分解纖維素的微生物的分離公開課

1、關(guān)于分解纖維素的微生物的分離公開課現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第一頁，共30頁纖維素與纖維素酶1.纖維素 纖維素是一種由葡萄糖首尾相連而成的高分子化合物，是地球含量最豐富的多糖類物質(zhì)。一、基礎(chǔ)知識(shí) 植物的根、莖、葉等器官都含有大量的纖維素。其中棉花是自然界中纖維素含量最高的天然產(chǎn)物?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二頁，共30頁 土壤中某些微生物能夠產(chǎn)生纖維素酶,把纖維素分解為葡萄糖，后再利用?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第三頁，共30頁 纖維素是地球上含量最豐富的多糖類物質(zhì)，植物每年產(chǎn)生的纖維素超過70億噸，其中40%-60%能被土壤中能產(chǎn)生纖維素酶的微生物所利用，不會(huì)大量積累。 在草食性動(dòng)物等的消化道內(nèi)，也共生有分解纖維素的微生物，其原理

2、也是產(chǎn)生纖維素酶而分解纖維素，而人沒有分解纖維素的能力。 人類可應(yīng)用分解纖維素的微生物將秸稈等廢棄物轉(zhuǎn)變成酒精，用纖維素酶處理服裝面料等。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第四頁，共30頁2.纖維素酶 纖維素酶是一種復(fù)合酶，一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C1酶(外切酶)、CX酶(內(nèi)切酶)和葡萄糖苷酶，前兩種酶使纖維素分解成纖維二糖，第三種酶將纖維二糖分解成葡萄糖。纖維二糖C1酶、Cx酶葡萄糖苷酶葡萄糖纖維素現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第五頁，共30頁C1酶：外切酶，從糖鏈末端開始切掉兩個(gè)葡萄糖 分子，產(chǎn)生纖維二糖CX酶：內(nèi)切酶，使纖維素?cái)嗔殉善瑪?。葡萄糖苷酶：將纖維二糖分解成葡萄糖?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第六頁，共30頁取二支20mL的試管

3、實(shí)驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素的實(shí)驗(yàn)各加入一張濾紙條各加入pH4.8，物質(zhì)量為0.1mol/L的醋酸醋酸鈉緩沖液11ml和10ml甲 乙在乙試管中加入1mL纖維素酶兩支試管固定在錐形瓶中，放在140r/min的搖床上振蕩1h結(jié)果：乙試管的濾紙條消失 討論：乙試管的濾紙條為什么會(huì)消失？甲試管的作用是什么？現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第七頁，共30頁 剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。 （二）纖維素分解菌的篩選 當(dāng)我們在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時(shí)，剛果紅能與培養(yǎng)基中的纖維素形成紅色復(fù)合物。當(dāng)纖維素被纖維素酶分解后，剛果紅-纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中就會(huì)出現(xiàn)以纖維素

4、分解菌為中心的透明圈，這樣我們就可以通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第八頁，共30頁現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第九頁，共30頁二、實(shí) 驗(yàn) 設(shè) 計(jì)土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋 將樣品涂布在鑒別纖 維素分解菌的培養(yǎng)基上 篩選產(chǎn)生透 明圈的菌落現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十頁，共30頁分布環(huán)境1、土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境中操作步驟 生物與環(huán)境的互相依存關(guān)系，在富含纖維素的環(huán)境中纖維素分解菌的含量相對提高，因此從這種土壤中獲得目的微生物的幾率要高于普通環(huán)境。原因現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十一頁，共30頁實(shí)例：樹林中多年落葉形成的腐殖土，多年積累的枯枝敗葉等。討論:如果找不到合適的環(huán)境，可以將濾紙埋在土壤中，將濾紙埋在土壤中有

5、什么作用？你認(rèn)為濾紙應(yīng)該埋在土壤中多深？ 將濾紙埋在土壤中能使纖維素分解菌相對集中，實(shí)際上是人工設(shè)置纖維素分解菌生存的適宜環(huán)境。一般應(yīng)將濾紙埋于深約10cm左右的土壤中。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十二頁，共30頁2、選擇培養(yǎng) 增加纖維素分解菌的濃度，以確保能夠從樣品中分離所需要的微生物。 目的：制備選擇培養(yǎng)基：操作： 將土樣加入裝有30ml選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上，在一定溫度下震蕩培養(yǎng)12天，直至培養(yǎng)液變渾濁。也可重復(fù)選擇培養(yǎng)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十三頁，共30頁培養(yǎng)基成分分析現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十四頁，共30頁提示：自變量為培養(yǎng)基的種類，即普通培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基?？捎门Ｈ飧嗟鞍纂伺囵B(yǎng)基與之對照,或

