第八組-項目一-乳酸菌細菌素的制備

1、乳酸菌細菌素的制備目錄 乳酸菌細菌素總概述及其應(yīng)用 乳酸菌的分離、純化與鑒定 乳酸菌活性的測定與篩選及其鑒定方法 乳酸菌發(fā)酵過程監(jiān)控（以乳酸菌乳飲料生產(chǎn)為例） 發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的分離純化與鑒定 乳酸菌細菌素的展望乳酸菌的概念 乳酸菌（Lactobacillus）是發(fā)酵糖類且主要產(chǎn)物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱。凡是能從葡萄糖或乳糖的發(fā)酵過程中產(chǎn)生乳酸的細菌統(tǒng)稱為乳酸菌。是一種存在于人類體內(nèi)的益生菌。乳酸菌可用于制造酸奶、乳酪、德國酸菜、啤酒、葡萄酒、泡菜、腌漬食品和其他發(fā)酵食品。其形態(tài)特征為：乳酸鏈球菌族，菌體球狀，通常成對或成鏈。乳酸桿菌族，菌體桿狀，單個或成鏈，有時成絲狀、產(chǎn)

2、生假分枝。相關(guān)介紹 早在1928年，L.A.Rogers及其同事在美國首次報道，乳酸鏈球菌的代謝產(chǎn)物能抑制乳酸菌，在以后的有關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，此代謝產(chǎn)物是細菌素。細菌素（Bacteriocins）的含義可以這樣理解：由某細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，抑菌范圍不僅僅局限于同源細菌，產(chǎn)生菌對其細菌素有自身免疫性。大多數(shù)乳酸菌在代謝過程中都能合成這種物質(zhì)，通稱為乳酸菌素，它具有抑制和殺死食品中多數(shù)革蘭氏陽性致病菌和腐敗菌的作用，少數(shù)乳酸菌對革蘭氏陰性菌有效。乳酸菌素的分類乳酸菌素的分類 目前主要有2種方法： 一是基于分子量、熱敏感性和是否含修飾性氨基酸，將乳酸

3、菌素大致分為4類： 小分子熱穩(wěn)定肽 大分子熱不穩(wěn)定蛋白 羊毛硫抗生素 依賴于2個高度疏水的熱穩(wěn)定小膚分子的協(xié)同作用而明顯不同于其他乳酸菌 二是根據(jù)乳酸菌的種屬不同而將其所產(chǎn)的細菌素分為6類：乳酸菌屬細菌素、片球菌屬細菌素、明串珠菌屬細菌素、肉食桿菌屬細菌素、其他乳酸菌細菌素、乳酸菌屬細菌素乳酸菌細菌素的作用 改善胃腸道功能，維持腸道菌群平衡。 提供營養(yǎng)物質(zhì)，促進機體生長乳酸菌。 改善免疫能力。 幫助吸收營養(yǎng)成分 乳酸菌對一些腐敗菌和低溫細菌有較好的抑制作用。乳酸菌細菌素的應(yīng)用 乳酸菌細菌素是一種殺菌蛋白或多肽，對革蘭氏陽性菌具有光譜抑制作用，尤其是抑制一些腐敗菌和病原菌，且與螯合菌結(jié)合可以將其

4、活性譜拓寬到革蘭氏陰性菌，因而為食品加工和食品保藏提供了一個新的方法。如作為一種安安全、無毒、天然的食品防腐劑個抗菌添加劑已經(jīng)被50多個國家和地區(qū)廣泛的應(yīng)用在乳制品、罐頭食品生產(chǎn)中。 細菌素也可以作為發(fā)酵劑發(fā)酵的副產(chǎn)物存在于成熟奶酪、酸奶、臘腸、泡菜等食品中。許多研究已經(jīng)證明，具有產(chǎn)細菌素能力的發(fā)酵劑在發(fā)酵過程中可以防止和控制不良菌叢引起的污染。因此一般認為添加產(chǎn)細菌素的乳酸菌到食品中比直接添加細菌素更可取。細菌素的另一個應(yīng)用的例子是可以被利用于進行結(jié)構(gòu)基因的克隆和免疫因子的測定上。乳酸菌的分離、純化與鑒定乳酸菌的分離、純化與鑒定 一、培養(yǎng)基的制備 MRS培養(yǎng)基（pH6.26.4）：蛋白胨10

