生物光子學(xué)5-02講述

1、主講人：劉立新西安電子科技大學(xué)1第第 5 章章生物光子學(xué)成像技術(shù)生物光子學(xué)成像技術(shù)2 物鏡：物鏡： 在顯微鏡中，在顯微鏡中，物鏡的作用是將樣品做第一次放大物鏡的作用是將樣品做第一次放大，形，形成中間像。成中間像。 物鏡是物鏡是決定顯微鏡的像的質(zhì)量、分辨率和放大倍數(shù)決定顯微鏡的像的質(zhì)量、分辨率和放大倍數(shù)的的最關(guān)鍵的光學(xué)部件。最關(guān)鍵的光學(xué)部件。 物鏡一般物鏡一般由幾個(gè)不同球面半徑的透鏡組合由幾個(gè)不同球面半徑的透鏡組合而成，放大而成，放大倍數(shù)越高、矯正程度越高的物鏡其構(gòu)造愈復(fù)雜。倍數(shù)越高、矯正程度越高的物鏡其構(gòu)造愈復(fù)雜。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)3常規(guī)物鏡的放大倍率等于常規(guī)物鏡的放大倍率等于b

2、/a=f/z=z/fb目鏡的放大倍率等于目鏡的放大倍率等于250/目鏡的焦距目鏡的焦距總大放大倍率等于物鏡與目鏡放大倍率的乘積總大放大倍率等于物鏡與目鏡放大倍率的乘積所有物鏡的使用都是有條件的，即所有物鏡的使用都是有條件的，即特定的鏡筒長度特定的鏡筒長度5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)4無窮遠(yuǎn)物鏡的放大倍率無窮遠(yuǎn)物鏡的放大倍率Tube lens的焦距和物鏡焦距的比值的焦距和物鏡焦距的比值ICS（infinity color-corrected system）物鏡的優(yōu)點(diǎn)：物鏡的優(yōu)點(diǎn)：物鏡和筒鏡之間的光是物鏡和筒鏡之間的光是平行光平行光，可在中間加濾光片、反光鏡等而不影響成像質(zhì)量，可在中間加濾光片

3、、反光鏡等而不影響成像質(zhì)量物鏡和筒鏡共同形成完全校正后的中間像，無需目鏡進(jìn)一步校正物鏡和筒鏡共同形成完全校正后的中間像，無需目鏡進(jìn)一步校正ICS物鏡的共同點(diǎn)：物鏡的共同點(diǎn)：相同的等焦面長度（相同的等焦面長度（45mm），可自由切換），可自由切換標(biāo)準(zhǔn)螺紋配合標(biāo)準(zhǔn)螺紋配合5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)5 物鏡的性能指標(biāo)：物鏡的性能指標(biāo)： 數(shù)值孔徑：數(shù)值孔徑：NA=n sin （自由）工作距離（自由）工作距離 這個(gè)距離不能夠小于這個(gè)距離不能夠小于0.1mm。在現(xiàn)代物鏡中，在現(xiàn)代物鏡中，自由工作距離和物自由工作距離和物鏡長度的總和被規(guī)定為一個(gè)固定的數(shù)值鏡長度的總和被規(guī)定為一個(gè)固定的數(shù)值。 物鏡的設(shè)計(jì)

4、原則：物鏡的設(shè)計(jì)原則：較低倍數(shù)的物鏡具有較少的透鏡，它被做得短較低倍數(shù)的物鏡具有較少的透鏡，它被做得短一些，具有較長的工作距離；較高倍數(shù)的透鏡具有很多透鏡，它一些，具有較長的工作距離；較高倍數(shù)的透鏡具有很多透鏡，它被做得較長一些，相應(yīng)地具有較短地工作距離。使用一組這樣的被做得較長一些，相應(yīng)地具有較短地工作距離。使用一組這樣的物鏡時(shí)，在轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換臺時(shí)，只需要用細(xì)調(diào)稍微聚焦就可以得物鏡時(shí)，在轉(zhuǎn)動物鏡轉(zhuǎn)換臺時(shí)，只需要用細(xì)調(diào)稍微聚焦就可以得到一個(gè)清晰的像。到一個(gè)清晰的像。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)6 分辨力和最小分辨距離：分辨力和最小分辨距離： 顯微鏡的分辨力主要由物鏡的分辨力所決定；顯微鏡的

5、分辨力主要由物鏡的分辨力所決定； 表示物鏡分辨力大小的參數(shù)是最小分辨距離（一般用表示物鏡分辨力大小的參數(shù)是最小分辨距離（一般用 表示），它是指物鏡可以分辨的兩個(gè)物點(diǎn)之間的最小表示），它是指物鏡可以分辨的兩個(gè)物點(diǎn)之間的最小距離。距離。NA61. 05.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)7衍射極限決定了光學(xué)顯微鏡的極限分辨力衍射極限決定了光學(xué)顯微鏡的極限分辨力, ,它和光波長它和光波長, ,數(shù)數(shù)值孔徑有關(guān)。值孔徑有關(guān)。分辨力和分辨率是兩個(gè)概念！分辨力和分辨率是兩個(gè)概念！ 浸潤物鏡：浸潤物鏡： 提高數(shù)值孔徑提高數(shù)值孔徑 干系、水浸、油浸干系、水浸、油浸 不能混用不能混用 標(biāo)記：標(biāo)記：W, OIL 數(shù)值孔徑

6、越大，對光的收集能力越強(qiáng)，空間分辨率越數(shù)值孔徑越大，對光的收集能力越強(qiáng)，空間分辨率越高。高。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)8NA=n sin 物鏡的校正類型：物鏡的校正類型： 物鏡除了放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和油浸系外，校正類型也物鏡除了放大倍數(shù)、數(shù)值孔徑和油浸系外，校正類型也很多很多 分為像差和色差的校正分為像差和色差的校正 消色差、半復(fù)消色差（消色差、半復(fù)消色差（ FL ）、復(fù)消色差（）、復(fù)消色差（ APO ）、平）、平面消色差（面消色差（ PL或或PLAN ）、平面復(fù)消色差（）、平面復(fù)消色差（ PLAN APO或或PL APO ）等五種物鏡）等五種物鏡5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)9 物鏡

