生物化學(xué)2基因工程制藥(2)

1、第二章 基因工程制藥2.4 基因工程菌生長(zhǎng)代謝的特點(diǎn)一、 比生長(zhǎng)速率(h-1) 細(xì)胞生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（ g/Lh） 。 X為細(xì)胞濃度，通常用單位體積培養(yǎng)液中所含細(xì)胞（或稱(chēng)菌體）的干燥質(zhì)量（dry cell weight，DCW）表示（g/L, g DCW /L ）。 培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞的生長(zhǎng)速率與細(xì)胞濃度成正比。XdtdXrx2g/L4g/L10g/L20g/L生長(zhǎng)速率rX ：?jiǎn)挝粫r(shí)間內(nèi)細(xì)胞濃度的變化（ g/Lh） 2 g/Lh 10 g/Lh 1 h-1 1 h-11h為比生長(zhǎng)速率(h-1) ，表示單位濃度細(xì)胞的生長(zhǎng)速率。二、 乙酸的產(chǎn)生 大腸桿菌在較高的比生長(zhǎng)速率下會(huì)

2、產(chǎn)生乙酸，高濃度的乙酸會(huì)抑制菌體生長(zhǎng)和蛋白表達(dá)。 控制菌體生長(zhǎng)可控制乙酸產(chǎn)生。XdtdXXrx2.5 基因工程菌的穩(wěn)定性一、 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性（1）分裂不穩(wěn)定性 工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒的子代菌。 相關(guān)因素：n 質(zhì)粒的丟失率（宿主菌、質(zhì)粒特性和培養(yǎng)條件）n 含質(zhì)粒菌與不含質(zhì)粒菌的生長(zhǎng)速度差異（2）結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 DNA從質(zhì)粒上丟失、質(zhì)粒上序列發(fā)生重排等。二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法1. 選擇合適的宿主菌株2. 選擇合適的載體 低拷貝數(shù)質(zhì)粒丟失的頻率較大 含高拷貝數(shù)質(zhì)粒的菌比生長(zhǎng)速度明顯低于不含質(zhì)粒菌。3. 加入抗生素二、 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法4. 分階段培養(yǎng) 表達(dá)水平越高，重組質(zhì)粒越不穩(wěn)定。

3、二階段培養(yǎng)： 第一階段 菌體生長(zhǎng) 第二階段 誘導(dǎo)表達(dá)5. 控制培養(yǎng)條件 高比生長(zhǎng)速率下質(zhì)粒穩(wěn)定性明顯增加。 培養(yǎng)基成分、溫度等培養(yǎng)條件對(duì)質(zhì)粒穩(wěn)定性也有影響。6. 固定化 固定化適用于分泌表達(dá)的蛋白，對(duì)非分泌表達(dá)蛋白難以大規(guī)模采用。2.6 基因工程菌的發(fā)酵一、 基因工程菌的培養(yǎng)方式1、分批培養(yǎng)（batch culture） 培養(yǎng)基和細(xì)胞一次性加入反應(yīng)器進(jìn)行培養(yǎng)。 細(xì)胞所處的培養(yǎng)環(huán)境時(shí)刻變化，細(xì)胞不是處在最優(yōu)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)。 操作簡(jiǎn)單。2、流加培養(yǎng)（補(bǔ)料分批培養(yǎng)，fed-batch culture） 在細(xì)胞分批培養(yǎng)的過(guò)程中補(bǔ)加培養(yǎng)基或營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的培養(yǎng)方式，培養(yǎng)結(jié)束后一齊取出。 可采用不同補(bǔ)料方式，

4、如恒速流加、變速流加、指數(shù)流加等。葡萄糖葡萄糖菌體濃度菌體濃度OD乙酸乙酸重組重組蛋白蛋白3、 連續(xù)培養(yǎng)（continuous culture） 培養(yǎng)開(kāi)始時(shí)為分批培養(yǎng)，培養(yǎng)至一定程度后，連續(xù)不斷的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基同時(shí)排出等量培養(yǎng)液。 一定時(shí)間后，細(xì)胞濃度和培養(yǎng)基中各種物質(zhì)濃度均保持不變。 基因工程菌不穩(wěn)定，很難連續(xù)培養(yǎng)。4、透析培養(yǎng)（dialysis culture） 通過(guò)透析除去乙酸。 E.coli HB101(pPAKS2)生產(chǎn)青霉素?；柑岣?1倍。5、 固定化培養(yǎng)（immobilized culture） 質(zhì)粒穩(wěn)定，便于連續(xù)，適用于分泌表達(dá)。二、 基因工程菌的培養(yǎng)工藝1、培養(yǎng)基的影響 碳