5、g、牛肉膏10g、酵母膏5.0g、檸檬酸氫二銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫80 1.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.58g、硫酸錳0.25g、瓊脂粉18.0g（固體培養(yǎng)基，半固體培養(yǎng)基為0.8g）、蒸餾水1000mL、碳酸鈣（3%）30g，用于細菌分離 牛肉膏蛋白胨雙層培養(yǎng)基（pH7.07.2）：牛肉膏3g、蛋白胨5g、NaCl 3g、蒸餾水1000mL(上層瓊脂濃度為0.75%，下層為2%)，用于抑菌實驗。 二、乳酸菌的分離純化 實驗儀器：三角瓶、試管、移液管、培養(yǎng)皿、搪瓷杯、電爐、天平、玻璃棒、量筒、無菌操作臺、高壓滅菌鍋、恒溫培養(yǎng)箱 實驗步驟： 1）、預處理：將

6、MRS培養(yǎng)基加熱融化后，放入水浴鍋內(nèi)保溫，以防凝固；將除去樣品及培養(yǎng)基以外的東西放入無菌操作臺內(nèi)，打開紫外燈，滅菌30min,后關(guān)閉紫外燈，打開風機，點燃酒精燈，調(diào)整風速至火焰約折過45。用酒精棉球擦手、臺面、樣品、試管口、整理桌面、平板倒置。松試管塞，然后標記試管、平皿（試管標記在試管口1/5處，平皿標記要有平板稀釋度、日期及操作人）。 2）將樣品以10倍稀釋法稀釋至10-7,取其10-7、10-6兩個稀釋度的稀釋液各0.10.2mL,分別置于上述各營養(yǎng)平板上，用無菌涂布器依次涂布2至3個皿，置43C培養(yǎng)48h。如出現(xiàn)圓形稍扁平的黃色菌落及其周圍培養(yǎng)基亦為黃色者初步定位乳酸菌。 3）將典型菌

7、落轉(zhuǎn)至脫脂乳發(fā)酵管，43C培養(yǎng)824h，若牛乳管凝固，無氣泡，呈酸性，鏡檢細胞桿狀或鏈球狀，革蘭氏染色呈陽性，則將其連續(xù)傳代若干次，43C培養(yǎng)，挑選出在34h能凝固的乳管，保存?zhèn)溆?。乳酸菌活性的測定與篩選 乳酸菌活性的測定采用牛津杯定量擴散法（又稱管碟法）。選用9.0cm平皿，將指示菌培養(yǎng)物與15mL融化且冷卻至50C左右的檢測培養(yǎng)基混勻（指示菌最終為1.0107CFU/mL）,傾入已放置好牛津杯的無菌平皿中，待瓊脂凝固后用無菌鑷子將牛津杯取出。調(diào)整乳酸菌發(fā)酵液pH值至2.0，離心后取上清液，100C加熱5min，去100uL該處理液，加入到檢測平皿牛津杯形成的小孔中。在指示菌生長的最適溫度下

8、進行培養(yǎng)，觀察并測定抑菌圈直徑，并以此表示乳酸菌素的活性。此外，為便于與Nisin進行比較，將乳酸菌素的活性單位定義如下：以藤黃八桑球菌1.880為指示菌，乳酸菌素溶液每產(chǎn)生1mm2抑菌圈而積稱為1個活性單位；比活性定義為單位體積的乳酸菌素的活性單位。利用管碟法篩選出具有較高抑菌活性的乳酸菌。乳酸菌的鑒定方法 （1）菌落形態(tài)和培養(yǎng)特征觀察：主要利用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)。 （2）生長條件試驗： 1）耐鹽性試驗（Nacl濃度：0.85、1.20和1.71mol/L）； 2）耐酸堿試驗（PH：4.3、5.7、6.8、8.4、8.6和8.7）； 3）溫度梯度試驗（溫度：10C、30C、40C、50C、55