7、的校正類型物鏡的校正類型-Cont ： 消色差物鏡：消色差物鏡：用于一般觀察，沒有特殊標(biāo)記。可以使兩種色彩用于一般觀察，沒有特殊標(biāo)記?？梢允箖煞N色彩（486和和656nm）的像點(diǎn)重合在一起。）的像點(diǎn)重合在一起。 半復(fù)消色差（螢石）物鏡：半復(fù)消色差（螢石）物鏡：標(biāo)記標(biāo)記FL或或Fluorite，它是由一種光學(xué)性，它是由一種光學(xué)性能不同于玻璃的礦物質(zhì)螢石（能不同于玻璃的礦物質(zhì)螢石（CaF2）所制成，可以很好地校正色）所制成，可以很好地校正色差，并且對球面差的校正也比消色差物鏡好。常用于高倍觀察和顯差，并且對球面差的校正也比消色差物鏡好。常用于高倍觀察和顯微照相。缺點(diǎn)：顯示出一定程度的場曲率微照相。

8、缺點(diǎn)：顯示出一定程度的場曲率 復(fù)消色差物鏡：復(fù)消色差物鏡：標(biāo)記標(biāo)記APO，它在紅綠藍(lán)三種色彩上對色差可以校正。，它在紅綠藍(lán)三種色彩上對色差可以校正。分辨率更高，價(jià)格昂貴。分辨率更高，價(jià)格昂貴。 平面消色差物鏡：平面消色差物鏡：標(biāo)記標(biāo)記PL和和PLAN，它除了具有消色差物鏡的性能，它除了具有消色差物鏡的性能外，最大的優(yōu)點(diǎn)是對于場曲率能進(jìn)行很好地校正外，最大的優(yōu)點(diǎn)是對于場曲率能進(jìn)行很好地校正 平面復(fù)消色差物鏡：平面復(fù)消色差物鏡：標(biāo)記標(biāo)記PLAN APO和和PL APO，它是一種可以既，它是一種可以既可以對場曲率進(jìn)行校正，而且在復(fù)消色差水平上可以對色差和球面可以對場曲率進(jìn)行校正，而且在復(fù)消色差水平上

9、可以對色差和球面差進(jìn)行校正的透鏡復(fù)合體。一般包含差進(jìn)行校正的透鏡復(fù)合體。一般包含815個(gè)由不同材料制成地單個(gè)由不同材料制成地單個(gè)透鏡，價(jià)格非常貴。個(gè)透鏡，價(jià)格非常貴。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù) 物鏡的標(biāo)記物鏡的標(biāo)記 ： 用用顏色編碼顏色編碼可快速識別可快速識別物鏡的放大倍率以及浸物鏡的放大倍率以及浸潤介質(zhì)的種類潤介質(zhì)的種類5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)11 物鏡的標(biāo)記物鏡的標(biāo)記 ：5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)12 目鏡目鏡 ： 目鏡的作用：目鏡的作用：對中間像進(jìn)一步對中間像進(jìn)一步放大，并成像到視網(wǎng)膜上放大，并成像到視網(wǎng)膜上 1 中間像位置，放十字線中間像位置，放十字線 2 視場視場

10、 3 目鏡鏡頭目鏡鏡頭 4 目鏡瞳孔位置目鏡瞳孔位置= 眼睛瞳孔眼睛瞳孔 5 屈光度補(bǔ)償?shù)木劢弓h(huán)屈光度補(bǔ)償?shù)木劢弓h(huán)5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)13 眼點(diǎn)：眼點(diǎn)： 如果在目鏡的上面放置一塊熒光透明物質(zhì)或場玻璃，就可以看到從如果在目鏡的上面放置一塊熒光透明物質(zhì)或場玻璃，就可以看到從目鏡中射出的光束呈陀螺形。在目鏡上面所出現(xiàn)的光線交叉點(diǎn)稱為目鏡中射出的光束呈陀螺形。在目鏡上面所出現(xiàn)的光線交叉點(diǎn)稱為眼點(diǎn)，也稱為出瞳眼點(diǎn)，也稱為出瞳。交叉點(diǎn)的橫切面呈圓盤狀，。交叉點(diǎn)的橫切面呈圓盤狀，直徑通常為直徑通常為1-1.5mm，在光學(xué)上它是顯微鏡所形成的物鏡孔徑的像。，在光學(xué)上它是顯微鏡所形成的物鏡孔徑的像。

11、 視場：視場： 目鏡改變目鏡改變放大倍率放大倍率 目鏡改變目鏡改變視場視場（環(huán)狀光闌）（環(huán)狀光闌） 視場直徑也稱視場范圍，視場直徑也稱視場范圍，是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容是指在顯微鏡下看到的圓形視場內(nèi)所能容納被檢物體的實(shí)際范圍，其納被檢物體的實(shí)際范圍，其大小大小等于目鏡的場值（視場數(shù)）除以物等于目鏡的場值（視場數(shù)）除以物鏡的放大倍數(shù)鏡的放大倍數(shù) 目鏡的場值目鏡的場值(field number，F(xiàn)N)，是目鏡的固定參數(shù)，標(biāo)刻在目鏡，是目鏡的固定參數(shù)，標(biāo)刻在目鏡的外面，單位的外面，單位mm5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)14目鏡的眼點(diǎn)和視場：目鏡的眼點(diǎn)和視場： 目鏡目鏡/物鏡組合的選用：