5、源：葡萄糖、甘油、乳糖、果糖等。 氮源、無(wú)機(jī)鹽等其他成分。 通過(guò)單因子實(shí)驗(yàn)、正交設(shè)計(jì)等方法優(yōu)化培養(yǎng)基組成，提高蛋白表達(dá)水平。2、接種量的影響 接種量小，延遲期長(zhǎng)，菌容易老化，不利于蛋白表達(dá)。 較大的接種量延遲期短，適于蛋白表達(dá)。 接種量一般為515。3、溫度的影響 溫度對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)理很復(fù)雜，對(duì)不同蛋白，最佳的誘導(dǎo)表達(dá)溫度不同。4、溶氧（dissolved oxygen，DO ）的影響 較高水平的DO（大于1030）的有利于蛋白表達(dá)，供氧不足，產(chǎn)生乙酸。 加大攪拌、增加氣流、提高氧分壓、提高罐壓。 控制糖源的流加速度。 恒溶氧發(fā)酵：通過(guò)以上手段控制DO在一恒定值。5、pH的影響 流加酸、堿

6、調(diào)節(jié)pH。 pH一般控制在6.87.6，少數(shù)例外。6、誘導(dǎo)時(shí)機(jī)的影響 一般在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。分批發(fā)酵不同生長(zhǎng)階段加1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后的生長(zhǎng)曲線正三角（對(duì)數(shù)早期） 倒三角（對(duì)數(shù)中期） 菱形（對(duì)數(shù)晚期） 圓形（不加誘導(dǎo)）對(duì)數(shù)早期對(duì)數(shù)早期對(duì)數(shù)中期對(duì)數(shù)中期對(duì)數(shù)晚期對(duì)數(shù)晚期不誘導(dǎo)不誘導(dǎo)三、高密度發(fā)酵 理論上計(jì)算大腸桿菌發(fā)酵所能達(dá)到的最高菌體密度（干重）為400g/L，一般認(rèn)為最高的發(fā)酵密度（干重）為200g/L。 目前培養(yǎng)所達(dá)到的最高密度是175 g/L 。 高密度發(fā)酵的成功關(guān)鍵是補(bǔ)料策略。 乙酸的積累是高密度培養(yǎng)生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的一個(gè)主要問(wèn)題是。 三、高密度發(fā)酵 工藝上對(duì)策：工藝上對(duì)策：

7、 在發(fā)酵工藝上常通過(guò)改變培養(yǎng)基組成（以在發(fā)酵工藝上常通過(guò)改變培養(yǎng)基組成（以甘油甘油為初為初始碳源）始碳源） 降低培養(yǎng)溫度降低培養(yǎng)溫度 限制性流加葡萄糖限制性流加葡萄糖 提高供氧能力（加強(qiáng)攪拌、提高氧分壓、提高罐提高供氧能力（加強(qiáng)攪拌、提高氧分壓、提高罐壓）壓）三、高密度發(fā)酵 菌種上對(duì)策：菌種上對(duì)策：n阻斷E. coli乙酸產(chǎn)生：敲除磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因（pta1）和乙酸激酶（ack）的基因；n改變代謝流方法：導(dǎo)入丙酮酸脫羧酶基因pdc1和乙醇脫氫酶adh2，丙酮酸生成乙醇；n限制葡萄糖攝取主要途徑（磷酸轉(zhuǎn)移系統(tǒng)），同時(shí)還需加強(qiáng)其他葡萄糖攝取途徑；n引入血紅蛋白基因2.7 基因工程藥物的分離純化一、

8、 分離純化的基本過(guò)程發(fā)酵液發(fā)酵液細(xì)胞細(xì)胞固固-液分離液分離溶液溶液細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎包涵體包涵體溶解溶解復(fù)性復(fù)性濃縮濃縮粗分離粗分離純化與精制純化與精制制劑制劑產(chǎn)品產(chǎn)品胞外產(chǎn)物胞內(nèi)產(chǎn)物固固-液分離液分離 溶液溶液 細(xì)胞碎片細(xì)胞碎片2.7 基因工程藥物的分離純化二、 建立分離純化工藝需了解的因素1、起始物料的特點(diǎn)、起始物料的特點(diǎn) 菌種類(lèi)型、蛋白的表達(dá)部位、菌種類(lèi)型、蛋白的表達(dá)部位、 產(chǎn)物濃度等。產(chǎn)物濃度等。2、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）、目的產(chǎn)物特性（各種物理化學(xué)性質(zhì)、穩(wěn)定性）3、雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)雜質(zhì)的種類(lèi)和性質(zhì)4、產(chǎn)品質(zhì)量的要求、產(chǎn)品質(zhì)量的要求 準(zhǔn)許存在的雜質(zhì)種類(lèi)和最低含量、純度、

