化妝品微生物檢驗方法

1、WORD格式一、總那么1.X圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品微生物檢驗的根本要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品樣品的采集、保存及供檢樣品制備。2.儀器和設(shè)備2.1天平。2.2高壓滅菌器。2.3振蕩器。2.4三角瓶， 250mL 。2.5玻璃珠。2.6琉璃棒。2.7刻度吸管， 1mL 、 10mL 。2.8研缽或均質(zhì)器。2.9恒溫水浴箱。3.培養(yǎng)基和試劑3.1生理鹽水成分：氯化鈉8.5g蒸餾水加至1000mL溶解后，分裝到加玻璃珠的三角瓶內(nèi)，每瓶90 mL ， 103.43kPa (121 15 lb)20min 高壓滅菌。3.2SCDLP 液體培養(yǎng)基成分：酪蛋白胨17g大豆蛋白胨3g氯化鈉5g磷酸氫二鉀2.5g葡萄

2、糖1g吐溫 807g蒸餾水1000mL制法：先將卵磷脂在少量蒸餾水中加溫溶解后，再與其它成分混合， 加熱溶解， 調(diào) pH 為 7.2 7.3 分裝， 103.43 kPa(121 15 lb)20min高壓滅菌。注意振蕩，使沉淀于底層的吐溫80 充分混合，冷卻至 25左右使用。注：如無酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3滅菌液體石蠟。3.4滅菌吐溫80。4. 樣品的采集及本卷須知4.1所采集的樣品，應(yīng)具有代表性，一般視每批化裝品數(shù)量大小，隨機抽取相應(yīng)數(shù)量的包裝單位。檢驗時，應(yīng)分別從兩個包裝單位以上的樣品中共取10g 或 10mL。包裝量小于20g 的樣品，采樣量可適當(dāng)增加樣品包裝數(shù)量。

3、4.2供檢驗樣品，應(yīng)嚴(yán)格保持原有的包裝狀態(tài)。容器不應(yīng)有破裂，在檢驗前不得翻開，防止樣品被污染。4.3接到樣品后，應(yīng)立即登記，編寫檢驗序號，并按檢驗要求盡快檢驗。如不能及時檢驗，樣品應(yīng)放在室溫陰涼枯燥處，不要冷藏或冷凍。4.4假設(shè)只有一個樣品而同時需做多種分析，如細(xì)菌、毒理、化學(xué)等，那么宜先取出局部樣品做細(xì)菌檢驗，再將剩專業(yè)資料整理WORD格式余樣品做其它分析。4.5在檢驗過程中，從翻開包裝到全部檢驗操作完畢，均須防止微生物的再污染和擴散，所用器皿及材料均應(yīng)事先滅菌，全部操作應(yīng)在無菌室內(nèi)進展，或在相應(yīng)條件下，按無菌操作規(guī)定進展。4.6如檢出糞大腸菌群或其它致病菌，自報揭露出之日起該菌種及被檢樣品

4、應(yīng)保存一個月。5. 供檢樣品的制備5.1液體樣品5.1.1水溶性的液體樣品，可量取10mL加到 90mL滅菌生理鹽水中，如樣品少于10mL，仍按 10 倍稀釋法進展。如為 5mL那么加到 45mL滅菌生理鹽水中，混勻后制成1： 10 檢液。5.1.2油性液體樣品，取樣品10mL,先加 5mL滅菌液體石蠟混勻，再加10mL滅菌的吐溫80, 在 40 44水浴中充分混合，制成1： 10 檢液。5.3固體樣品稱取 10g，加到 90mL滅菌生理鹽水中，充分振蕩混勻，使其分散混懸，靜置后，取上清液作為1： 10 的檢液。如有均質(zhì)器，上述水溶性膏、霜、粉劑等，可稱10g 樣品參加90mL滅菌生理鹽水，均

5、質(zhì)1min 2min；疏水性膏、霜及眉筆、口紅等，稱10g 樣品，參加10mL滅菌液體石蠟，10mL吐溫 80,70mL 滅菌生理鹽水，均質(zhì)3min 5min 。二、菌落總數(shù)1. X圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中菌落總數(shù)的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品菌落總數(shù)的測定。2. 定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義菌落總數(shù) Aerobic bacterial count是指化裝品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下培養(yǎng)后如培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、 pH 值、需氧性質(zhì)等 ， 1g(1mL) 檢樣中所含菌落的總數(shù)。所得結(jié)果只包括一群本方法規(guī)定的條件下生長的嗜中溫的需氧性菌落總數(shù)。測定菌落總數(shù)便于判明樣品被細(xì)菌污染的程度，是對樣品