9、C、60C和65C）。 （3）生理生化試驗：其中又包括過氧化氫酶測定、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、明膠液化實驗、甲基紅（M.R）試驗、乙酰甲基甲醇V-P實驗、檸檬酸鹽實驗、酪素水解試驗、厭氧生長測定、厭氧硝酸鹽產(chǎn)氣、石蕊牛奶的反應(yīng)和糖發(fā)酵實驗； （4）16S rDNA序列分析； （5）生長曲線測定。（三）乳酸菌的發(fā)酵與過程監(jiān)控（以乳酸菌乳飲料生產(chǎn)為例） 關(guān)鍵點：發(fā)酵乳的制作，包括原料奶收購、原料奶熱處理、菌種選擇、發(fā)酵控制 關(guān)鍵點：穩(wěn)定劑選擇及溶解，包括穩(wěn)定劑的選擇、穩(wěn)定劑的溶解 關(guān)鍵點：調(diào)酸，包括酸的濃度、加酸的溫度、加酸的速度 關(guān)鍵點：殺菌及保藏，原料奶的質(zhì)量必須合格并保證殺菌條件；所有設(shè)備、管路

10、必須保證殺菌合格；生產(chǎn)環(huán)境的空氣細菌數(shù)應(yīng)300 個m-3，酵母菌、霉菌50個 m-3；注意個人衛(wèi)生并定期檢查、檢驗；各種原輔料在與混合前應(yīng)盡可能做到商業(yè)無菌狀態(tài)，所經(jīng)過的管路殺菌必須合格；包裝材料在進廠之前要按要求嚴格檢驗，確保包材質(zhì)量合格。同時，活性乳酸菌飲料必須在冷鏈下銷售、儲存。而殺菌型乳酸菌飲料為了達到常溫銷售并達到一定保質(zhì)期的目的必須在均質(zhì)后進行超高溫殺菌（110130，310秒）然后無菌灌裝，或灌裝后進行二次殺菌（85，維持1530分鐘）。發(fā)酵液抑菌物質(zhì)的分離純化與鑒定方法 一、抑菌物質(zhì)的粗分一、抑菌物質(zhì)的粗分 （1）發(fā)酵上清液鹽析沉淀樣制備取菌株發(fā)酵上清液，用飽和度為8的硫酸銨，

11、4 鹽析沉淀24 h，然后4000 rpm，離心20 min，收集沉淀，用蒸餾水將沉淀溶解。將MD44(DM-27)透析袋制成15 cm 的小段，將透析袋放置于2% NaHCO3和1mmol/L pH8.0 EDTA 的沸水浴中煮20 min，然后用蒸餾水或者去離子水浸泡透析袋，然后將其置入1mmol/L pH 8.0 EDTA中煮10 min，并在4 條件下貯藏備用。使用前用蒸餾水沖洗透析袋。取10 mL硫酸銨鹽析沉淀物水溶液，在裝有蒸餾水的容器中進行透析，透析工作溫度為4 。每隔半小時換一次蒸餾水。將2mL BaCl2（10%）溶液放入一試管中，并在試管中滴加23 滴透析液，如果有白色沉淀

12、出現(xiàn)，則表明表明SO4-2尚未除凈，仍需要透析；如果未出現(xiàn)沉淀，則表明已經(jīng)完全透析。 （2）發(fā)酵上清超濾濃縮液制備取15mL超濾離心杯，加入發(fā)酵上清液，進行二次離心。3000rmp 離心20min，后調(diào)轉(zhuǎn)速至3500 rmp，離心20 min。先后用10 KDa、3 KDa 超濾離心杯進行二次離心超濾，取截留液及10倍濃縮濾過液進行抑菌實驗 二、半制備高效液相色譜分離純化抑菌物質(zhì)二、半制備高效液相色譜分離純化抑菌物質(zhì) （1）超濾液半制備型液相色譜條件由半制備型液相色譜（VARIAN Prostar 218，美國）測定。 色譜制備液中有機酸檢測利用離子色譜（D20 NEX ICS-3000）測定。 將第4 部分進GC-MS，儀器條件如下：色譜儀島津（SHIMADZU）GCMS-QP2010-plus色譜柱：RTX-5MS(30m*0.25mm*0.25m)；進樣口溫度260；載氣He，1.0mL/min；色譜柱溫度：50（1min），以5/min 速度升溫至275（3min）；進樣量：1.0L，分流比10:1，恒流模式；接口溫度280，離子源溫度230；EI 電子能量：70eV，質(zhì)量掃描范圍：35amu。 乳酸菌細菌素的展望 綜上所訴，乳酸菌細菌素有很多特點，已經(jīng)引起廣大從事乳酸菌、食品添加劑、益生素及開發(fā)新藥等領(lǐng)域研究人員的極大興