HER2基因擴(kuò)增FISH 典型特殊案例分享

1、NP-BIO-2015.02-008 Valid Until 2017.02聲明聲明 本本幻燈片僅以學(xué)術(shù)交流為幻燈片僅以學(xué)術(shù)交流為目的。目的。處方請(qǐng)參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理處方請(qǐng)參考國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)的藥品說(shuō)明書總局批準(zhǔn)的藥品說(shuō)明書。專業(yè)資料，僅供醫(yī)藥衛(wèi)生專業(yè)人士參考 背 景u 對(duì)來(lái)自同一中心的病例（病例數(shù)1700）進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)將近10%的原位雜交結(jié)果呈現(xiàn)異常信號(hào)形式1。u 對(duì)其中最常見的形式進(jìn)行了闡釋，為診斷者提供了報(bào)告指南，并對(duì)未來(lái)的研究提出了建議。u “典型的特殊情況” 一致性管理，使最終可以得到分子及生物化學(xué)證據(jù)的支持。1. Am J Clin Pathol 2012;13

2、7:595-605HER2 檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)流程流程圖FISH 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) ASCO/CAP于2013年10月聯(lián)合發(fā)布了新版乳腺癌HER2檢測(cè)指南1,2 中華病理學(xué)雜志于2014年4月發(fā)布了新版中國(guó)乳腺癌HER2檢測(cè)指南31. Journal of Clinical Oncology. 2013 Oct 7. Epub ahead of print2. Arch Pathol Lab Med. 2013 Oct 7. Epub ahead of print3. 中華病理學(xué)雜志2014年4月第43卷第4期FISH 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 中國(guó)乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2014版）1：1. 中華病理學(xué)雜志2014年4月第4

3、3卷第4期FISH 評(píng)判標(biāo)準(zhǔn) 中國(guó)乳腺癌HER2檢測(cè)指南（2014版）1：1. 中華病理學(xué)雜志2014年4月第43卷第4期Note 本幻燈收錄的病例，均發(fā)表于ASCO/CAP指南（2013）和中國(guó)指南（2014）發(fā)表之前 原作者在討論病例時(shí)，仍然使用了舊版指南中的FISH判讀標(biāo)準(zhǔn)。但是新舊指南的變化并不影響作者的結(jié)論。 為保證論述的完整性，本幻燈仍然保留原作者的討論原文。 讀者在閱讀時(shí)，應(yīng)對(duì)新舊指南的變化予以注意。異質(zhì)性擴(kuò)增11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605A，圖中顯示的是兩組獨(dú)立的腫瘤細(xì)胞群（由虛線隔開）；一組明顯無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，表明HER2基因的缺失（黃

4、色箭頭所示），另外一組的HER2/CEP17比率值2.2，表現(xiàn)為基因擴(kuò)增（白色箭頭所示）。病例1：簡(jiǎn)單的異質(zhì)性擴(kuò)增在該病例中，來(lái)自同一組織的腫瘤細(xì)胞，于腫瘤組織切片內(nèi)，腫瘤細(xì)胞可能會(huì)立即緊挨放置或在各自的腫瘤區(qū)域內(nèi)。一組很明顯無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象，另一組的HER2/CEP17比值大于2.2，明顯說(shuō)明基因擴(kuò)增。Solution評(píng)分建議詮 釋報(bào)告建議至少計(jì)算每區(qū)域中的20個(gè)腫瘤細(xì)胞該腫瘤包含兩個(gè)獨(dú)立的乳腺腫瘤克隆體，其中一個(gè)呈現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增現(xiàn)象，另外一個(gè)無(wú)擴(kuò)增現(xiàn)象。將該病例稱為呈現(xiàn)“異質(zhì)性擴(kuò)增”的HER2擴(kuò)增模式，在報(bào)告中分別列出兩組的HER2/CEP17比值。Solution“混合”11. Am J