6、進展衛(wèi)生總評價的綜合依據(jù)。3. 儀器和設(shè)備3.1三角瓶， 250mL。3.2量筒， 200mL。3.3pH計或精細(xì)pH試紙。3.4高壓滅菌器。3.5試管： 15× 150mm。3.6滅菌平皿：直徑 9cm。3.7滅菌刻度吸管， 10mL、1mL。3.8酒精燈。3.9恒溫培養(yǎng)箱： 36± 1。3.10放大鏡。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1生理鹽水：見總那么中3.1 。專業(yè)資料整理WORD格式4.2卵磷脂、吐溫 80- 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基4.2.1成分：蛋白胨20g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g卵磷脂1g吐溫 807g蒸餾水1000mL4.2.2制法：先將卵磷脂加到少量蒸餾水中，加熱溶解

7、，參加吐溫80, 將其他成分除瓊脂外加到其余的蒸餾水中，溶解。參加已溶解的卵磷脂、吐溫80, 混勻，調(diào) pH 值為 7.1 7.4,參加瓊脂， 103.43kPa (12115 lb)20min 高壓滅菌，儲存于冷暗處備用。4.30.5%氯化三苯四氮唑 2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC 成分：TTC0.5g蒸餾水1000mL溶解后過濾，103.43kPa (121 15 lb)20min 高壓滅菌，裝于棕色試劑瓶，置4冰箱備用。5. 操作步驟5.1用滅菌吸管吸取 1： 10 稀釋的檢液 2mL,分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿1mL。另取 1mL注入

8、到 9mL滅菌生理鹽水試管中注意勿使吸管接觸液面，更換一支吸管，并充分混勻，制成1：100 檢液。吸取 2mL，分別注入到兩個滅菌平皿內(nèi)，每皿 1mL。如樣品含菌量高，還可再稀釋成1： 1000,1 ： 10000，, 等，每種稀釋度應(yīng)更換1 支吸管。5.2將融化并冷至 45 50的卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基傾注到平皿內(nèi)，每皿約15 mL, 隨即轉(zhuǎn)動平皿，使樣品與培養(yǎng)基充分混合均勻，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36± 1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48h± 2h。另取一個不加樣品的滅菌空平皿，參加約 15mL卵磷脂吐溫 80 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，待瓊脂凝固后，翻轉(zhuǎn)平皿，置36±

9、1培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng) 48h± 2h，為空白對照。5.3為便于區(qū)別化裝品中的顆粒與菌落，可在每100mL卵磷脂吐溫80 營養(yǎng)瓊脂中參加1mL0.5%的 TTC溶液，如有細(xì)菌存在，培養(yǎng)后菌落呈紅色，而化裝品的顆粒顏色無變化。6菌落計數(shù)方法先用肉眼觀察，點數(shù)菌落數(shù)，然后再用放大 5 倍 10 倍的放大鏡檢查，以防遺漏。記下各平皿的菌落數(shù)后，求出同一個稀釋度各平皿生長的平均菌落數(shù)。假設(shè)平皿中有連成片狀的菌落或花點樣菌落蔓延生長時，該平皿不宜計數(shù)。假設(shè)片狀菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落數(shù)分布又很均勻，那么可將此半個平皿菌落計數(shù)后乘以 2, 以代表全皿菌落數(shù)。7. 菌落計數(shù)及報告方法7.1首

10、先選取平均菌落數(shù)在30 個 300個之間的平皿，作為菌落總數(shù)測定的X圍。當(dāng)只有一個稀釋度的平均菌落數(shù)符合此X圍時，即以該平皿菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)見表1 中例 1。7.2假設(shè)有兩個稀釋度，其平均菌落數(shù)均在30 個 300 個之間，那么應(yīng)求出兩菌落總數(shù)之比值來決定，假設(shè)其比值小于或等于2, 應(yīng)報告其平均數(shù)，假設(shè)大于2 那么報告其中稀釋度較低的平皿的菌落數(shù)見表1中例 2及例 3。7.3假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300 個，那么應(yīng)按稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之見表1中例 4。7.4假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30 個，剛應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之見表1 中例 5。

