發(fā)酵工藝綜合實(shí)驗(yàn)

1、發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)生命科學(xué)技術(shù)系生命科學(xué)技術(shù)系發(fā)酵工程綜合實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程綜合實(shí)驗(yàn)2012.05發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) - -酵母的液體發(fā)酵酵母的液體發(fā)酵發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) - -黑曲霉的固體發(fā)酵黑曲霉的固體發(fā)酵發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容內(nèi)容 本次實(shí)驗(yàn)分本次實(shí)驗(yàn)分酵母的液體發(fā)酵酵母的液體發(fā)酵和和黑曲霉固體發(fā)酵黑曲霉固體發(fā)酵兩兩個內(nèi)容；以個內(nèi)容；以實(shí)驗(yàn)小組實(shí)驗(yàn)小組為單位，為單位，分發(fā)、清洗分發(fā)、清洗本小組實(shí)驗(yàn)本小組實(shí)驗(yàn)所需要玻璃儀器、結(jié)束后清洗回收；所需要玻璃儀器、結(jié)束后清洗回收；配制配制本小組所需本小組所需基本試劑。基本試劑。準(zhǔn)備準(zhǔn)備 每班選

2、出每班選出1-21-2個同學(xué)跟著實(shí)驗(yàn)室個同學(xué)跟著實(shí)驗(yàn)室毛會麗毛會麗老師準(zhǔn)備老師準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)，配制試劑，活化菌種，準(zhǔn)備時間段在第十五周。實(shí)驗(yàn)，配制試劑，活化菌種，準(zhǔn)備時間段在第十五周。選出人員后報(bào)與毛會麗老師。選出人員后報(bào)與毛會麗老師。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)分組分組 每個實(shí)驗(yàn)室由班長總負(fù)責(zé)，分為每個實(shí)驗(yàn)室由班長總負(fù)責(zé)，分為2 2大組大組； 每一每一大組分大組分2 2小組小組，自由組合分別作液體、固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；，自由組合分別作液體、固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)；分組名單由班長報(bào)給輔導(dǎo)老師，向輔導(dǎo)老師分組名單由班長報(bào)給輔導(dǎo)老師，向輔導(dǎo)老師留聯(lián)系留聯(lián)系方式方式。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) -液體發(fā)

3、酵液體發(fā)酵v實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膙實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)材料和器材v實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容v作業(yè)及思考題作業(yè)及思考題實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)一 酵母的液體搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)酵母的液體搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)掌握液體發(fā)酵種子液的制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)及掌握液體發(fā)酵種子液的制備和搖瓶發(fā)酵技術(shù)及方法方法掌握總糖和還原糖含量的測定方法掌握總糖和還原糖含量的測定方法掌握常用的比色分析方法的操作技術(shù)掌握常用的比色分析方法的操作技術(shù)熟悉酵母菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法熟悉酵母菌的微生物學(xué)特性及培養(yǎng)方法 一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊弧?shí)驗(yàn)?zāi)康陌l(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)二、實(shí)驗(yàn)材料和試劑配制方法二、實(shí)驗(yàn)材料和試劑配制方法1.1.實(shí)驗(yàn)菌種：酵母菌實(shí)驗(yàn)菌種：

4、酵母菌菌絲顯微照片菌絲顯微照片平板照片平板照片發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)2.2.實(shí)驗(yàn)儀器：實(shí)驗(yàn)儀器：玻璃試管、試管架、吸管（玻璃試管、試管架、吸管（1mL1mL，2mL2mL，10mL10mL）、吸耳球、容量瓶、燒杯、三角瓶（）、吸耳球、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 mL250 mL，500mL500mL）、量筒（）、量筒（250mL250mL，500mL500mL，1000mL1000mL）、玻璃棒、）、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、試紙、塑料漏斗、電爐、接種鏟（針）、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫箱、臺秤等。恒溫箱、臺秤等。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)3.3.培養(yǎng)基培養(yǎng)基(1)(1)

5、斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基麥芽汁培養(yǎng)基：10o麥芽汁麥芽汁100mL，瓊脂，瓊脂2g(2%)， 加熱加熱煮沸溶解，蒸發(fā)所失體積用水補(bǔ)足，定容至煮沸溶解，蒸發(fā)所失體積用水補(bǔ)足，定容至100mL。PDAPDA培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：取去皮馬鈴薯取去皮馬鈴薯20g20g，切成小塊，加水，切成小塊，加水100mL100mL。微沸微沸30min30min，用紗布過濾，加，用紗布過濾，加2g2g葡萄糖，加熱煮沸后加葡萄糖，加熱煮沸后加入入2g2g瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水，定容至瓊脂，繼續(xù)加熱融化并補(bǔ)足失水，定容至100mL100mL。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)(2)(2)種子培養(yǎng)基：種子培養(yǎng)基：10麥芽汁