5、Clin Pathol 2012;137:595-605B，HER2基因和CEP17拷貝數(shù)都有所增加，擴(kuò)增（HER2/CEP17比率值2.2，白色箭頭所示）和非擴(kuò)增細(xì)胞看起來(lái)混合在一起，分散在腫瘤區(qū)域。有些細(xì)胞的比率正常，有些擴(kuò)增明顯，但是不可能將兩個(gè)分開的區(qū)域區(qū)分開來(lái)。病例2：復(fù)雜的異質(zhì)性擴(kuò)增“混合”的擴(kuò)增和非擴(kuò)增腫瘤細(xì)胞在該病例中，擴(kuò)增和非擴(kuò)增細(xì)胞看起來(lái)混合在一起，并分撒在腫瘤區(qū)域內(nèi)。有些細(xì)胞看起來(lái)正常，一些明顯擴(kuò)增，但是無(wú)法區(qū)別兩個(gè)不同的區(qū)域。Solution評(píng)分建議詮 釋報(bào)告建議計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)域的60個(gè)細(xì)胞，并在一張報(bào)告單上分別記錄擴(kuò)增和非擴(kuò)增細(xì)胞數(shù)目。該腫瘤包含混合的乳腺癌克隆體，一個(gè)呈

6、現(xiàn)HER2基因擴(kuò)增現(xiàn)象，另一個(gè)呈現(xiàn)非擴(kuò)增現(xiàn)象。將該病例稱為潛在的“混合異質(zhì)性擴(kuò)增模式”，并列出每個(gè)計(jì)數(shù)細(xì)胞的HER2/CEP17比值平均值（或在不區(qū)分?jǐn)U增/非擴(kuò)增的前提下列出每個(gè)區(qū)域的R2/CEP17比值平均值）。然而，雖然現(xiàn)有的數(shù)據(jù)顯示小百分比的擴(kuò)增細(xì)胞并不足以說(shuō)明HER2擴(kuò)增的存在，也要列出混合腫瘤群體中擴(kuò)增細(xì)胞（比值2.2）的百分比。根據(jù)當(dāng)下的指南，對(duì)于這些病例，當(dāng)所有計(jì)數(shù)細(xì)胞的HER2/CEP17比值平均值過(guò)2.2時(shí)，可以稱之為有HER2擴(kuò)增現(xiàn)象。Solution孤立擴(kuò)增的癌細(xì)胞11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C，在非擴(kuò)增細(xì)胞占主導(dǎo)地位的背景下

7、，我們可以看到一個(gè)孤立的擴(kuò)增細(xì)胞（白色箭頭所示），擴(kuò)增水平較高（比率值3.0）。病例3：孤立擴(kuò)增的癌細(xì)胞在該病例中，在非擴(kuò)增細(xì)胞占腫瘤組織主導(dǎo)地位的大背景下，出現(xiàn)比率值明顯較大（比值3.0）的孤立細(xì)胞。值得注意的是，擴(kuò)增細(xì)胞中的信號(hào)顯而易見，真實(shí)可靠，沒有人為處理的痕跡。也許可以逼真地人為模仿一些信號(hào)，但多波長(zhǎng)的熒光信號(hào)（即自熒光）則難以模仿。因此，對(duì)之評(píng)價(jià)前，應(yīng)該確保這些信號(hào)在4，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚示蹤劑下或液體過(guò)濾器下不顯綠色。如果這些信號(hào)是真的，就應(yīng)該計(jì)數(shù)。Solution只有在細(xì)胞明顯擴(kuò)增的情況下才能記錄孤立擴(kuò)增癌細(xì)胞的存在。該類細(xì)胞的預(yù)后價(jià)值尚不明確，但是當(dāng)下的證據(jù)表明，

