RNA原位雜交技術的重要性

1、RNA原位雜交技術的重要性個基ESfr么時間"卄么組織的表及儲況，與研fiihgw的功fit密不可井.一粗檢測基因左達水平的方法育Morihem印逝、RNase保護分析、FLNA就檯雜交和靈兄實時定塑PCR.RNA匪忡來空技術不哽時間和空間袤達的研究哽制，井結果沒誠芭的有與無以及憔兇來農(nóng)云農(nóng)達的部位利強臥可以準確淸躺地反應基因表達的岸W*本硏究采用悝余交摂術*奮水稻莖尖分化前和付化睹殖個吋期來研究水轄開花謂捋網(wǎng)絡中附幕因與仍咤的上卜窟調粹關杲.4.2O.TFL2與水稻開花葛因之間的調控關系AITFL2可以結含到的啟動護繪轉錄區(qū)從B0抑制夷表達（Gtrnivuictal*2006；Ko

2、ukcTaa）2003：TaKadaSeial.i2003、Nakahig鷗hiKeiaL.2005?LiuCdal.2009：AdrianJei31.2（110；-此外”姒南芥中AlTFLi対開花過控何絡中的詐農(nóng)»因的喪達都能起到抑制作用"如噩円，AXCtMylnectar2006：Sungdal.2006=Finneyetal.t2007）然而住水稍開花調控網(wǎng)給中OtTFL2対開北相關竝囲的調控作用的研究未見報道，其是宵和在擬南芥中樣起到相同的調控機理井未為人宿所知，需步謀入研宛"通過本硏究的RHA原位雜交佶果得知*GsLLlsGftrf?和E劇在CK和TFL

3、2RNA1兩紐林料中的表達斌井未見有明顯的芳舁.泊期這二者町能不QsTFL2的下瀟¥因不«TFL：fiA接調控薛響；而可能是STFL2的下晞基囲找尖彷化前（27天）時GsTFL?對代CM起列卜調作用，城而押制JPCM的義達i另外，F(xiàn)皿在S8NCK比在ITURJJAi的衣達駅冇所變化，說陰鳳/%受OsTFL2的囲控、隹于QsTFL2的下游，即在莖尖分化后TFL2可以促進H血的表達，從而起到MJT-lt-此結論也止和本實駙室之前研究的TFL2RNAi植殊推遲開花這一結果栩働音.通過半泄9RPPCR硏究莎析砒J屮HdSu在TFL2RNAJ肯吐下的表達就時扯現(xiàn)*蠱少化前和分化話H如

4、配唸到O$H7J星園創(chuàng)調控，并丸OsTFL2対H如的袁達具有促進的作用值得注意的是，本試歸中半定aRT-PCR中所使用的模板為水稻葉子總RNA轉錄得到的總cDNA,而并非瘵個植株中的cDNA但OsTFL2足自接還定何按促進Hd3a的表達，或者是OsTFL2和英它開花堆因一超作用來上調Hdia的袤達，另外OsTFL抑制RCNI的表達的作用機理尊問國都有待進一步深入硏呢，從而掲示6TFL2在水稻開花調控網(wǎng)絡中的定位.通過4研丸得知OsTFL2對Hd3a毎閔存在上卜游的關殺，M足怎么對Hd3a/&到促進作用的機理，只是在轉錄水平上的調控或宵足傳錄和轉錄后水平上都血調捋作用等間題述需耍深入探究

5、。在縱向匕可以通過GFP等阻合蛋白對水解中OsTFL2細胸定位.以及通過Westernbloting或耆輸試驗技術，來探討究競是TFI2在轉錄水半還是在蠱白質水平上調控H如的表達：在橫向上，利用染色質免疫沉淀技術<CHIP、凝膠陰滯試驗或者DNaseI足泌法等技術，逬一步來雌STFL2是單獨對Hdia起到調控作用還是（KTFL2和其它塞因或者蛍門囚子互作共同起作用，這些問腔均是對所要掲示的何題以及今真深入研究的方向.43應用RNA干擾技術研究水稻開花基因功能隨若水稲基因組測序工作的完成及木稻cDNA庫的不斷完善，研究舌發(fā)現(xiàn)翹制擬南芥開花的大祁分基因在水稻基因組中都存在同源基因.用此，-般