6、，麥芽汁，pH5.0或或葡萄糖葡萄糖10%，玉米漿玉米漿1%，尿素，尿素0.2%，pH5.0。(3)(3)發(fā)酵培養(yǎng)基：發(fā)酵培養(yǎng)基：玉米粉經(jīng)液化、糖化，折合葡萄糖玉米粉經(jīng)液化、糖化，折合葡萄糖濃度為濃度為10%，玉米漿，玉米漿1%，硫酸銨，硫酸銨0.4%，pH5.5。裝量：裝量：30mL/250mL發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)4.4.試劑的配制試劑的配制(1) 1mg/mL1mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取100mg100mg分析純葡萄分析純葡萄糖，置于小燒杯中用少量的蒸餾水溶解后，定容轉(zhuǎn)移糖，置于小燒杯中用少量的蒸餾水溶解后，定容轉(zhuǎn)移到到100mL100mL的容量瓶中，以蒸餾

7、水定容至刻度，搖勻，的容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度，搖勻，冰箱保存?zhèn)溆?。（冰箱保存?zhèn)溆?。（每小組！每小組?。?DNS試劑：試劑：稱取稱取20.00g 3,5-二硝基水楊酸溶解于二硝基水楊酸溶解于1.5L水，一邊不斷地?cái)嚢枰贿呏饾u加入水，一邊不斷地?cái)嚢枰贿呏饾u加入32.0gNaOH，讓其溶解。然后逐漸加入苯酚讓其溶解。然后逐漸加入苯酚10g，亞硫酸鈉，亞硫酸鈉10g，酒石酸鉀鈉酒石酸鉀鈉600g，加熱至，加熱至45，冷卻后在，冷卻后在2.0L的容量的容量瓶中定容。室溫存放在棕色瓶中。（瓶中定容。室溫存放在棕色瓶中。（已經(jīng)配制！已經(jīng)配制?。┌l(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)(3) 酚酞指示劑：酚酞指示劑：稱

8、取稱取5g酚酞，溶于酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。乙醇中。(4)6moL/L HCL: 先于先于1000mL容量瓶中加入約容量瓶中加入約200mL蒸蒸餾水，然后取餾水，然后取540mL濃鹽酸沿瓶壁濃鹽酸沿瓶壁緩慢緩慢加入，加水定容加入，加水定容至至1000mL。(5)6moL/L NaOH ：稱取稱取240g NaOH ，溶于，溶于800mL 蒸蒸餾水中，待散熱冷卻后，加水定容至餾水中，待散熱冷卻后，加水定容至1000mL。（每個實(shí)驗(yàn)室！每個實(shí)驗(yàn)室?。┌l(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)三、三、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容搖瓶酵母的接種與培養(yǎng)搖瓶酵母的接種與培養(yǎng)總糖含量的測定總糖含量的測定還原糖含量的測定還原糖

9、含量的測定pH值的測定值的測定發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) 無菌條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中，刮無菌條件下，從冷藏的產(chǎn)生菌的斜面孢子中，刮取適量孢子涂在取適量孢子涂在PDAPDA斜面上，然后置斜面上，然后置28-3028-30的恒溫箱的恒溫箱培養(yǎng)培養(yǎng)2-3d2-3d。斜面菌種的制備斜面菌種的制備內(nèi)容內(nèi)容1 1搖瓶酵母的接種與培養(yǎng)搖瓶酵母的接種與培養(yǎng)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)斜面培養(yǎng)基斜面培養(yǎng)基 按照按照 配方配方 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基 稱量稱量分裝分裝250mL250mL錐形瓶錐形瓶(50mL) (50mL) 加封口膜加封口膜 121下下滅菌滅菌30min冷卻備用冷卻備用 種子培養(yǎng)基種子培養(yǎng)基

10、置于超凈工作臺上置于超凈工作臺上種子培養(yǎng)基的制備種子培養(yǎng)基的制備發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)PDAPDA酵母酵母斜面斜面刮取刮取2-32-3環(huán)環(huán)菌體細(xì)胞懸浮液菌體細(xì)胞懸浮液 28搖床搖床 140rpm 培養(yǎng)培養(yǎng)2d搖瓶接種搖瓶接種 加入無菌水加入無菌水洗下細(xì)胞洗下細(xì)胞移液管吸移液管吸取孢子液取孢子液加入搖瓶加入搖瓶接種量接種量10%種子液種子液種子液制備流程種子液制備流程發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵培養(yǎng)物 接種量接種量10%種子液種子液發(fā)酵設(shè)置及培養(yǎng)發(fā)酵設(shè)置及培養(yǎng)140rpm 28 Ps：每個瓶子設(shè)一個平行：每個瓶子設(shè)一個平行發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵培養(yǎng)物發(fā)酵培養(yǎng)