11、7.5假設(shè)所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30 個 300 個之間，其中一個稀釋度大于300 個，而相鄰的另一稀釋度小于 30 個時，那么以 30 或 300 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之見表1 中例 6。專業(yè)資料整理WORD格式7.6假設(shè)所有的稀釋度均無菌生長，報告數(shù)為每g 或每 mL小于 10 CFU。7.7菌落計數(shù)的報告，菌落數(shù)在 10以內(nèi)時，按實有數(shù)值報告之，大于100 時，采用二位有效數(shù)字，在二位有效數(shù)字后面的數(shù)值，應(yīng)以四舍五入法計算。為了縮短數(shù)字后面零的個數(shù)，可用10 的指數(shù)來表示見表1 報告方式欄。在報告菌落數(shù)為“不可計時，應(yīng)注明樣品的稀釋度。表 1細(xì)菌計數(shù)結(jié)果及報告方式例次不同稀

12、釋度平均菌落數(shù)兩稀釋度菌落總數(shù)報告方式10-110-210-3菌數(shù)之比(CFU/mL 或 CFU/g(CFU/mL 或 CFU/g11365164201640016000 或 1.6 × 10422760295461.63800038000 或 3.8 × 10432890271602.22710027000 或 2.7 × 1044不可計4650513513000510000 或 5.1 × 105527115270270 或 2.7 × 1026不可計305123050031000 或 3.1 × 1047000 1×1

13、01×10*CFU：菌落形成單位。三、糞大腸菌群1. X圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中糞大腸菌群的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中糞大腸菌群的檢驗。2. 定義專業(yè)資料整理WORD格式本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義糞大腸菌群Fecal coliforms系一群需氧及兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌，在能發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。44± 0.5培養(yǎng)24h 48h專業(yè)資料整理WORD格式該菌直接來自糞便，是重要的衛(wèi)生指標(biāo)菌。3. 儀器3.1恒溫水浴箱或隔水式恒溫箱： 44± 0.5 。3.2溫度計。3.3顯微鏡。3.4載玻片。3.5接種環(huán)。3.6電磁爐。3.7三角瓶， 250mL。3.8試管： 15&

14、#215; 150mm。3.9小倒管。3.10 pH 計或 pH 試紙。3.11高壓滅菌器。專業(yè)資料整理WORD格式3.12滅菌吸管， 10mL、 1mL。3.13滅菌平皿：直徑90mm。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1雙倍乳糖膽鹽含中和劑培養(yǎng)基成分：蛋白胨40g豬膽鹽10g乳糖10g0.4%溴甲酚紫水溶液5mL卵磷脂2g吐溫 8014g蒸餾水1000mL制法： 將卵磷脂、 吐溫 80 溶解到少量蒸餾水中。將蛋白胨、 豬膽鹽及乳糖溶解到其余的蒸餾水中，加到一起混勻，調(diào) pH到 7.4, 參加 0.4%溴甲酚紫水溶液，混勻，分裝試管每支試管中加一個小倒管。 68.95 kPa (115 10 lb)20

15、min高壓滅菌。4. 2 伊紅美藍(lán) EMB 瓊脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氫二鉀2g瓊脂20g2%伊紅水溶液20mL0.5%美藍(lán)水溶液13mL蒸餾水1000mL制法：先將瓊脂加到900mL 蒸餾水中，加熱溶解，然后參加磷酸氫二鉀、蛋白胨，混勻，使之溶解。再以蒸餾水補足至 1000mL。校正 pH 值為 7.2 7.4, 分裝于三角瓶內(nèi)， 103.43 kPa (121 15 lb)15min高壓滅菌備用。 臨用時參加乳糖并加熱融化瓊脂。冷至60左右無菌操作參加滅菌的伊紅美藍(lán)溶液，搖勻。傾注平皿備用。4.3蛋白胨水做靛基質(zhì)試驗用成分：蛋白胨或胰蛋白胨20g氯化鈉5g蒸餾水1000mL制法：