8、 百分比較?。?0%）的情況下，其對(duì)結(jié)果沒有影響。列出所有計(jì)數(shù)細(xì)胞的HER2/CEP17比值平均值，并根據(jù)該值進(jìn)行全面的診斷（擴(kuò)增或非擴(kuò)增）。例如，在該病例中，HER2基因?yàn)榉菙U(kuò)增。評(píng)分建議詮 釋報(bào)告建議對(duì)區(qū)域內(nèi)的擴(kuò)增或非擴(kuò)增細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分時(shí)，應(yīng)該公正評(píng)價(jià)，不偏不倚。該腫瘤可能會(huì)包含HER2擴(kuò)增的孤立細(xì)胞，其顯著性目前尚未明了。然而，當(dāng)下的證據(jù)表明其對(duì)預(yù)后影響有限。我們對(duì)之的完全意義尚不明確。研究建議人們認(rèn)為，獲取足夠的證據(jù)來(lái)支撐該孤立癌細(xì)胞的預(yù)后影響是不大可能的。對(duì)該類細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)的單細(xì)胞分析，可能會(huì)得到一些信息（運(yùn)用激光捕獲纖維切割），但仍無(wú)法闡明其對(duì)患者疾病進(jìn)程的影響。 Solution

9、整條17號(hào)染色體的缺失11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605A和B ，腫瘤細(xì)胞都只帶有HER2和CEP17的信號(hào)，暗示整條17號(hào)染色體區(qū)域的完全缺失。病例4：整條17號(hào)染色體的缺失在該病例中，在整個(gè)腫瘤細(xì)胞視野范圍內(nèi)僅可觀察到HER2和染色體17CEP信號(hào)；實(shí)際上，看起來(lái)每個(gè)細(xì)胞都缺失一塊整條17號(hào)染色體的區(qū)域。仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn)，相毗鄰的正常細(xì)胞仍有1到2個(gè)CEP17和HER2信號(hào)。17號(hào)染色體CEP的拷貝數(shù)目平均值為1.02（標(biāo)準(zhǔn)差，0.13），HER2基因的拷貝數(shù)目平均值為1.06（標(biāo)準(zhǔn)差，0.25）；HER2/CEP 17比值為1.05.Solution評(píng)

10、分建議詮 釋報(bào)告建議根據(jù)英國(guó)相關(guān)指南進(jìn)行評(píng)分。盡管該病例異常，很明顯，這是一個(gè)非擴(kuò)增腫瘤的例子。將該病例稱之為HER2非擴(kuò)增現(xiàn)象，并附上單倍體或17號(hào)染色體缺失的可能性。研究建議可以運(yùn)用比較基因組雜交（CGH）檢測(cè)缺失的亞染色體區(qū)域，該區(qū)域的缺失可能會(huì)導(dǎo)致HER2和CEP17的缺失。SolutionCEP17 信號(hào)缺失111. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C 和D，顯示的是腫瘤細(xì)胞中，HER2拷貝數(shù)正常，而17號(hào)染色體CEP信號(hào)缺失的現(xiàn)象。結(jié)果為臨界的HER2基因擴(kuò)增。病例5在該病例中，腫瘤細(xì)胞缺失17號(hào)染色體CEP信號(hào)（又可看到毗鄰的正常細(xì)胞呈現(xiàn)正常的信

11、號(hào)模式）。HER2拷貝數(shù)正常，僅可觀察到17號(hào)染色體CEP17信號(hào)的缺失。結(jié)果是，HER2基因擴(kuò)增與否不大明確，HER2拷貝數(shù)目平均值為1.98（標(biāo)準(zhǔn)差，0.62），CEP17拷貝數(shù)的平均值為1.02（標(biāo)準(zhǔn)差，0.13）；HER2/CEP17 比值為1.95。計(jì)數(shù)的60個(gè)細(xì)胞中，該病例可稱之為“臨界但非擴(kuò)增”現(xiàn)象，根據(jù)美國(guó)臨床腫瘤學(xué)協(xié)會(huì)/美國(guó)病理學(xué)家研究院指南，該病例可稱之為不確定。如果60個(gè)細(xì)胞中，有6個(gè)（10%）及以上細(xì)胞的HER2/CEP17比值為2.20，即使每個(gè)細(xì)胞中HER2拷貝數(shù)平均值小于2，根據(jù)美國(guó)病理學(xué)家研究院指南，也將之視為呈現(xiàn)異質(zhì)性HER2基因擴(kuò)增現(xiàn)象。 然而，相關(guān)研究結(jié)果