11、物 取樣時間：取樣時間：0、8、16、24、32、40、48h測定：測定：pH、總糖含量、還原糖含量、總糖含量、還原糖含量注意！注意！0h培養(yǎng)液要留一部分放置冰箱作為菌體濃培養(yǎng)液要留一部分放置冰箱作為菌體濃度測定的度測定的對照對照。取樣和需測定的指標(biāo)取樣和需測定的指標(biāo)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容內(nèi)容2 2 總糖與還原糖含量的測定總糖與還原糖含量的測定DNSDNS法法發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) 取取2.5mL2.5mL發(fā)酵上清液，加入裝有發(fā)酵上清液，加入裝有5mL6moL/L HCL5mL6moL/L HCL及及10mL10mL蒸餾水的蒸餾水的50mL50mL的三角瓶中，微沸加熱水解的三角瓶中，微

12、沸加熱水解30min30min。待。待三角瓶冷卻后，加入三角瓶冷卻后，加入1 1滴酚酞指示劑，以滴酚酞指示劑，以6moL/L NaOH6moL/L NaOH中中和至微紅色，將水解液全部收集在和至微紅色，將水解液全部收集在50mL50mL的容量瓶中，用的容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為總糖待測液。蒸餾水定容至刻度，混勻，作為總糖待測液?？偺堑乃夂吞崛】偺堑乃夂吞崛∽⒁猓∽⒁?！微沸加熱水解時一定注意鍋內(nèi)的水不要燒干！微沸加熱水解時一定注意鍋內(nèi)的水不要燒干！發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)CW定容至定容至25mL0mL0.2mL0.4mL0.6mL0.8mL1.0mL1.2mL1mg/mL葡葡萄

13、糖標(biāo)準(zhǔn)液萄糖標(biāo)準(zhǔn)液沸水浴沸水浴5min后冷卻至室溫后冷卻至室溫540nm波長處比波長處比色，以色，以0管調(diào)零管調(diào)零 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制2.0mL1.8mL1.6mL1.4mL1.2mL1.0mL0.8mL加入加入1.5mLDNS后混勻后混勻注意！注意！測定前一定要檢測定前一定要檢查波長是否正確！查波長是否正確！發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)然后沸水浴然后沸水浴5分鐘，冷卻到室溫，于分鐘，冷卻到室溫，于540nm波長處進(jìn)行測定。波長處進(jìn)行測定?？偺呛瓦€原糖的測定總糖和還原糖的測定發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)計(jì)算公式計(jì)算公式 還原糖（還原糖（g/mL）=）樣品體積數(shù)（反應(yīng)體積）葡萄糖質(zhì)量（mlg

14、總糖（總糖（g/mL）=）樣品體積數(shù)（反應(yīng)體積水解體積）葡萄糖質(zhì)量（mlg 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)內(nèi)容內(nèi)容3 3 pHpH值的測定值的測定 將發(fā)酵液混勻后，用玻璃將發(fā)酵液混勻后，用玻璃棒沾取發(fā)酵液，用棒沾取發(fā)酵液，用4.0-5.8或或5.5-9.0pH試紙檢測，測出發(fā)試紙檢測，測出發(fā)酵液的酵液的pH值。值。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)四四、作業(yè)及思考題作業(yè)及思考題1.1.觀察記錄酵母菌細(xì)胞液體發(fā)酵過程中發(fā)酵液的顏色，觀察記錄酵母菌細(xì)胞液體發(fā)酵過程中發(fā)酵液的顏色，粘度，菌絲形態(tài)以及氣味。粘度，菌絲形態(tài)以及氣味。2.2.測定酵母菌的簡單分批發(fā)酵中每次取樣中菌體細(xì)胞測定酵母菌的簡單分批發(fā)酵中每次取樣中

15、菌體細(xì)胞生長量、總糖和還原糖含量和生長量、總糖和還原糖含量和pHpH值，繪制發(fā)酵曲線。值，繪制發(fā)酵曲線。發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)二 木聚糖酶（木聚糖酶（XyLanaseXyLanase）固體發(fā)酵）固體發(fā)酵實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)原理實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)材料和器材實(shí)驗(yàn)內(nèi)容實(shí)驗(yàn)內(nèi)容作業(yè)及思考題作業(yè)及思考題發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) -固體發(fā)酵固體發(fā)酵發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)（1 1）熟悉實(shí)驗(yàn)室固體發(fā)酵技術(shù)）熟悉實(shí)驗(yàn)室固體發(fā)酵技術(shù)（2 2）觀察并記錄黑曲霉培養(yǎng)過程中菌種生長）觀察并記錄黑曲霉培養(yǎng)過程中菌種生長變化情況變化情況（3 3）掌握）掌握xyLanasexyLanase酶活力的測定方