9、比活等。準(zhǔn)許存在的雜質(zhì)種類(lèi)和最低含量、純度、比活等。三、 細(xì)胞破碎n物理方法 珠磨、高壓勻漿、超聲波破碎、勻漿、凍融、低滲裂解、研磨等n化學(xué)方法 有機(jī)溶劑（甲苯、丙酮等）、表面活性劑等。n 生物方法 酶法：溶菌酶、葡聚糖酶、溶壁酶等； 自溶：一定pH和溫度；一般采用加熱法，自溶時(shí)間較長(zhǎng)。 5070MPa450m/s四、 固液分離 胞外蛋白：離心 包含體：離心、低速離心 胞內(nèi)蛋白：去除細(xì)胞碎片 高速離心、微濾（0.110um）、 雙水相萃?。≒EG-Dextran、 PEG-鹽系統(tǒng)）、絮凝、膨脹床吸附 五、分離純化方法 主要為各種層析方法： 離子交換層析、凝膠過(guò)濾、疏水層析、親和層析 超濾 六、

10、非蛋白類(lèi)雜質(zhì)的去除nDNA（離子交換、疏水層析等）n熱原（脂多糖，超濾、陰離子交換、疏水層析、多黏菌素B親和層析）n病毒病毒（紫外線照射、（紫外線照射、40nm膜過(guò)濾）膜過(guò)濾） 七、選擇分離純化方法的依據(jù)n根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇根據(jù)產(chǎn)物表達(dá)形式來(lái)選擇 分泌表達(dá)（超濾、沉淀）分泌表達(dá)（超濾、沉淀） 胞內(nèi)可溶表達(dá)（親和層析、離子交換）胞內(nèi)可溶表達(dá)（親和層析、離子交換） 周質(zhì)腔表達(dá)（溶菌酶處理后滲透壓休克）周質(zhì)腔表達(dá)（溶菌酶處理后滲透壓休克） 包含體（離心回收）包含體（離心回收） 七、選擇分離純化方法的依據(jù)n根據(jù)分離單元之間的銜接選擇根據(jù)分離單元之間的銜接選擇 初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質(zhì)

11、）初步純化（超濾、沉淀；濃縮、去主要雜質(zhì)） 高分辯率高分辯率純化（親和層析、離子交換等色譜方式）純化（親和層析、離子交換等色譜方式） 色譜之間的分離次序：色譜之間的分離次序： 鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜鹽析沉淀、離子交換后可直接采用疏水色譜 親和層析通常放在第二步純化之后親和層析通常放在第二步純化之后 凝膠過(guò)濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）凝膠過(guò)濾通常放在最后（容量小、可更換緩沖）n根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇根據(jù)分離純化工藝的要求來(lái)選擇 具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性 純化步驟盡可能少，時(shí)間盡可能短等。純化步驟盡可能少，時(shí)間盡可能短等。2.8、包含體的復(fù)性

12、外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)通常會(huì)形成一外源基因在大腸桿菌中高水平表達(dá)時(shí)通常會(huì)形成一種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無(wú)活性的蛋白聚集體即包種由目的蛋白構(gòu)成的不溶的、無(wú)活性的蛋白聚集體即包含體（含體（Inclusion Body） 包含體內(nèi)約包含體內(nèi)約90%的成分是蛋白質(zhì)，的成分是蛋白質(zhì)，目的蛋白占目的蛋白占50以上。以上。一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)一、包含體表達(dá)的優(yōu)點(diǎn)n表達(dá)量高表達(dá)量高n密度高（密度高（1.2-1.4g/mL之間之間 ），容易分離），容易分離n抗蛋白酶抗蛋白酶n對(duì)宿主毒性小對(duì)宿主毒性小二、包含體蛋白處理過(guò)程二、包含體蛋白處理過(guò)程細(xì)胞破碎細(xì)胞破碎包涵體分離包涵體分離包涵體溶解包涵體溶解目