12、物鏡組合的選用： 為了達(dá)到同樣的放大倍率，為了達(dá)到同樣的放大倍率，可采用不同的目鏡可采用不同的目鏡/物鏡組合物鏡組合，但是，最佳的組合是應(yīng)該，但是，最佳的組合是應(yīng)該是既能保證對樣品細(xì)節(jié)的分是既能保證對樣品細(xì)節(jié)的分辨，又不至于做無用的放大辨，又不至于做無用的放大。有用的放大倍率應(yīng)該介于有用的放大倍率應(yīng)該介于(5001000)NA。(500-1000)NA=475-95060*15=90060*12.5=75060*10=60060* 25=150060*20=12005.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)15 集光器（聚光鏡）集光器（聚光鏡） 集光器的集光器的主要功能主要功能是照明樣品，將視是照明樣品

13、，將視場光闌成像在樣品上，而將孔徑光闌場光闌成像在樣品上，而將孔徑光闌成像在物鏡的光瞳上。好的集光器有成像在物鏡的光瞳上。好的集光器有利于顯微鏡達(dá)到其極限空間分辨率，利于顯微鏡達(dá)到其極限空間分辨率，改善樣品照明的均勻性。改善樣品照明的均勻性。 集光器有兩種：集光器有兩種：明視場集光器明視場集光器和和相差相差以及暗視場集光器以及暗視場集光器。 右圖所示是集光器和物鏡的組合。右圖所示是集光器和物鏡的組合。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)16 顯微鏡的照明方法臨界照明：顯微鏡的照明方法臨界照明： 直接照明物體，照明的光錐可以通過在集光器入瞳處的孔直接照明物體，照明的光錐可以通過在集光器入瞳處的孔徑光

14、闌而控制，照明區(qū)域的大小是通過視場光闌來調(diào)節(jié)。徑光闌而控制，照明區(qū)域的大小是通過視場光闌來調(diào)節(jié)。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 物場上光的強(qiáng)度不均勻物場上光的強(qiáng)度不均勻 當(dāng)使用低放大倍數(shù)時(shí)像的亮度太強(qiáng)當(dāng)使用低放大倍數(shù)時(shí)像的亮度太強(qiáng)5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)17 顯微鏡的照明方法柯勒照顯微鏡的照明方法柯勒照明：明： 透射顯微鏡中最普遍的照明方透射顯微鏡中最普遍的照明方式為柯勒照明，可以提供均勻式為柯勒照明，可以提供均勻明亮的視場，無閃耀，對樣品明亮的視場，無閃耀，對樣品加熱小。加熱小。 視場光圈和聚焦光闌視場光圈和聚焦光闌分別放在分別放在成像光路和照明光路的共軛面成像光路和照明光路的共軛面上，這樣就可以獨(dú)

15、立控制對樣上，這樣就可以獨(dú)立控制對樣品的照明角度和強(qiáng)度。品的照明角度和強(qiáng)度。G G5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)18 顯微照相顯微照相： 相機(jī)與顯微鏡的連接需要特殊設(shè)計(jì)的接口。相機(jī)與顯微鏡的連接需要特殊設(shè)計(jì)的接口。 接口的放大倍率接口的放大倍率取決于記錄單元的面積以及中間像的大小。取決于記錄單元的面積以及中間像的大小。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)19 由于相機(jī)的記錄媒介（膠卷）和由于相機(jī)的記錄媒介（膠卷）和CCD的面元尺寸的不同，因此其接的面元尺寸的不同，因此其接口光路是不同的，前者要對中間像做進(jìn)一步的放大，而后者則往往口光路是不同的，前者要對中間像做進(jìn)一步的放大，而后者則往往要縮小已經(jīng)

16、放大的像。要縮小已經(jīng)放大的像。 一般情況下，中間像的大小為一般情況下，中間像的大小為1520mm，而對于，而對于CCD相機(jī)，其有相機(jī)，其有效面元的尺寸要小于其標(biāo)稱值，比如，效面元的尺寸要小于其標(biāo)稱值，比如，1/2英寸英寸CCD的有效區(qū)域?qū)堑挠行^(qū)域?qū)蔷€長度為線長度為8mm，1/3英寸英寸CCD相機(jī)有效區(qū)域?qū)蔷€長度為相機(jī)有效區(qū)域?qū)蔷€長度為5.3mm等等等。因此在上頁圖中，選擇縮小一倍的接口可以基本上記錄大部分等。因此在上頁圖中，選擇縮小一倍的接口可以基本上記錄大部分中間像。中間像。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)20 視頻顯微成像技術(shù)電子放大視頻顯微成像技術(shù)電子放大： 如果將如果將CCD

17、相機(jī)或攝像機(jī)的輸出接到監(jiān)視器上相機(jī)或攝像機(jī)的輸出接到監(jiān)視器上，那么總，那么總的放大倍率將是光學(xué)和電子放大倍率的乘積。的放大倍率將是光學(xué)和電子放大倍率的乘積。 光學(xué)放大倍率為：光學(xué)放大倍率為：Moptical=MobjectiveMadapter 電子放大倍率電子放大倍率為：為：Melectronic=diagonalmonitor/diagonalsensor 總的放大倍率為總的放大倍率為Moveral=MopticalMelectronic5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)21 顯微鏡從光路上分有兩種透射和反射顯微鏡從光路上分有兩種透射和反射：5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)22 正立和倒置顯