12、顯示，HER2/CEP17比值為2.2及以上的細(xì)胞數(shù)高達(dá)30%時(shí)，對(duì)結(jié)果沒有影響Solution評(píng)分建議詮 釋從HER2/CEP17比值來(lái)看，該病例為非擴(kuò)增腫瘤。HER2復(fù)制水平低下，是否出現(xiàn)如例4所示的整條17號(hào)染色體缺失，尚不明確一條染色體上帶有CEP17衛(wèi)星的特定著絲粒區(qū)域缺失與否也有待查明。很可能這是染色體重排和失衡的結(jié)果。其它可能性（也可見于細(xì)胞遺傳學(xué)中的其它實(shí)體瘤）包括1條17號(hào)染色體的缺失（17號(hào)染色體長(zhǎng)臂上一個(gè)等臂染色體的形成）和不平衡置換（保留包含17q物質(zhì)和HER2核心的衍生染色體）低水平“擴(kuò)增”的小百分比(30%)細(xì)胞的存在，沒有顯著性差異，不予以報(bào)告。呈現(xiàn)17號(hào)單倍體的

13、病例對(duì)曲妥珠單抗的反應(yīng)性較差。因?yàn)槠錇榈退綌U(kuò)增事件，至少要計(jì)數(shù)60個(gè)細(xì)胞。Solution報(bào)告建議根據(jù)擴(kuò)大細(xì)胞計(jì)數(shù)量，使之不少于60得到的結(jié)果，該病例可稱為非擴(kuò)增現(xiàn)象?？梢栽诟戒浿凶⒚鰿EP17正常的計(jì)數(shù)。比值2.2的小數(shù)量細(xì)胞的出現(xiàn)無(wú)明顯差異，不應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行報(bào)告。研究建議進(jìn)行大批比較基因組雜交/多重連接探針擴(kuò)增 (CGH/ MLPA) 來(lái)測(cè)定17號(hào)染色體的拷貝數(shù)和HER2基因擴(kuò)增的地位。 SolutionCEP17信號(hào)的缺失211. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605 A 和 B ，腫瘤細(xì)胞中僅有一個(gè)CEP17的拷貝體，然而，HER2拷貝數(shù)增加，導(dǎo)致擴(kuò)增比值

14、。病例6在該病例中，CEP17的出現(xiàn)與例5具有可比性，暗示腫瘤細(xì)胞中1個(gè)CEP17信號(hào)的缺失（再次與呈現(xiàn)正常信號(hào)模式的正常細(xì)胞毗鄰）。信號(hào)缺失或減少僅涉及CEP17信號(hào)；然而，該病例中也呈現(xiàn)出HER2拷貝數(shù)目的增加。結(jié)果為，HER2基因擴(kuò)增，HER2的拷貝數(shù)目平均值為5.75（標(biāo)準(zhǔn)差，0.9），CEP17拷貝數(shù)為1（標(biāo)準(zhǔn)差，0.0）；HER2/CEP17比值為5.75。Solution從HER2/CEP17比值看，很顯然，其為擴(kuò)增細(xì)胞。是否出現(xiàn)如例5所示的整條染色體缺失（HER2在剩下的染色體上擴(kuò)增），或是否有特定的著絲粒區(qū)域缺失（在一條染色體包含CEP17衛(wèi)星），尚不清楚。如果后者正確，該類

15、型的病例中不包括真正擴(kuò)增。然而，我們當(dāng)今的觀點(diǎn)是，這代表了帶有HER2基因擴(kuò)增的17號(hào)染色體單倍體數(shù)目的減少由于染色體組型高度復(fù)雜，17號(hào)染色體長(zhǎng)臂多次拷貝，HER2擴(kuò)增可出現(xiàn)在保留的染色體上或增加拷貝的HER2基因。沒有證據(jù)表明計(jì)數(shù)多余的細(xì)胞會(huì)改變?cè)\斷結(jié)果，根據(jù)指南計(jì)數(shù)至少20個(gè)細(xì)胞。評(píng)分建議詮 釋Solution該病例為HER2基因擴(kuò)增，并列出HER2/CEP17比值，應(yīng)在附錄注上異常CEP17出現(xiàn)的計(jì)數(shù)。報(bào)告建議研究建議可以進(jìn)行一系列的CGH/MLPA 來(lái)決定17號(hào)染色體數(shù)目的拷貝數(shù)和HER2基因擴(kuò)增的地位。應(yīng)視方案的不同，對(duì)CGH進(jìn)行區(qū)別。SolutionCEP17信號(hào)完全缺失11.