16、法酶活力的測定方法一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康囊?、?shí)驗(yàn)?zāi)康陌l(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)在畜禽和水產(chǎn)動物在畜禽和水產(chǎn)動物腸道內(nèi)形成較高的腸道內(nèi)形成較高的粘度的食糜，不易粘度的食糜，不易被動物消化。被動物消化。 同時腸道粘度增加導(dǎo)致同時腸道粘度增加導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)蓄積，形營養(yǎng)物質(zhì)在腸道內(nèi)蓄積，形成富含養(yǎng)分的食糜，使得微成富含養(yǎng)分的食糜，使得微生物增殖，損害腸道黏膜正生物增殖，損害腸道黏膜正常形態(tài)與功能，還可導(dǎo)致腹常形態(tài)與功能，還可導(dǎo)致腹瀉和死亡率的增加。瀉和死亡率的增加。 導(dǎo)致動物采食量下降，導(dǎo)致動物采食量下降，妨礙消化液與底物的混妨礙消化液與底物的混合，從而阻止脂肪的消合，從而阻止脂肪的消化吸收化吸收 二、實(shí)驗(yàn)

17、原理二、實(shí)驗(yàn)原理發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)菌種：黑曲霉實(shí)驗(yàn)菌種：黑曲霉（Aspergillus niger）2.實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備實(shí)驗(yàn)儀器及設(shè)備玻璃試管、試管架、吸管（玻璃試管、試管架、吸管（1mL，2mL，10mL）、吸）、吸耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（耳球、離心管、容量瓶、燒杯、三角瓶（250 mL）、電）、電子分析天平、移液槍、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐等。子分析天平、移液槍、玻璃棒、試紙、塑料漏斗、電爐等。自動滅菌鍋、無菌間、超凈工作臺。自動滅菌鍋、無菌間、超凈工作臺。振蕩培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)，振蕩培養(yǎng)箱、分光光度計(jì)，三、實(shí)驗(yàn)材料三、實(shí)驗(yàn)材料發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)3.3.試

18、劑配制試劑配制1%（W/V）木聚糖底物）木聚糖底物 ：稱取稱取1.00g木聚糖加入木聚糖加入80mL預(yù)熱至預(yù)熱至80的蒸餾水中，再加熱至沸點(diǎn)，冷卻的蒸餾水中，再加熱至沸點(diǎn)，冷卻后定容至后定容至100mL，4保存?zhèn)溆?。保存?zhèn)溆谩?（每小組！每小組?。?0mg/mL木糖母液木糖母液 ：準(zhǔn)確稱取準(zhǔn)確稱取1.0000g分析純木糖，分析純木糖，用適量蒸餾水溶解，定容到用適量蒸餾水溶解，定容到100mL， 4保存?zhèn)溆?，保存?zhèn)溆茫脮r稀釋用時稀釋10倍。倍。（每小組！每小組?。┌l(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) 每個三角瓶（每個三角瓶（500mL500mL）麩皮）麩皮6g6g，玉米芯，玉米芯4g4g，以固水比為以固水

19、比為1:1.21:1.2的比例加入自來水，的比例加入自來水， pHpH自然。自然。 121121下滅菌下滅菌30min30min （裝量（裝量30ml/500ml30ml/500ml）4.4.發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌發(fā)酵培養(yǎng)基的配制與滅菌 發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容u發(fā)酵培養(yǎng)基接種發(fā)酵培養(yǎng)基接種u取樣及樣品處理取樣及樣品處理uXylanaseXylanase酶活測定酶活測定發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn) 超凈工作臺上，制備孢子懸液超凈工作臺上，制備孢子懸液( (50mL/250mL50mL/250mL) ) ，混勻后取混勻后取5mL5mL接入三角瓶中，于室溫培養(yǎng)接入三角瓶中，于室溫培養(yǎng)48h48h。發(fā)酵培養(yǎng)基接種發(fā)酵培養(yǎng)基接種發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)發(fā)酵工程實(shí)驗(yàn)取樣取樣取樣：取樣：0 0、2424、3232、4040、4848、5656、6464、72h72h測定：測定：xyLanasexyLanase的活力的活力 酶液浸提：采用四分取樣法，精確稱量樣品酶液浸提：采用四分取樣法，精確稱量樣品2g2g，40 40 用用25mL25mL蒸餾水浸提蒸餾水浸提4h4h，過濾，所得濾液作為，過濾，所得濾液作為待測酶樣待測酶