18、微鏡正立和倒置顯微鏡：5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)23倒置顯微鏡：光路長，光損較大，光路設(shè)倒置顯微鏡：光路長，光損較大，光路設(shè)計(jì)較復(fù)雜，對樣品高低無要求，檢測方便計(jì)較復(fù)雜，對樣品高低無要求，檢測方便快速，不適合多視場分析，價(jià)格高?？焖?，不適合多視場分析，價(jià)格高。正立顯微鏡：光路設(shè)計(jì)簡單，光損正立顯微鏡：光路設(shè)計(jì)簡單，光損少，樣品高度有要求，方便多視場少，樣品高度有要求，方便多視場觀察，鏡頭不易落灰易維護(hù)。觀察，鏡頭不易落灰易維護(hù)。 1）暗場顯微鏡）暗場顯微鏡：暗場顯微鏡技術(shù)是利用暗場顯微鏡技術(shù)是利用斜射照明法斜射照明法阻阻擋透過標(biāo)本細(xì)節(jié)的直射光，以反射光擋透過標(biāo)本細(xì)節(jié)的直射光，以反射光和衍

19、射光來觀察標(biāo)本。和衍射光來觀察標(biāo)本。暗場顯微鏡的最關(guān)鍵部件是暗場顯微鏡的最關(guān)鍵部件是暗場聚光暗場聚光鏡鏡，能把投射到它表面的包含各個(gè)立，能把投射到它表面的包含各個(gè)立體角的光，轉(zhuǎn)換成一個(gè)體角的光，轉(zhuǎn)換成一個(gè)中空的光錐束中空的光錐束，并讓這個(gè)光錐束的頂點(diǎn)中心在樣品，并讓這個(gè)光錐束的頂點(diǎn)中心在樣品表面。表面。在普通顯微鏡下直射光透過標(biāo)本，看在普通顯微鏡下直射光透過標(biāo)本，看到的是物體形態(tài)和結(jié)構(gòu)。而到的是物體形態(tài)和結(jié)構(gòu)。而在暗場顯在暗場顯微鏡下微鏡下從側(cè)面照射到物體的光束，繞從側(cè)面照射到物體的光束，繞射或反射造成物體外形的側(cè)影，射或反射造成物體外形的側(cè)影，看到看到的是物體的輪廓或物體的運(yùn)動。的是物體的輪

20、廓或物體的運(yùn)動。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)24顯微鏡的幾種觀察方式顯微鏡的幾種觀察方式 暗場顯微鏡暗場顯微鏡： 效果對比效果對比5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)25 2）相襯顯微鏡）相襯顯微鏡： 顯微鏡樣品的像的形成取決于由樣品所引起的光的變化，在光學(xué)顯顯微鏡樣品的像的形成取決于由樣品所引起的光的變化，在光學(xué)顯微鏡中，最主要的變化是微鏡中，最主要的變化是振幅變化和相位變化振幅變化和相位變化，在入射照明和透射，在入射照明和透射照明中這兩個(gè)因素以不同的程度同時(shí)發(fā)生。照明中這兩個(gè)因素以不同的程度同時(shí)發(fā)生。 常規(guī)顯微鏡中，像的反差主要是由光的吸收差異所引起的常規(guī)顯微鏡中，像的反差主要是由光的吸收

21、差異所引起的。當(dāng)用單當(dāng)用單色光照明時(shí)，改變了光的振幅，色光照明時(shí)，改變了光的振幅，于是各個(gè)結(jié)構(gòu)部分顯示出不同的亮于是各個(gè)結(jié)構(gòu)部分顯示出不同的亮度；度；當(dāng)用白光照明時(shí)，由于吸收的不同改變了光譜的成分，當(dāng)用白光照明時(shí)，由于吸收的不同改變了光譜的成分，不同的不同的結(jié)構(gòu)部分便顯示出不同的色彩。結(jié)構(gòu)部分便顯示出不同的色彩。 當(dāng)光波通過一個(gè)當(dāng)光波通過一個(gè)具有不同折射率的復(fù)雜透明物體具有不同折射率的復(fù)雜透明物體（如未染色的生物（如未染色的生物學(xué)切片），振幅保持不變，學(xué)切片），振幅保持不變，光的傳播速度會發(fā)生變化光的傳播速度會發(fā)生變化。 5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)26 相襯顯微鏡相襯顯微鏡（1934,

22、Zernike） : 光入射到折射率較高的介質(zhì)中，光入射到折射率較高的介質(zhì)中，傳播速度降低，離開介質(zhì)后，振傳播速度降低，離開介質(zhì)后，振幅不變，但出現(xiàn)了幅不變，但出現(xiàn)了相位差相位差。 通過一定的光學(xué)裝置可以通過一定的光學(xué)裝置可以把相位把相位變化轉(zhuǎn)變?yōu)檎穹兓巡豢梢娮兓D(zhuǎn)變?yōu)檎穹兓?，把不可見的相位像變?yōu)榭梢姷恼穹?，把的相位像變?yōu)榭梢姷恼穹?，把介質(zhì)折射率或厚度的差異變?yōu)楣饨橘|(zhì)折射率或厚度的差異變?yōu)楣鈴?qiáng)度的差異，強(qiáng)度的差異，這就是相襯顯微鏡這就是相襯顯微鏡所依據(jù)的光學(xué)原理。所依據(jù)的光學(xué)原理。 相襯顯微鏡可以用來觀察未染色相襯顯微鏡可以用來觀察未染色的活體組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。的活體組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)。

23、5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)27 相襯顯微鏡：相襯顯微鏡：明場和相襯顯微鏡下的細(xì)胞圖像明場和相襯顯微鏡下的細(xì)胞圖像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)28 3）偏光顯微鏡）偏光顯微鏡： 偏光顯微鏡是一種具有偏光顯微鏡是一種具有起偏器、檢偏器和補(bǔ)償器起偏器、檢偏器和補(bǔ)償器等裝置的特殊顯微等裝置的特殊顯微鏡，它可以用于對于鏡，它可以用于對于具有各向異性的生物學(xué)材料具有各向異性的生物學(xué)材料如纖維蛋白、淀粉如纖維蛋白、淀粉粒、紡錘絲等的觀察和定量研究。粒、紡錘絲等的觀察和定量研究。 光的偏振光的偏振 自然光自然光 線偏振線偏振 圓偏振圓偏振 各向同性物質(zhì)各向同性物質(zhì)單折射性單折射性 各向異性物質(zhì)各向異

