝集反應(yīng)，進(jìn)一步確定其為福氏志賀菌。綜上所述，紫黑色的細(xì)菌為大腸埃希菌，粉紅色的為福氏志賀菌。2 2 . .實(shí)驗(yàn)的不足之處：我們的實(shí)驗(yàn)在操作上也產(chǎn)生了許多錯(cuò)誤和不足。(1)(1)在對(duì)膿汁標(biāo)本黃色細(xì)菌(金黃色葡萄球菌)進(jìn)行斜面培養(yǎng)時(shí)，在斜面上呈現(xiàn)出檸檬黃色而非金黃色的菌落，經(jīng)分析認(rèn)為有一下兩種可能：選取平板上的菌落時(shí)，挑到的菌落并非單一細(xì)菌的菌落；接種到斜面培養(yǎng)基時(shí)，接種環(huán)挑選菌落后在空氣中暴露過久污染導(dǎo)致。這體現(xiàn)出了微生物實(shí)驗(yàn)操作中嚴(yán)格無菌操作的重要性；(2)(2)平板劃線時(shí)力道太重且接種環(huán)持握過直導(dǎo)致在平板上留下劃痕，往后需多次平