13、的產(chǎn)物的復(fù)性目的產(chǎn)物的復(fù)性變性條件下純化變性條件下純化包涵體洗滌包涵體洗滌三、包含體的復(fù)性方法方法： 1. 稀釋復(fù)性 2. 透析復(fù)性 3. 層析復(fù)性影響復(fù)性的操作參數(shù)：蛋白濃度、溫度、pH、離子強(qiáng)度。提高蛋白復(fù)性率的策略：n復(fù)性添加劑如PEG、表面活性劑n分子伴侶常用半胱氨酸之間形成二硫鍵方法： 1. 空氣氧化法 在堿性條件下通空氣，氧化時(shí)可以加入二價(jià)銅離子加快反應(yīng)速度，能夠取得更好的效果，缺點(diǎn)是不易控制氧化還原電勢(shì)，而且二硫鍵的氧化形成速度慢； 2.氧化還原對(duì)重排體系 常用氧化還原對(duì)有氧化型谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽和胱氨酸/半胱氨酸，通過(guò)調(diào)整氧化還原兩種物質(zhì)的比例可以控制較精確的氧化還原電勢(shì)

14、，對(duì)二硫鍵反應(yīng)進(jìn)行控制，其二硫鍵形成速率快于空氣氧化法。 P-SH + R-S-S-R P-S-S-R + R-SH P-S-S-R + P-SH P-S-S-P + R-SH2.9 基因工程藥物的質(zhì)量控制 生物材料、培養(yǎng)過(guò)程、純化過(guò)程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。生物材料、培養(yǎng)過(guò)程、純化過(guò)程、產(chǎn)品的質(zhì)量控制。 目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制：目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量控制：產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安產(chǎn)品的鑒別、純度、活性、安全性、穩(wěn)定性、一致性。全性、穩(wěn)定性、一致性。1.生物活性測(cè)定 活性、比活2.產(chǎn)品的鑒定（1）相對(duì)分子量 SDS-PAGE、凝膠過(guò)濾，允許10%誤差。 必要時(shí)采用質(zhì)譜準(zhǔn)確測(cè)定。（2）等電點(diǎn) 等電聚焦測(cè)定，等電

15、點(diǎn)常不均一，每批測(cè)定結(jié)果應(yīng)一致。（3）紫外吸收光譜 特征型吸收，每批一致（4）氨基酸序列測(cè)定 送檢中試頭三批產(chǎn)品，N端15個(gè)氨基酸序列，C端13個(gè)氨基酸殘基。（5）氨基酸組成分析（6）免疫印跡（western blot）（7）圓二色光譜（8）肽圖 一般用胰蛋白酶或CNBr裂解，再用RP-HPLC或SDS-PAGE分析（9）二硫鍵分析3.蛋白純度分析 必須采用非還原SDS-PAGE和HPLC進(jìn)行檢定，其他檢測(cè)方法包括CE（毛細(xì)管電泳）等。4.雜質(zhì)檢測(cè)（1）內(nèi)毒素(脂多糖) 家兔法、鱟試劑法（2）宿主細(xì)胞蛋白 免疫分析（3）宿主細(xì)胞殘余DNA 核酸雜交，100pg/劑量（4）細(xì)菌、酵母、真菌、支原

16、體、病毒 微生物學(xué)方法（5）其他物質(zhì) 抗生素 牛血清 采用了抗體親和層析，檢測(cè)小鼠IgG含量。5.穩(wěn)定性檢測(cè) 在不同溫度下保存，定期取樣檢測(cè)生物活性及其他特性的變化。6.一致性 各批次產(chǎn)品均符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)格。產(chǎn)品的保存：n液態(tài)保存 低溫： -20、 -80和液氮、短期4 穩(wěn)定的pH 高濃度 加保護(hù)劑：糖類(lèi)、脂類(lèi)、蛋白類(lèi)、還原劑（二硫蘇糖醇）等n固體保存 含水量5%以下， 4長(zhǎng)期保存 冷凍干燥 凍干過(guò)程中加保護(hù)劑：低分子化合物（葡萄糖、蔗糖等）、高分子物質(zhì)（糊精、血清）基因工程藥物制造實(shí)例基因工程藥物制造實(shí)例 自學(xué)自學(xué)第二章第二章 基因工程制藥基因工程制藥n寫(xiě)出基因工程的基本要素及制備基因工程藥物的基本寫(xiě)出基因工程的基本要素及制備基因工程藥物的基本過(guò)程。過(guò)程。n列出列出4種獲取目的基因的方式。種獲取目的基因的方式。n了解常用的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。了解常用的外源基因表達(dá)系統(tǒng)。n寫(xiě)出大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢(shì)和缺點(diǎn)。寫(xiě)出大腸桿