16、將上述成分加熱融化，調(diào)pH 值為 7.0 7.2. 分裝小試管， 103.43 kPa (12115 lb)15min 高壓滅菌。4. 4靛基質(zhì)試劑柯凡克試劑：將 5g 對二甲氨基苯甲醛溶解于75mL戊醇中，然后緩慢參加濃鹽酸25mL。試驗方法：接種細(xì)菌于蛋專業(yè)資料整理WORD格式白胨水中， 于 44± 0.5 色。培養(yǎng) 24h±2h。沿管壁加柯凡克試劑0.3mL 0.5mL，輕搖試管。 陽性者于試劑層顯深玫瑰紅專業(yè)資料整理WORD格式注：蛋白胨應(yīng)含有豐富的色氨酸，每批蛋白胨買來后，應(yīng)先用菌種鑒定前方可使用。4.5革蘭氏染色液：4.5.1染液制備4.5.1.1結(jié)晶紫染色液：

17、結(jié)晶紫1g95%乙醇20mL1%草酸銨水溶液80mL專業(yè)資料整理WORD格式將結(jié)晶紫溶于乙醇中，然后與草酸銨溶液混合。4.5.1.2革蘭氏碘液：碘1g碘化鉀2g蒸餾水加至300mL將碘與碘化鉀先進展混合，參加蒸餾水少許，充分振搖，待完全溶解后，再加蒸餾水至300mL。4.5.1.3脫色液： 95%乙醇。4.5.1.4復(fù)染液：（ 1沙黃復(fù)染液：沙黃0.25g95%乙醇10mL蒸餾水90mL將沙黃溶解于乙醇中，然后用蒸餾水稀釋。 2稀石碳酸復(fù)紅液：稱取堿性復(fù)紅10g，研細(xì)，加95%乙醇 100mL,放置過夜，濾紙過濾。取該液10mL,加 5%石碳酸水溶液90mL,混合，即為石碳酸復(fù)紅液。再取此液1

18、0mL加水 90mL,即為稀石碳酸復(fù)紅液。4.5.2染色法4.5.2.1將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min, 水洗。4.5.2.2滴加革蘭氏碘液，作用1min, 水洗。4.5.2.3滴加 95%乙醇脫色，約30s, 或?qū)⒁掖嫉螡M整個涂片，立即傾去，再用乙醇滴滿整個涂片，脫色10s, 水洗。4.5.2.4滴加復(fù)染液，復(fù)染1min, 水洗，待干，鏡檢。4.5.3染色結(jié)果革蘭氏陽性菌呈紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。注：如用1： 10 稀釋石碳酸復(fù)紅液做復(fù)染，復(fù)染時間僅需10s。5. 操作步驟5.1取 10mL1：10 稀釋的檢液，加到10mL雙倍乳糖膽鹽含中和劑培養(yǎng)基中，置44±

19、 0.5 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 48h，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，那么報告為糞大腸菌群陰性。5.2如產(chǎn)酸產(chǎn)氣，那么劃線接種到伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，置36± 1培養(yǎng) 18h 24h。同時取該培養(yǎng)液1 2 滴接種到蛋白胨水中，置44± 0.5 培養(yǎng) 24h± 2h。經(jīng)培養(yǎng)后，在上述平板上觀察有無典型菌落生長。糞大腸菌群在伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基上的典型菌落呈深紫黑色，圓形，邊緣整齊，外表光滑濕潤，常具有金屬光澤。也有的呈紫黑色，不帶或略帶金屬光澤，或粉紫色，中心較深的菌落，亦常為糞大腸菌群，應(yīng)注意挑選。5.3挑取上述可疑菌落，涂片做革蘭氏染色鏡檢。5.4在蛋白胨水培養(yǎng)液中，參加靛基質(zhì)試

20、劑約0.5mL, 觀察靛基質(zhì)反響。陽性者液面呈玫瑰紅色；陰性反響液面呈試劑本色。6. 檢驗結(jié)果報告根據(jù)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，平板上有典型菌落，并經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，靛基質(zhì)試驗陽性，那么可報告被檢樣品中檢出糞大腸菌群。專業(yè)資料整理WORD格式四、銅綠假單胞菌專業(yè)資料整理WORD格式1. X圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品中銅綠假單胞菌的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中銅綠假單胞菌的檢驗。2. 定義本標(biāo)準(zhǔn)采用了以下定義銅綠假單胞菌 Pseudomonas aeruginosa 屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶陽性，能產(chǎn)生綠膿菌素。此外還能液化明膠，復(fù)原硝酸鹽為亞硝酸鹽，在42± 1條件下能生長