6、者將纖維素改為葡萄糖。A、旁欄中的配方是液體培養(yǎng)基還是固體培養(yǎng)基？為什么？ 是液體培養(yǎng)基，原因是配方中無凝固劑（瓊脂）B、這個(gè)培養(yǎng)基對微生物是否具有選擇作用？如果具有，是如何進(jìn)行選擇的？有選擇作用，本配方中纖維素作為主要碳源，只有能分解纖維素的微生物可以大量繁殖。C、你能否設(shè)計(jì)一個(gè)對照實(shí)驗(yàn)，說明選擇培養(yǎng)基的作用現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十五頁，共30頁 說明：分析“纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基配方”可知，該配方中的酵母膏也能夠提供少量的碳源，因此其他微生物也能在該培養(yǎng)基中生長繁殖。只不過，由于酵母膏的含量極少，因此，只有以纖維素為碳源的微生物才能大量繁殖?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十六頁，共30頁 在選擇培養(yǎng)的條件下，可

7、以使那些能夠適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物得到迅速繁殖，而那些不適應(yīng)這種營養(yǎng)條件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到“濃縮”的作用。為什么選擇培養(yǎng)能夠“濃縮”所需的微生物？現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十七頁，共30頁將細(xì)菌涂布在只有尿素做氮源的選擇培養(yǎng)基上將細(xì)菌涂布在只有纖維素粉做碳源的選擇培養(yǎng)基上固體培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基篩選菌株選擇培養(yǎng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十八頁，共30頁思考：本實(shí)驗(yàn)的流程與課題2中的實(shí)驗(yàn)流程有哪些異同？ 本實(shí)驗(yàn)流程與課題2的流程的區(qū)別如下。課題2是將土樣制成的菌懸液直接涂布在以尿素為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基上，直接分離得到菌落。本課題通過選擇培養(yǎng)，使纖維素分解菌得到增殖后，再將菌液涂布在選擇培養(yǎng)基上。其他步

8、驟基本一致。 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第十九頁，共30頁按照課題1的稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋101107倍。3.梯度稀釋101102103104105106現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十頁，共30頁4.將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上（1）制備鑒別培養(yǎng)基:（2）涂布平板： 將稀釋度為104106的菌懸液各取0.1ml涂布到平板培養(yǎng)基上，30倒置培養(yǎng)?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十一頁，共30頁鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基(水溶性羧甲基纖維素鈉水溶性羧甲基纖維素鈉)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十二頁，共30頁方法一：先 ，再加入剛果紅進(jìn)行顏色反應(yīng)。方法二：在 時(shí)就加入剛果紅。培養(yǎng)微生物倒平板5.

9、剛果紅染色法 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落，一般即為分解纖維素的菌落?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十三頁，共30頁這兩種方法各有哪些優(yōu)點(diǎn)與不足？顏色反應(yīng)基本上是纖維素分解菌的作用操作繁瑣剛果紅會(huì)使菌落之間發(fā)生混雜操作簡便不存在菌落混雜問題1.產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈2.有些微生物能降解色素，形成明顯的透明圈?，F(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十四頁，共30頁在細(xì)菌分解尿素的化學(xué)反應(yīng)中，細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成了氨，氨會(huì)使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)，pH升高。在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，如果pH升高指示劑會(huì)變紅剛果紅可以與纖維素形成紅色復(fù)合物，當(dāng)纖維素被纖維素酶催化分解后紅色復(fù)合物無法形成，培養(yǎng)基上就會(huì)出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明

10、圈觀察菌落周圍是否有著色的環(huán)帶出現(xiàn)來鑒定尿素分解菌觀察菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈來篩選纖維素分解菌脲酶檢測法剛果紅染色法現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十五頁，共30頁方法一中NaCl溶液的作用？思考： 漂洗作用，洗去與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅，以免出現(xiàn)的透明圈不夠清晰。用這方法可以判斷酶活力的大小，實(shí)際上剛果紅是結(jié)合到培養(yǎng)基的多糖底物，但分解纖維素的細(xì)菌可以產(chǎn)生纖維素酶，能分解這個(gè)多糖底物成為單糖，這樣剛果紅就不能結(jié)合上去了，氯化鈉溶液就可以使結(jié)合不牢的剛果紅洗去，這樣就留下大大小小的透明圈，大的透明圈當(dāng)然分解纖維素的能就強(qiáng)！ 現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十六頁，共30頁 在產(chǎn)生明顯的透明圈的菌落，挑取并接種到纖維素分解菌的選擇培養(yǎng)基上，在300C 370C培養(yǎng)，可獲得純化培養(yǎng)。6、純化培養(yǎng)現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二十七頁，共30頁四、結(jié)果分析與評價(jià) 1.培養(yǎng)基的制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落 對照的培養(yǎng)基在培養(yǎng)過程中沒有菌落生長則說明培養(yǎng)基制作合格。 如果觀察到產(chǎn)生透明圈的菌落，則說明可能獲得了分解纖維素的微生物。 2.分離的結(jié)果是否一致 由于在土壤中細(xì)菌的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于真菌和放線菌的數(shù)量，因此最容易分離得到的是細(xì)菌。但由于所取土樣的環(huán)境不同，不同同學(xué)也可能得到真菌和放線菌等不同的分離結(jié)果。現(xiàn)在學(xué)習(xí)的是第二