24、性物質(zhì)雙折射性雙折射性 o光：服從通常的折射定律光：服從通常的折射定律 e光：具有不同于正常光線的傳播速度和折射率，異常光線的傳播速度光：具有不同于正常光線的傳播速度和折射率，異常光線的傳播速度隨著通過雙折射材料光線的方向而變化。隨著通過雙折射材料光線的方向而變化。 在任何各向異性的材料中，至少可以找到一個(gè)方向，在這個(gè)方向上在任何各向異性的材料中，至少可以找到一個(gè)方向，在這個(gè)方向上o光光和和e光的傳播速度相等，這個(gè)方向稱為光軸。光的傳播速度相等，這個(gè)方向稱為光軸。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)29 偏光顯微鏡偏光顯微鏡： 右圖：偏光顯微鏡的原理示意圖右圖：偏光顯微鏡的原理示意圖 偏光顯微鏡的

25、特點(diǎn)偏光顯微鏡的特點(diǎn)，就是將普通光改，就是將普通光改變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別變?yōu)槠窆膺M(jìn)行鏡檢的方法，以鑒別某一物質(zhì)是單折射性（各向同性）或某一物質(zhì)是單折射性（各向同性）或雙折射性（各向異性）。雙折射性（各向異性）。 起偏器與檢偏器起偏器與檢偏器5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)30 偏光顯微鏡偏光顯微鏡：下圖：聚合體纖維（下圖：聚合體纖維（Polymer fiber）的）的明場像、偏光像以及彩色偏光像明場像、偏光像以及彩色偏光像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)31 偏光顯微鏡偏光顯微鏡：5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)32高密度柱狀六角液晶小牛胸腺高密度柱狀六角液晶小牛胸腺DNA的顯微

26、照片（濃度大約的顯微照片（濃度大約450毫克毫克/毫升，毫升，10X物鏡的偏光顯微鏡測量）物鏡的偏光顯微鏡測量） 4）微分干涉顯微鏡（）微分干涉顯微鏡（DIC）：）： 使照明光束通過起偏器并投射到石使照明光束通過起偏器并投射到石英棱鏡上，在膠合面上光束分為尋英棱鏡上，在膠合面上光束分為尋常光（常光（o光）和非尋常光（光）和非尋常光（e光）平光）平行地透過樣品，經(jīng)物鏡后重新被兩行地透過樣品，經(jīng)物鏡后重新被兩個(gè)石英棱鏡會聚，可觀察到樣品面?zhèn)€石英棱鏡會聚，可觀察到樣品面或內(nèi)部的微小起伏圖像的顯微鏡。或內(nèi)部的微小起伏圖像的顯微鏡。 沃拉斯頓棱鏡沃拉斯頓棱鏡5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)33 微分干涉

27、顯微鏡：微分干涉顯微鏡： 在光路上與偏光顯微鏡類似，但在透射光路中在光路上與偏光顯微鏡類似，但在透射光路中多了一對雙折射晶體（多了一對雙折射晶體（2,6沃拉斯頓棱鏡沃拉斯頓棱鏡）；）； 第一個(gè)晶體用于將偏振光分解為兩個(gè)振動方向第一個(gè)晶體用于將偏振光分解為兩個(gè)振動方向垂直的偏振光，并發(fā)生橫向的位移；垂直的偏振光，并發(fā)生橫向的位移； 如果兩個(gè)雙折射光束通過完全相同的樣品結(jié)構(gòu)如果兩個(gè)雙折射光束通過完全相同的樣品結(jié)構(gòu)，那么經(jīng)過樣品后光程不會發(fā)生變化；但如果，那么經(jīng)過樣品后光程不會發(fā)生變化；但如果兩束光經(jīng)過的結(jié)構(gòu)不同，那么到達(dá)像面時(shí)光程兩束光經(jīng)過的結(jié)構(gòu)不同，那么到達(dá)像面時(shí)光程差會發(fā)生變化；差會發(fā)生變化；

28、 雙折射晶體雙折射晶體6消除兩束偏振光的橫向移動，而消除兩束偏振光的橫向移動，而檢偏器檢偏器7選擇和其振動方向相同的移相波列；選擇和其振動方向相同的移相波列； 這兩列光波在像面發(fā)生干涉，將這兩列光波在像面發(fā)生干涉，將光程差轉(zhuǎn)換為光程差轉(zhuǎn)換為強(qiáng)度差強(qiáng)度差并成像。并成像。5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)34 微分干涉顯微鏡：微分干涉顯微鏡：5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)35（a）綠頭蒼蠅嘴部的）綠頭蒼蠅嘴部的Nomarski透射光透射光DIC顯微照片；顯微照片；（b）硅鐵合金表面瑕疵的反射光）硅鐵合金表面瑕疵的反射光DIC顯微照片。顯微照片。Quiz 1常用的生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)有哪些？這些成像技常

29、用的生物醫(yī)學(xué)成像技術(shù)有哪些？這些成像技術(shù)相對于光學(xué)成像有哪些缺點(diǎn)？術(shù)相對于光學(xué)成像有哪些缺點(diǎn)？光學(xué)成像的優(yōu)點(diǎn)是什么？光學(xué)成像的優(yōu)點(diǎn)是什么？顯微鏡的主要部件有什么？顯微鏡的放大倍率顯微鏡的主要部件有什么？顯微鏡的放大倍率等于什么？等于什么？物鏡鏡體上的物鏡鏡體上的100 /1.4 Oil意思是什么？意思是什么？按照所成圖像的對比度不同，顯微鏡有哪幾種按照所成圖像的對比度不同，顯微鏡有哪幾種（說出三種的名字）？（說出三種的名字）？5.1 光學(xué)成像光學(xué)成像5.2 光學(xué)顯微技術(shù)光學(xué)顯微技術(shù)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5.4 激光掃描共聚焦顯微技術(shù)激光掃描共聚焦顯微技術(shù) 5.5 多光子激發(fā)熒光顯微技