21、。該菌對人有致病力，可使傷處化膿，引起敗血癥等。3. 儀器3.1培養(yǎng)箱： 42± 1、 36± 1。3.2三角瓶， 250mL。3.3試管： 15× 150mm。3.4滅菌平皿：直徑90mm。3.5滅菌刻度吸管，10mL、1mL。3.6顯微鏡。3.7載玻片。3.8接種針，接種環(huán)。3.9電磁爐。3.10高壓滅菌器。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP 液體培養(yǎng)基見總那么中 3.2 。4.2十六烷基三甲基溴化銨培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨10g氯化鈉5g十六烷基三甲基溴化銨0.3g瓊脂20g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將上述成分混合加熱溶解，調(diào)pH 為 7.4 7

22、.6, 參加瓊脂， 68.95 kPa (115 10 lb)20min 滅菌后，制成平板備用。4.3乙酰胺培養(yǎng)基成分：乙酰胺10.0g氯化鈉5.0g無水磷酸氫二鉀1.39g無水磷酸二氫鉀0.73g硫酸鎂 MgSO.7HO0.5g42酚紅0.012g瓊脂20g蒸餾水1000mL專業(yè)資料整理WORD格式制法：除瓊脂和酚紅外，將其它成分加到蒸餾水中，加熱溶解，調(diào)pH 為 7.2, 參加瓊脂、酚紅， 103.43 kPa (12115 lb)20min高壓滅菌后，制成平板備用。4.4綠膿菌素測定用培養(yǎng)基成分：蛋白胨20g氯化鎂1.4g硫酸鉀10g瓊脂18g甘油化學(xué)純10g蒸餾水1000mL制法：將蛋

23、白胨、氯化鎂和硫酸鉀加到蒸餾水中，加溫使其溶解，調(diào)pH 至 7.4,參加瓊脂和甘油，加熱溶解，分裝于試管內(nèi)， 68.95 kPa (115 10 lb)20min 高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.5明膠培養(yǎng)基成分：牛肉膏3g蛋白胨5g明膠120g蒸餾水1000mL制法：取各成分加到蒸餾水中浸泡20min, 隨即攪拌加溫使之溶解，調(diào) pH至 7.4,分裝于試管內(nèi)， 經(jīng) 68.95 kPa (11510 lb)20min高壓滅菌后，直立制成高層備用。4.6硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g酵母浸膏3g硝酸鉀2g亞硝酸鈉0. 5g蒸餾水1000mL制法： 將蛋白胨和酵母浸膏加到蒸餾水中，加熱使之溶

24、解，調(diào) pH為 7.2,煮沸過濾后補足液量，參加硝酸鉀和亞硝酸鈉，溶解混勻，分裝到加有小倒管的試管中，68.95 kPa (115 10 lb)20min高壓滅菌后備用。4.7普通瓊脂斜面培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉5g瓊脂15g蒸餾水1000mL制法：除瓊脂外，將其余成分溶解于蒸餾水中，調(diào) pH 為 7.2 7.4,參加瓊脂，加熱溶解，分裝試管， 103.43 kPa (12115 lb)20min高壓滅菌后，制成斜面?zhèn)溆谩?.操作步驟5.1增菌培養(yǎng)：取1：10 樣品稀釋液 10mL加到 90mLSCDLP液體培養(yǎng)基中，置36± 1培養(yǎng) 18h 24h。如有銅綠假單胞菌

25、生長，培養(yǎng)液外表多有一層薄菌膜，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。5.2別離培養(yǎng)： 從培養(yǎng)液的薄膜處挑取培養(yǎng)物，劃線接種在十六烷三甲基溴化銨瓊脂平板上，置 36± 1培養(yǎng)18h 24h。凡銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上，其菌落扁平無定型，向周邊擴散或略在蔓延，外表濕潤，菌落呈灰白色，菌落周圍培養(yǎng)基常擴散有水溶性色素，此培養(yǎng)基選擇性強，大腸埃希氏菌不能生長，革蘭氏陽性菌生長較差。專業(yè)資料整理WORD格式在缺乏十六烷三甲基溴化銨瓊脂時也可用乙酰胺培養(yǎng)基進展別離，將菌液劃線接種于平板上，置24h± 2h，銅綠假單胞菌在此培養(yǎng)基上生長良好，菌落扁平， 邊緣不整， 菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色，36&

