westernblot原理及操作方法

1、Western blot 原理 分類 主要試劑 操作步驟 常見問題原理 Western Blot（蛋白免疫印跡）采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE)，被檢測(cè)物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價(jià)鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對(duì)應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測(cè)電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測(cè)蛋白水平的表達(dá)?？乖豢股锼貥?biāo)記的二抗ECL發(fā)光試劑

2、分類 SDS-PAGE（十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳） native-PAGE（非變性聚丙烯酰胺凝膠） 區(qū)別在于加不加變性劑（比如SDS）使蛋白質(zhì)變性，SDS-PAGE是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式特別是用于蛋白質(zhì)純度檢測(cè)和測(cè)定蛋白質(zhì)分子量主要試劑1.ddH2O2.30% 丙烯酰胺混合液 丙烯酰胺(arc)29g和N，N-亞甲雙丙烯酰胺(bis)1g加H2O至100ml。儲(chǔ)于棕色瓶，4避光保存。嚴(yán)格核實(shí)PH不得超過7.0，因可以發(fā)生脫氨基反應(yīng)是光催化或堿催化的。使用期不得超過兩個(gè)月，隔幾個(gè)月須重新配制。如有沉淀，可以過濾。 為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電泳成功與否。主

3、要試劑3. 配膠緩沖液系統(tǒng) 分離膠緩沖液：1.5mol/L Tris-HCL(pH 8.8) ； 濃縮膠緩沖液：1.0mol/L Tris-HCL (pH 6.8)； 電泳緩沖液： 5XTris甘氨酸緩沖系統(tǒng)， 4保存 5電泳緩沖液（貯存液）的配制： 0.125 M Tris 15.1 g 1.25 M Glycine 94 g 0.5 % SDS 5 g 三蒸水定容至 1000 mL 主要試劑 在SDSPAGE不連續(xù)電泳中，濃縮膠其pH環(huán)境呈弱酸性，因此甘氨酸解離很少，其在電場(chǎng)的作用下，泳動(dòng)效率低；而Cl離子卻很高，兩者之間形成導(dǎo)電性較低的區(qū)帶，蛋白分子就介于二者之間泳動(dòng)。由于導(dǎo)電性與電場(chǎng)強(qiáng)

4、度成反比，這一區(qū)帶便形成了較高的電壓梯度，壓著蛋白質(zhì)分子聚集到一起，濃縮為一狹窄的區(qū)帶。當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠后，由于膠中pH的增加，呈堿性，甘氨酸大量解離，泳動(dòng)速率增加，直接緊隨氯離子之后，同時(shí)由于分離膠孔徑的縮小，在電場(chǎng)的作用下，蛋白分子根據(jù)其固有的帶電性和分子大小進(jìn)行分離。主要試劑4. 10% 十二烷基硫酸鈉SDS溶液 是陰離子去污劑，作為變性劑和助溶試劑 去蛋白質(zhì)電荷； 斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵，取消蛋白分子內(nèi)的疏水作用；使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級(jí)結(jié)構(gòu)，常溫保存。主要試劑5. 10% 過硫酸銨（AP） 催化劑，催化單丙和雙丙聚合成聚丙烯酰胺，4保存，一周內(nèi)使用 0.1g過硫酸銨溶于

5、1mlddH2O中主要試劑6.四甲基乙二胺TEMED 催凝劑，加速AP催化作用，在聚合過程中，TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)主要試劑7. 8SDS-PAGE Loading Buffer溶液（上樣緩沖液） loading buffer的功能主要有兩個(gè)： 第一，里邊的指示劑溴酚藍(lán)起到指示的作用，它是一個(gè)較小的分子，可以自由通過凝膠孔徑,所以它顯示著電泳的前沿位置，以便我們適時(shí)終止電泳； 第二，里邊的成分甘油可以加大樣品密度，使其沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔。 SDS主要是促使聚合酶變性，因?yàn)闆]

6、有除盡的聚合酶會(huì)結(jié)合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細(xì)胞裂解后的裂解液，加loading 100加熱，也是為了中止酶促反應(yīng)，防止提取的蛋白質(zhì)降解。主要試劑8.10轉(zhuǎn)印Buffer（貯存液） 4保存 10轉(zhuǎn)印Buffer（貯存液）的配制： 0.25 M Tris 30.28 g 1.92 M Glycine 144.13 g 三蒸水定容至 1000 mL 1Transfer Buffer（工作液）： 10Transfer Buffer 100 mL 三蒸水 700 mL 20 % 甲醇 200 mL主要試劑9.甲醇 轉(zhuǎn)膜液中主要是降低電導(dǎo)的作用，防止轉(zhuǎn)膜溶液過熱。10.聚偏二氟乙烯(Polyvi