30、術(shù)多光子激發(fā)熒光顯微技術(shù) 5.6 全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù)全內(nèi)反射熒光顯微技術(shù) 5.7 熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)熒光共振能量轉(zhuǎn)移成像技術(shù)5.8 熒光壽命成像顯微技術(shù)熒光壽命成像顯微技術(shù)5.9 光學(xué)相干層析成像技術(shù)光學(xué)相干層析成像技術(shù)5.10 非線性光學(xué)成像技術(shù)非線性光學(xué)成像技術(shù)5.11 生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢生物光子學(xué)成像技術(shù)的發(fā)展趨勢本本 章章 內(nèi)內(nèi) 容容3738 什么是熒光什么是熒光 熒光顯微技術(shù)及其優(yōu)點(diǎn)熒光顯微技術(shù)及其優(yōu)點(diǎn) 熒光探針（種類）熒光探針（種類） 常見的熒光顯微技術(shù)：常見的熒光顯微技術(shù)： 全場熒光顯微技術(shù)：顯微鏡的結(jié)構(gòu)全場熒光顯微技術(shù)：顯微鏡的結(jié)構(gòu) 圖像獲?。ㄕ障啵┖吞幚韴D像

31、獲取（照相）和處理 熒光顯微技術(shù)存在的問題熒光顯微技術(shù)存在的問題 網(wǎng)上資源：網(wǎng)上資源： Introduction to Optical Microscopy,Digital Imaging, and Photomicrography /primer/index.html 5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)3939主要內(nèi)容：主要內(nèi)容： 熒光原理：熒光原理： A-吸收光子吸收光子 F-熒光發(fā)射熒光發(fā)射 P-磷光磷光 S-單線態(tài)單線態(tài) T-三線態(tài)三線態(tài) IC-內(nèi)轉(zhuǎn)換內(nèi)轉(zhuǎn)換 ISC-系間交叉系間交叉n定義：

32、某些原子或分子吸收特定波長定義：某些原子或分子吸收特定波長 的光，并在短暫的光，并在短暫 (10-9-10-7s)停留后發(fā)停留后發(fā)射波長射波長 更長的光更長的光 (Stokes紅移紅移)，（光子的能量，（光子的能量E1/ )；n熒光現(xiàn)象與光學(xué)顯微技術(shù)結(jié)合熒光現(xiàn)象與光學(xué)顯微技術(shù)結(jié)合-熒光顯微熒光顯微 (熒光探針熒光探針)n研究細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；細(xì)胞動力學(xué)研究細(xì)胞和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)；細(xì)胞動力學(xué) (比如擴(kuò)散、酶動力反應(yīng)速率、細(xì)比如擴(kuò)散、酶動力反應(yīng)速率、細(xì)胞功能胞功能 (比如比如 細(xì)胞的外吐細(xì)胞的外吐/內(nèi)吞作用內(nèi)吞作用)；免疫化學(xué)；監(jiān)測；免疫化學(xué)；監(jiān)測pH值、離子濃度、值、離子濃度、單個(gè)靶分子等。單個(gè)靶分子

33、等。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)401、什么是熒光、什么是熒光熒光的特征參量包括：熒光的特征參量包括：位置：位置：結(jié)構(gòu)信息結(jié)構(gòu)信息強(qiáng)度：強(qiáng)度：濃度信息濃度信息波長：波長：組分信息組分信息壽命：壽命：微環(huán)境信息微環(huán)境信息偏振：偏振：分子構(gòu)象體積及微環(huán)境信息分子構(gòu)象體積及微環(huán)境信息5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4141樣品excfluo熒光強(qiáng)度激發(fā)光譜激發(fā)光譜熒光光譜熒光光譜激光 excfluo光譜儀探測器波長、激發(fā)和發(fā)射譜波長、激發(fā)和發(fā)射譜5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4242Stokes紅移：紅移： 熒光分子在液體中可以觀察到斯托克斯紅移，原因：熒光分子在液體中可以觀察到斯托克斯紅移，

34、原因： 激發(fā)分子在發(fā)射熒光前快速的從較高的振動態(tài)退激發(fā)回到激發(fā)分子在發(fā)射熒光前快速的從較高的振動態(tài)退激發(fā)回到S1的最的最低振動能級。低振動能級。 熒光發(fā)射時(shí)，分子回到基態(tài)的較高振動能級。熒光發(fā)射時(shí)，分子回到基態(tài)的較高振動能級。 由于熒光團(tuán)存在的溶劑效應(yīng)、激發(fā)態(tài)反應(yīng)、形成復(fù)雜的大分子以由于熒光團(tuán)存在的溶劑效應(yīng)、激發(fā)態(tài)反應(yīng)、形成復(fù)雜的大分子以及能量轉(zhuǎn)移等，也會產(chǎn)生斯托克斯紅移。及能量轉(zhuǎn)移等，也會產(chǎn)生斯托克斯紅移。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4343 熒光發(fā)射譜一般與激發(fā)光的波長無關(guān)：熒光發(fā)射譜一般與激發(fā)光的波長無關(guān)： 在熒光團(tuán)分子被激發(fā)到高的電子態(tài)和振動能級后，過多的能量迅在熒光團(tuán)分子被激發(fā)到