26、#177; 1培養(yǎng)其它菌落不生長。專業(yè)資料整理WORD格式5.3染色鏡檢：挑取可疑的菌落，涂片，革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性者應(yīng)進展氧化酶試驗。5.4氧化酶試驗：取一小塊干凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi)，用無菌玻璃棒挑取銅綠假單胞菌可疑菌落涂在濾紙上，然后在其上滴加一新配制的1%二甲基對苯二胺試液，在 15s 30s 之內(nèi)，出現(xiàn)粉紅色或紫紅色時，為氧化酶試驗陽性；假設(shè)培養(yǎng)物不變色，為氧化酶試驗陰性。5.5綠膿菌素試驗：取可疑菌落2 個 3 個，分別接種在綠膿菌素測定培養(yǎng)基上，置36± 1培養(yǎng) 24h± 2h,參加氯仿 3mL5mL, 充分振蕩使培養(yǎng)物中的綠膿菌素溶解于氯仿液內(nèi)

27、，待氯仿提取液呈藍(lán)色時，用吸管將氯仿移到另一專業(yè)資料整理WORD格式試管中并參加 1mol/L 的鹽酸 1mL左右，振蕩后，靜置片刻。如上層鹽酸液內(nèi)出現(xiàn)粉紅色到紫紅色時為陽性，表示被檢物中有綠膿菌素存在。5.6 硝酸鹽復(fù)原產(chǎn)氣試驗： 挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物， 接種在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基中， 置 36± 1培養(yǎng) 24h± 2h, 觀察結(jié)果。凡在硝酸鹽蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體者，即陽性，說明該菌能復(fù)原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮氣。5.7明膠液化試驗，取銅綠假單胞菌可疑菌落的純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi)，置36± 1培養(yǎng) 24h±2h,

28、 取出放冰箱10min 30min, 如仍呈溶解狀或外表溶解時即為明膠液化試驗陽性；如凝固不溶者為陰性。5.842生長試驗： 挑取可疑的銅綠假單胞菌純培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上，放在 42± 1培養(yǎng)箱中，培養(yǎng) 24h48h, 銅綠假單胞菌能生長，為陽性，而近似的熒光假單胞菌那么不能生長。6. 檢驗結(jié)果報告被檢樣品經(jīng)增菌別離培養(yǎng)后，經(jīng)證實為革蘭氏陰性桿菌，氧化酶及綠膿菌素試驗皆為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌；如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠、硝酸鹽復(fù)原產(chǎn)氣和 42生長試驗三者皆為陽性時，仍可報告被檢樣品中檢出銅綠假單胞菌。五、金黃色葡萄球菌1. X圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了化裝品

29、中金黃色葡萄球菌的檢驗方法。本標(biāo)準(zhǔn)適用于化裝品中金黃色葡萄球菌的檢驗。2. 定義本標(biāo)準(zhǔn)采用以下定義金黃色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 為革蘭氏陽性球菌，呈葡萄狀排列，無芽孢，無莢膜，能分解甘露醇，血漿凝固酶陽性。該菌是葡萄球菌中對人類致病力最強的一種，能引起人體局部化膿性病灶，嚴(yán)重時可導(dǎo)致敗血癥。3. 儀器和設(shè)備3.1顯微鏡。3.2恒溫培養(yǎng)箱： 36± 1。3.3離心機。3.4滅菌吸管， 1mL、 10mL。3.5滅菌試管： 15× 150mm。3.6載玻片。專業(yè)資料整理WORD格式3.7酒精燈。4. 培養(yǎng)基和試劑4.1SCDLP液體培養(yǎng)基見總那么中