7、nylidene fluoride, PVDF)膜 PVDF膜靈敏度、分辨率和蛋白親和力比常規(guī)的膜要高，非常適合于低分子量蛋白的檢測(cè)，用前需在甲醇中浸泡，以活化膜上 的正電基團(tuán)，使其更容易與帶負(fù)電荷蛋白結(jié)合。主要試劑11.三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液Tris buffer saline（1TBS） 洗去Tween,因?yàn)門ween會(huì)影響發(fā)光 10 mM Tris-HCl （pH=8.0）1 M 10 mL 150 mM NaCl 5 M 30 mL 三蒸水定容至 1000 mL12. Tris buffer saline Tween（ TBST）緩沖液 洗去未結(jié)合的抗體 1TBS 1000 mL

8、0.05 % Tween-20 0.5 mL主要試劑13.封閉緩沖液 封閉膜上的非特異性蛋白結(jié)合位點(diǎn)，防止一抗、二抗的非特異性反應(yīng) TBST Buffer 100 mL 5 % Nonfat Milk 5 g14.一抗15.二抗：羊抗兔IgG/HRP（辣根過氧化酶） 使試劑中的發(fā)光物氧化并發(fā)光16. ECL檢測(cè)試劑操作步驟提取總蛋白蛋白濃度測(cè)定SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳ECL檢測(cè)封閉二抗一抗洗滌洗滌掃描分析轉(zhuǎn)膜操作步驟1.細(xì)胞總蛋白提取及定量2.配膠3.制膠 先用1ml槍頭小心鋪12%分離膠，上加少許ddH2O，待分離膠干凝后，倒去ddH2O ，用濾紙吸干。再鋪8%濃縮膠，注意不要產(chǎn)生氣泡，斜

9、插上梳子，待膠干后備用，拔去梳子。4.上樣 所有上樣孔均加樣，沒有樣本，用上樣緩沖液代替。5.電泳 取40 g蛋白經(jīng)8%濃縮膠電泳80V 30min，12%分離膠電泳110V 90min。6.轉(zhuǎn)膜 電泳結(jié)束后，切除濃縮膠，按照負(fù)極-3張濾紙-分離膠-PVDF濾膜-3張濾紙-正極的順序，組裝電轉(zhuǎn)膜體系，100V 轉(zhuǎn)膜25min。操作步驟7.PVDF膜的免疫學(xué)檢測(cè) PVDF膜經(jīng)5%脫脂奶室溫封閉1 h一抗4溫和震蕩過夜TBST洗滌三次HRP標(biāo)記二抗室溫溫育1 hTBST洗滌三次后，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)8.結(jié)果分析 以GAPDH為內(nèi)參照，以靶蛋白/內(nèi)參照灰度的比值作為蛋白的相對(duì)表達(dá)含量

10、，進(jìn)行半定量檢測(cè)常見問題1.分離膠濃度 根據(jù)目的蛋白分子量選擇膠的濃度 蛋白分子量蛋白分子量 (kDa) 凝膠濃度凝膠濃度 (%) 4-40 20 12-45 15 10-70 12.5 15-100 10 25-200 8常見問題2. 在濃縮膠與分離膠之間有pH的不連續(xù)性,這是為了控制慢離子的解離度,從而控制其有效遷移率.要求在樣品膠和濃縮膠中,慢離子較所有被分離樣品的有效遷移率低,以使樣品夾在快、慢離子界面之間,使樣品濃縮.而在分離膠中慢離子的有效遷移率比所有樣品的有效遷移率高,使樣品不再受離子界面的影響.常見問題3. 加入分離膠后，立即覆一層雙蒸水，一是為了使分離膠界面保持水平，用水就可以把它壓平，使蛋白質(zhì)分子跑時(shí)在同一水平線上；二是阻止空氣中的氧氣對(duì)凝膠聚合的抑制作用。也可以覆蓋一層無水乙醇。常見問題4. 從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。膜兩邊的濾紙不能相互接觸，接觸后會(huì)發(fā)生短路6.電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)產(chǎn)熱，在槽的一邊放一塊冰來降溫7.切濾紙和膜時(shí)，一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染膜常見問題8.二抗的選擇根據(jù)一抗的種屬來源，如：一抗是兔抗大鼠目的蛋白的抗體，則二抗應(yīng)選擇山羊或其他來源抗兔的抗體，而且二抗要標(biāo)記有同位素或酶。9.條帶兩邊擴(kuò)散：加樣量