35、高的電子態(tài)和振動能級后，過多的能量迅速被損耗掉，使得熒光團(tuán)分子停留在速被損耗掉，使得熒光團(tuán)分子停留在S1的最低振動能級。這個(gè)退的最低振動能級。這個(gè)退激發(fā)過程一般在激發(fā)過程一般在1012 s內(nèi)完成，是由于許多能量相等的不同振動內(nèi)完成，是由于許多能量相等的不同振動能級重疊而引起的。正是由于這個(gè)快速的退激發(fā)過程，因此熒光能級重疊而引起的。正是由于這個(gè)快速的退激發(fā)過程，因此熒光的發(fā)射譜一般與激發(fā)波長無關(guān)。的發(fā)射譜一般與激發(fā)波長無關(guān)。 存在一些例外：存在一些例外： 對存在兩種離子化狀態(tài)的熒光團(tuán)，每一個(gè)都有不同的吸收和發(fā)射對存在兩種離子化狀態(tài)的熒光團(tuán)，每一個(gè)都有不同的吸收和發(fā)射譜。而且有些分子是從譜。而且

36、有些分子是從S2態(tài)發(fā)射熒光，不過，這些熒光發(fā)射一般態(tài)發(fā)射熒光，不過，這些熒光發(fā)射一般很少，在生物分子中很少見到。很少，在生物分子中很少見到。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)444430040050060070002040608010012014030000150002000025000fluorescencex 103molar extinction (1/cm M)wavelength (nm)wavenumber (cmwavenumber (cm-1-1) )S S2 2S S0 0S S1 1S S0 0S S1 1S S0 0vibronicvibronicvibronicvibro

37、nicNNNH2OSO3-O3SCy3Cy3的吸收和發(fā)射譜的吸收和發(fā)射譜5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4545Q 發(fā)射的光子數(shù)吸收的光子數(shù)熒光的量子產(chǎn)額：熒光的量子產(chǎn)額：發(fā)射光子數(shù)與吸收光子數(shù)之比，反映發(fā)射光子數(shù)與吸收光子數(shù)之比，反映了熒光團(tuán)的發(fā)射效率。了熒光團(tuán)的發(fā)射效率。熒光強(qiáng)度熒光強(qiáng)度正比于熒光團(tuán)所吸收的光與它的量子產(chǎn)額的乘積。正比于熒光團(tuán)所吸收的光與它的量子產(chǎn)額的乘積。xQIF0cI0: 入射到樣品溶液的激發(fā)光的強(qiáng)度入射到樣品溶液的激發(fā)光的強(qiáng)度: 發(fā)色團(tuán)的摩爾消光系數(shù)發(fā)色團(tuán)的摩爾消光系數(shù)c: 熒光團(tuán)的濃度熒光團(tuán)的濃度x: 光穿過溶液的路徑長度光穿過溶液的路徑長度0Q15.3 熒光顯微技

38、術(shù)熒光顯微技術(shù)4646熒光壽命：熒光壽命：是熒光分子的本征參量，定義為熒光分子被激發(fā)后，是熒光分子的本征參量，定義為熒光分子被激發(fā)后，回到基態(tài)并發(fā)射熒光分子之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間?；氐交鶓B(tài)并發(fā)射熒光分子之前在激發(fā)態(tài)平均停留的時(shí)間。)t(0e II(t)熒光壽命也定義為熒光強(qiáng)度衰減到初始強(qiáng)度熒光壽命也定義為熒光強(qiáng)度衰減到初始強(qiáng)度 I0 的的1/e （即（即37% ）所需的時(shí)間。）所需的時(shí)間。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4747( )exp(/)iiI tat量子產(chǎn)額、本征壽命和測量壽命的關(guān)系量子產(chǎn)額、本征壽命和測量壽命的關(guān)系1rnrkk 1nrk rnrnrkQkk intrinsic

39、lifetimemeasured lifetimequantum yieldknrkrS0S15.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)4848kr ：輻射衰減常數(shù)：輻射衰減常數(shù)knr ：非輻射衰減常數(shù)：非輻射衰減常數(shù) 與其它光學(xué)顯微（基于樣品宏觀結(jié)構(gòu)不同，如相位梯度與其它光學(xué)顯微（基于樣品宏觀結(jié)構(gòu)不同，如相位梯度、光吸收、雙折射等）不同，、光吸收、雙折射等）不同，熒光顯微基于熒光發(fā)射特?zé)晒怙@微基于熒光發(fā)射特征，能夠?qū)畏肿臃N類及其分布進(jìn)行成像征，能夠?qū)畏肿臃N類及其分布進(jìn)行成像。 自體熒光：生物樣品本身發(fā)射熒光自體熒光：生物樣品本身發(fā)射熒光 外源熒光：需要用能夠發(fā)射熒光的化學(xué)試劑標(biāo)記樣品。外源熒光：需

40、要用能夠發(fā)射熒光的化學(xué)試劑標(biāo)記樣品。 熒光探針熒光探針=熒光染料（能夠?qū)崿F(xiàn)電子躍遷的分子）熒光染料（能夠?qū)崿F(xiàn)電子躍遷的分子） 當(dāng)連接到大分子上時(shí)（核酸、蛋白質(zhì)）當(dāng)連接到大分子上時(shí)（核酸、蛋白質(zhì)）= 熒光團(tuán)（內(nèi)源熒光團(tuán)（內(nèi)源熒光團(tuán)，如熒光團(tuán)，如GFP、芳香族化合物、卟啉、外部合成的染、芳香族化合物、卟啉、外部合成的染料、抗體等）料、抗體等）5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)492、熒光顯微技術(shù)、熒光顯微技術(shù)反射光路熒光顯微反射光路熒光顯微 = 入射入射光熒光顯微光熒光顯微= episcopic fl =epi-fl ：是目前全場、共是目前全場、共焦和多光子熒光顯微鏡所焦和多光子熒光顯微鏡所采用的結(jié)