30、3.2 。4.27.5% 的氯化鈉肉湯成分：蛋白胨10g牛肉膏3g氯化鈉75g蒸餾水加至1000mL制法：將上述成分加熱溶解，調(diào)pH 為 7.4, 分裝， 103.43 kPa (121 15 lb)15min 高壓滅菌。4.3Baird Parker氏培養(yǎng)基成分：胰蛋白胨10g牛肉膏5g酵母浸膏1g丙酮酸鈉10g甘氨酸12g氯化鋰 LiCl · 6H2O5g瓊脂20g蒸餾水950mLpH 7.0 ± 0.2增菌劑的配制： 30%卵黃鹽水 50mL與除菌過濾的1%亞碲酸鉀溶液10mL混合，保存于冰箱內(nèi)。制法： 將各成分加到蒸餾水中，加熱煮沸完全溶解， 冷至 25±

31、 1校正 pH。分裝每瓶 95mL,103.43 kPa (121 15lb)高壓滅菌 15min 。臨用時加熱溶化瓊脂，每 95mL參加預(yù)熱至 50左右的卵黃亞碲酸鉀增菌劑5mL，搖勻后傾注平板。培養(yǎng)基應(yīng)是致密不透明的。使用前在冰箱貯存不得超過48h± 2h。4.4血瓊脂培養(yǎng)基成分：營養(yǎng)瓊脂100mL脫纖維羊血或兔血10mL制法：將營養(yǎng)瓊脂加熱融化，待冷至50左右無菌操作參加脫纖維羊血，搖勻，制成平板，置冰箱內(nèi)備用。4.5甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基成分：蛋白胨10g氯化鈉5g甘露醇10g牛肉膏5g0.2%麝香草酚藍(lán)溶液12mL蒸餾水1000mL制法：將蛋白胨、氯化鈉、牛肉膏加到蒸餾水中，加熱

32、溶解，調(diào)pH 7.4 ，參加甘露醇和指示劑，混勻后分裝試管中， 68.95 kPa (115 10 lb)20min滅菌備用。4.6兔人血漿制備專業(yè)資料整理WORD格式取 3.8%檸檬酸鈉溶液，103.43 kPa (121 15 lb)30min3000rpm 離心 3min 5min。血球下沉，取上面血漿。高壓滅菌，1 份加兔人全血4 份，混勻靜置；2000rpm專業(yè)資料整理WORD格式5. 操作步驟5.1增菌：取1：10 稀釋的樣品接種到90mL SCDLP液體培養(yǎng)基中，置36± 1培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24h±2h。注：如無此培養(yǎng)基也可用7.5%氯化鈉肉湯。5.2別離：自上述

33、增菌培養(yǎng)液中，取12 接種環(huán)，劃線接種在Baird Parker氏培養(yǎng)基，如無此培養(yǎng)基也可劃線接種到血瓊脂平板，置36± 1培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h 48h。在血瓊脂平板上菌落呈金黃色，大而突起，圓形，不透明，外表光滑，周圍有溶血圈。在Baird Parker氏培養(yǎng)基上為圓形，光滑，凸起，濕潤，直徑2mm 3mm,顏色呈灰色到黑色，邊緣為淡色，周圍為一混濁帶，在其外層有一透明帶。用接種針接觸菌落似有奶油樹膠的軟度。偶然會遇到非脂肪溶解的類似菌落，但無混濁帶及透明帶。挑取單個菌落分純在血瓊脂平板上，置36± 1培養(yǎng) 24h± 2h。5.3染色鏡檢：挑取分純菌落，涂片，進展革

34、蘭氏染色，鏡檢。金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性菌，排列成葡萄狀，無芽孢，無莢膜，致病性葡萄球菌，菌體較小，直徑約為0.5 m 1 m。5.4甘露醇發(fā)酵試驗：取上述分純菌落接種到甘露醇發(fā)酵培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基液面上參加2mm 3mm高的滅菌液體石蠟，置36± 1培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h± 2h, 金黃色葡萄球菌應(yīng)能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸。5.5血漿凝固酶試驗：吸取1：4 新鮮血漿 0.5 mL,放入滅菌小試管中，參加待檢菌24h± 2h 肉湯培養(yǎng)物0.5 mL?；靹?，放36± 1恒溫箱或恒溫水浴中，每半個小時觀察一次，6h 之內(nèi)如呈現(xiàn)凝塊即為陽性。同時以血漿凝固酶陽性和陰性菌株肉湯培養(yǎng)物及肉湯培養(yǎng)基各0.5 mL, 分別參加滅菌1：4 血