6、采用反向遺傳學和正向適傳學于段來硏究水稻開花基兇功能.如反義、rna干擾和a&k達等反向逍傳學技術來硏究開花調控基因在水稻中的功能，并參照擬南芥中的同源墓因功能比較分析；另外可以采用正向遺傳學手段構建人規(guī)模的水稱冥變體庫，并鑒定出與開花相關的究變體及母響開花時間的哭變基M，對于特昇性在空于水用中的幵花調控基因深入研究其功能。本研究是利舟反向遺傳學中的RNAi技術一方面住lFL2RNAi梢株的背景卜硏究水稻種已經(jīng)的開花基因的農(nóng)達情況，來尋找OsTFJ.2下游調控的開花華內：另一方面是構建6MED32過表達與干擾表達載體，轉入農(nóng)桿苗中，通過農(nóng)針菌弁導來侵染水稻兪傷，以方使后續(xù)工作得到OsM

7、ED320E和OsMED32RNAi的轉呆因的植株，為深入對OsMED32在水稱中的功能研究捉供了醫(yī)礎.RNAi沉默效呆與dsRNA的給構、長度大小、是否帝有內含子以及在表達載體上的位買等因索祁相關，特別是發(fā)*式結構RNA(hpRNA)能大大提KRNA沉默效率(WisleySetal.,2011).在植初中dsRNA的氏度大小為500bp左冇，此時的尸擾效果較好(Hanunohd$M曰al.,2000).hpRNA我體設計思珞是將妄沉歐的把華因的一段序列反向朿復連接在啟動子和終止子之間.共表達的RNA形成hpRNA結構。hpRNA結構的正反向重復序列之間需包括一段內含了，形成帶有內含子結構的h

8、pRNA妙體，此時其沉狀效率可從50%提禺至90%甚至是100%(HamiltonAFefal.1999；LinJHetal.r1998；SmithNActal.,2000).A：研究設計的RNAi片段忙度為3&0bp左右，夭小適屮并且便用本實驗保存的P17劇卡擾載體作為中間載體，使OsMED32RNAi360bp片段在pl76幵擾載體連接兩次，使其反向互補結構而形成hpRNA,且根p!76#f擾較體本身的彤列特點，在兩段OsMED32RNAi片段之間，l320bp長段作為內含子序列，構建成帶內含子的發(fā)興式結構RNAi植物表達載體.這樣大大提高了沉默效率.|在構建載體時表達載體的大小同

9、桿影響封遺傳轉化效聿，而本研兇中使用的表達裁體pC'AMBlAJ300是帶有35S啟動于和NOS終it子，直人小約為lOOOObp,其人小適中，不會彫咱轉化效率.4,5OsTFL2DNA和cDNA序列的保守性與趨異性(HTFL2DINA和cDNA序列的保守性關和新等研究發(fā)現(xiàn)植物TFL2蛋“質的N末瑞具仃保寸序列(Motif),其中包播K/R和E/D類的Motif:另爪研究表明植物TFL2同源蛋白質序列祖NLS3及CSD區(qū)具有髙保守性.本研究發(fā)現(xiàn)在不同水稻中，雖然粳稻的進化速度雖快，但是內含子仍然存在于野生稻DNA序列中，這一結契我們得知I,不同水稻品TFL2DNA的序列同樣具有保守性.

10、0$TFL2DNA和cDNA序列的越異性關和新等提出了大壽TFL2(包括MITFL2)的進化主要源于序列的插入和缺失(Guanetal.,2011)。同樣本研究發(fā)現(xiàn)，水稻中同樣存在類似的情況.如JTNBTFL2DNA缺失“GAG”三個堿耳(編碼氨基敲“E”)，而2616TFL2外顯子上則插入“GAG”三個緘堆.這一結果也為關和新等提岀的“播入和缺失”機理提供了新的匹據(jù).水稻不同品種間的序列比對分析得知序列的高保孑性不尊同于性狀的商保守性，即在水稻中，6TFL2級絡構水平上具有高的保守性；然而，該星因在木稻植林性狀的表現(xiàn)性具侑省異性。Ed)Motif介導的不等交換叮以引起彳、冋物神TFL2N木端