16、Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C 和D，CEP17信號(hào)在腫瘤細(xì)胞中看不到，然而，在正常細(xì)胞中可見(箭頭所示)，在該病例中，HER2擴(kuò)增地位僅由HER2拷貝數(shù)決定。病例7在該病例中，腫瘤細(xì)胞中，所有的CEP17信號(hào)完全缺失；注意一個(gè)重要的對(duì)照是正常細(xì)胞中含CEP17。只有當(dāng)正常細(xì)胞中出現(xiàn)CEP17信號(hào)的時(shí)候才可以明確的做出CEP17缺失的診斷。如果正常細(xì)胞中沒有CEP17信號(hào)，則是原位雜家評(píng)價(jià)的技術(shù)失誤。因?yàn)闆]有CEP17，則無(wú)法得到HER2/CEP17比值，這無(wú)疑帶來(lái)了些許挑戰(zhàn)。HER2的平均拷貝數(shù)為6.8 /細(xì)胞(標(biāo)準(zhǔn)差，1.78)。Solution推薦所

17、有病例使用CEP17，而不推薦使用單一的拷貝熒光原位雜交 FISH。曲妥珠單抗大型期試驗(yàn)的報(bào)告結(jié)果都不是以拷貝數(shù)目來(lái)記錄的，相關(guān)研究也說(shuō)明拷貝數(shù)目在HER2基因擴(kuò)增指導(dǎo)中作用不大。然而，在極少數(shù)情況下，當(dāng)染色體的著絲粒區(qū)域缺失時(shí)，建議以大于等于6的拷貝數(shù)來(lái)記錄缺失CEP17區(qū)域的HER2擴(kuò)增現(xiàn)象。這并不是最佳的記錄方法，而且不能根據(jù)以往的證據(jù)，延伸到非缺失CEP17的病例。然而，在這些特殊的病例中，當(dāng)下并不推薦分析CEP17評(píng)分建議詮 釋計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞中的HER2基因拷貝數(shù)。證據(jù)表明診斷結(jié)果與計(jì)數(shù)細(xì)胞多少無(wú)關(guān)。根據(jù)指南計(jì)數(shù)細(xì)胞的最小值為20。Solution報(bào)告建議僅根據(jù)HER2基因拷貝數(shù)（僅當(dāng)

18、HER2基因數(shù)目6/細(xì)胞時(shí)），將該病例為擴(kuò)增。并做個(gè)注釋以說(shuō)明和所有細(xì)胞中的CEP17信號(hào)缺失。報(bào)告建議研究建議進(jìn)行大批的CGH/MLPA 可以闡明基因損傷導(dǎo)致的CEP17信號(hào)缺失，并決定HER2基因擴(kuò)增地位的有無(wú)。使用替代17號(hào)染色體的探針（端粒探針）進(jìn)行熒光原位雜交FISH分析也具有一定的價(jià)值。Solution信號(hào)重疊共存11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605HER2和 CEP17拷貝數(shù)目很高。 A和B，HER2和CEP17 的拷貝數(shù)目非常高，信號(hào)重疊共存，呈現(xiàn)出黃色融合信號(hào)。病例 8該病例中，細(xì)胞內(nèi)呈大量的HER2和CEP17共存的信號(hào)模式，用三帶通濾