11、和對疋侵發(fā)生嚴車分歧(Cuanrtd.,2011).本研究中不同水稻品#DNAJCDSZn)的分歧，推測是在細胞滅數(shù)分裂時發(fā)生的不等交換以及RNA加工£除內含子這兩個過程是OsTFL2堆因變井的主要來源。在自然群體TFL2的DNA序列具有多樣件，但是通過對不同水稻品種斥列的分歧，很大可能是由于木稻是裁培群體，貝名畀性會根捱人類的栽培需賛而改變.內含子都存任F粳稻58N和利I梢中.這一結果揭示OsTFI.2RXA加丁和功能衷現(xiàn)型受到遺傳背景的訥抻.另外，英煜松O9TFL2轉基因統(tǒng)計結果顯示，2615TFL2RNA1轉堆因并未像58NTFL2RNAi一樣延遲水稻開花,即匸尺1«

12、2在58>4中對開花克到促迸作用,而在2616中TFL2對開花并未有明顯的促進或推遲作用(叢煌松，2012年碩士論文人結合木研究屮水豁岳種DNA和CDS序列的坦斤性這一納果，我們推測不同水稻品種有不同的開花機理，OsTFL2促進開花囚£種的不同而存在花別.4.6MED£白在植物中的調控作用調停貴白復合物枠次從酵母中提純(KimciaL,14).圈后的研究發(fā)現(xiàn)誠綽蛋片貨合物是賓核生物中轉錄過程所必需的(Bourbon,2008).直到最近從擬南芥中的研究中還實了植物屮調停蛋白貸合埸的廳在(Backstrometal.,2007)研憲發(fā)現(xiàn)SWP1EEDI4通過組31白去乙

13、服化HDA19而與轉錄共遏制丙子LEUN1G相可作用(Gonzalezetal.,2007).值得注總的是.許多堆因涉及染色體修飾和結構重津而影響開花與植物的防御(WagnerandMeyerowtz,2002：HeandAmasino,2005：Zhouetal.2005：Walleye(al,*2008：March-Diazetal.2008：Wuetal.>2008).從現(xiàn)何的MLD覆白功能的研究結果.我們得知MED蛋白在植物開花型控中起到車要的作用，至于腫32的功能研究冃前未見報道。寥于水稻中岡>32是單拷貝，且MED14和MED32都是調停蛋白復介物的尾部"我們

14、推*6MED32可施與水稻開花調控存在某種關系，另外CHMED32可能作為諛控因了參與67712調控開花過程。為了證實這一點，首先我們耍構OSMED32OE和OsMEDI2RNAi的衣達載體，通過農(nóng)桿菌介導何化至水稻愈傷中從而得到MFD32OE和MED32RNA1轉基因柿株。至TOSMED32的功能、足否像臨DW樣通訶染色體上組蛋門去乙?；瘉碚{節(jié)開花基因的表達.與OSTFL2足否存在調控關系以及與水稻開花存在調控的關系，還需耍深入研究.車冊究通過RXA原位雜交利半定旦RT-PCR.方法，在TFL2RNA1背最卜'對和RCN1等開花基閔的表達量進行分析得知：和Hd3u是0丁FL2的下游搖因，其兩者表達靈受到OSTFL2調払而0$譏】、G3和£Ji川在CK和TFL2RNAi兩給扌才料中的表達辰并未見有明呈的幷異，說明這三者可能不是OsTFL2的下游幕囚不"TFL2的頁接調控影響.另孫，通過對水稻的不同品種序列分析符知，不岡水稻品種TI；L2DNA的斥列同樣具有保守性.HOSTFL2序處的侖保方性并不等同于性狀的高保守性；在水稻中同樣存在像Guanhexin捉出序列的“插入和缺失”機理類似的怖況序列的插入和缺失，加之不同水耕品種DNA和CDS之間的分歧，加測在細胞減敷分裂時發(fā)生的不等交換以及RNA加工去除內含這腳個過程&OsTFL