19、波器觀察時(shí)，紅綠融合的信號(hào)呈黃色。在高強(qiáng)度下，可以觀察到紅綠信號(hào)重疊。使用單帶通濾波器，可以確認(rèn)信號(hào)的重疊共存 并排除人為因素 (熒光通過(guò)所有的帶寬)。對(duì)該病例進(jìn)行詮釋有些困難，因?yàn)槠銱ER2/CEP17 比值為1.04，HER2和CEP17信號(hào)的計(jì)數(shù)平均值分別為24.3和23.43，根據(jù)傳統(tǒng)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)為非擴(kuò)增。然而，HER2/CEP1的高拷貝值卻意味著該病例高度異常。Solution評(píng)分建議詮 釋用單色過(guò)濾器對(duì)HER2和CEP17信號(hào)進(jìn)行評(píng)分，注意區(qū)域內(nèi)細(xì)胞的匹配，以確保紅綠信號(hào)的精確計(jì)數(shù)。根據(jù)指南計(jì)數(shù)至少20個(gè)細(xì)胞；計(jì)數(shù)多余的細(xì)胞不可能改變?cè)\斷結(jié)果。其為異常病例，因?yàn)榧词笻ER2/CEP17比

20、值表現(xiàn)為非擴(kuò)增模式，HER2和CEP17都有很高的拷貝數(shù)。鑒于有證據(jù)表明HER2/CEP17擴(kuò)增子的程度不同，11我們認(rèn)為，這些病例可能代表了HER2擴(kuò)增子擴(kuò)展到CEP17著絲粒外圍區(qū)域。我們認(rèn)為這些罕見的病例解釋為擴(kuò)增現(xiàn)象。信號(hào)模式可解釋為HER2擴(kuò)增子延伸到著絲粒，并整合了著絲粒周邊區(qū)域，導(dǎo)致了CEP17信號(hào)與HER2信號(hào)的重疊共存。已有初步證據(jù)證明，帶有擴(kuò)展HER2擴(kuò)增子的患者可能會(huì)對(duì)曲妥珠單抗12的反應(yīng)敏感性降低；然而，該假設(shè)還未得到進(jìn)一步證實(shí)。Solution該病例應(yīng)稱之為基于HER2拷貝數(shù)的著絲點(diǎn)和相關(guān)平衡的CEP17拷貝數(shù)的共擴(kuò)增，并在報(bào)告中注明HER2 和CEP17信號(hào)的重疊共

21、存現(xiàn)象。報(bào)告建議研究建議要對(duì)一系列此類病例進(jìn)行CGH/MLPA，以驗(yàn)證CEP17和HER2重疊共存的設(shè)想。Solution信號(hào)分離11. Am J Clin Pathol 2012;137:595-605C和D，HER2和CEP17的拷貝數(shù)都增加了，但信號(hào)分離。病例 9在該病例中，HER2 和CEP17的拷貝數(shù)很高，但呈現(xiàn)的是非重疊的分離信號(hào)。從HER2/CEP17比值看，為非擴(kuò)增模式 (1.12)；然而，此圖卻顯示，HER2 和 CEP17的拷貝數(shù)目皆有升高，分別為7.45和6.65。Solution因?yàn)镠ER2/CEP17 比值顯示為非擴(kuò)增，該病例解釋起來(lái)可能看似簡(jiǎn)單直接；然而；HER2和 CEP17 信號(hào)卻顯示較高的拷貝數(shù)。HER2 拷貝數(shù)目6（較為多見，但不大整齊一致），則提示HER2擴(kuò)增現(xiàn)象，通過(guò)單一拷貝計(jì)數(shù)法分析， 則將之稱為擴(kuò)增現(xiàn)象。從遺傳學(xué)角度看，HER2和CEP17拷貝數(shù)目增加到該水平，明顯而平衡，其根本機(jī)制尚不清楚，但也不可能反映出17號(hào)染色體的多個(gè)完整無(wú)缺的復(fù)制。而因?yàn)檫@些病例的真正的分子機(jī)制不確定性，在解讀FISH結(jié)果時(shí)，仍有做出錯(cuò)誤診斷的巨大空間。在缺失明確證據(jù)（如HER2/CEP17信號(hào)共存）證明HER2/CEP17信號(hào)共擴(kuò)增時(shí)，很難認(rèn)定其為真正的HER2擴(kuò)增現(xiàn)象。事實(shí)上，這些病例可能代表