41、構(gòu)。采用的結(jié)構(gòu)。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)50落射熒光顯微鏡落射熒光顯微鏡熒光顯微技術(shù)是生命科學(xué)研究的重要工具，其優(yōu)點(diǎn)包括：熒光顯微技術(shù)是生命科學(xué)研究的重要工具，其優(yōu)點(diǎn)包括：p 利用濾光片消除激發(fā)光，具有高的成像對比度和信噪比；利用濾光片消除激發(fā)光，具有高的成像對比度和信噪比；p 可以在可以在2D或或3D空間測量樣品的熒光參量（如強(qiáng)度、壽命、波長和空間測量樣品的熒光參量（如強(qiáng)度、壽命、波長和偏振等），多維、信息量大；偏振等），多維、信息量大；p 無損或損傷??；無損或損傷??；p 適用于活體細(xì)胞和組織；適用于活體細(xì)胞和組織；p 可測量樣品的自體熒光，或者用熒光探針（染料、熒光蛋白、量子可測量

42、樣品的自體熒光，或者用熒光探針（染料、熒光蛋白、量子點(diǎn)等）標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，并進(jìn)行定位。點(diǎn)等）標(biāo)記活細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白，并進(jìn)行定位。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5151激發(fā)濾光片激發(fā)濾光片(EF)(EF)選擇激發(fā)光波長，選擇激發(fā)光波長，截止濾光片截止濾光片(BF)(BF)選擇波長更長的弱熒光信號，選擇波長更長的弱熒光信號， 從而從而使熒光圖像具有暗背景，因此靈敏度高。使用使熒光圖像具有暗背景，因此靈敏度高。使用雙色分束鏡（雙色分束鏡（DMDM）將激發(fā)光和熒光分離。將激發(fā)光和熒光分離。雙色鏡在反射式熒光顯微照明中的作用雙色鏡在反射式熒光顯微照明中的作用5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)52

43、3 3、熒光探針、熒光探針5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)53 用于生物成像的有內(nèi)源性（用于生物成像的有內(nèi)源性（endogenous）熒光團(tuán)）熒光團(tuán)和外源性（和外源性（exogenous）熒光團(tuán)。）熒光團(tuán)。理想的熒光團(tuán)必須滿足以下要求：理想的熒光團(tuán)必須滿足以下要求： 熒光團(tuán)在生物媒質(zhì)中具有很好的分散性，便于探測；熒光團(tuán)在生物媒質(zhì)中具有很好的分散性，便于探測； 具有和目標(biāo)分子、細(xì)胞器或細(xì)胞特定結(jié)合的能力；具有和目標(biāo)分子、細(xì)胞器或細(xì)胞特定結(jié)合的能力； 高量子輻射效率；高量子輻射效率； 環(huán)境穩(wěn)定性；環(huán)境穩(wěn)定性； 不會有光漂白現(xiàn)象。不會有光漂白現(xiàn)象。53生物學(xué)中所使用的熒光探針生物學(xué)中所使用的熒光探針

44、自體熒光自體熒光熒光染料熒光染料熒光蛋白熒光蛋白量子點(diǎn)量子點(diǎn)( (納米晶體納米晶體) )內(nèi)源的亮度高，不同光譜范圍，相對穩(wěn)定，大的斯托克斯紅移，小尺寸，可對環(huán)境敏感與目標(biāo)蛋白融合，活細(xì)胞表達(dá)，用于標(biāo)記破壞，對微環(huán)境參數(shù)敏感亮度非常高，光穩(wěn)定性好，譜可調(diào)諧，激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄不可控制，一般為干擾噪聲細(xì)胞內(nèi)蛋白的特異標(biāo)記困難，抗體標(biāo)記，細(xì)胞一般要固定選擇性有限，光穩(wěn)定性低，亮度低，譜重疊大（5nm）細(xì)胞內(nèi)的特異標(biāo)記比染料更為困難，尺寸大（10-15nm）5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)54熒光團(tuán)種類熒光團(tuán)種類 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 缺點(diǎn)缺點(diǎn)541 1）內(nèi)源性熒光團(tuán)）內(nèi)源性熒光團(tuán)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)

45、55吸收光譜吸收光譜熒光光譜熒光光譜常見內(nèi)源性熒光團(tuán)：黃素常見內(nèi)源性熒光團(tuán)：黃素(flavin)、NAD(P)H、脂褐素、脂褐素(lipofuscin)、彈性蛋白、彈性蛋白(elastin)和膠原質(zhì)和膠原質(zhì)(collagen)等。等。55重要特性：重要特性：消光系數(shù)消光系數(shù)量子效率量子效率斯托克斯紅移斯托克斯紅移光譜寬度光譜寬度 觀察時(shí)間觀察時(shí)間光穩(wěn)定性光穩(wěn)定性壽命壽命5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)562 2）熒光染料）熒光染料對細(xì)胞進(jìn)行染色對細(xì)胞進(jìn)行染色56亮度亮度譜分離譜分離Nobel Prize bovine vascular endothelial cellDIC: bovine v

46、ascular endothelial cellThree-color fluorescenceThree-color fluorescence熒光標(biāo)記可以分辨生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)熒光標(biāo)記可以分辨生物樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)5757負(fù)鼠腎臟上皮細(xì)胞（負(fù)鼠腎臟上皮細(xì)胞（OK線）線）人宮頸腺癌細(xì)胞人宮頸腺癌細(xì)胞 (HeLa Line) 采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以使細(xì)胞本身發(fā)出熒光，產(chǎn)生自己的探針。采用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，可以使細(xì)胞本身發(fā)出熒光，產(chǎn)生自己的探針。如如GFP，YFP，DsRed，CFP等。等。研究生命的分子過程；研究生命的分子過程；實(shí)現(xiàn)分辨率達(dá)到實(shí)現(xiàn)分辨率達(dá)到10nm的單分子

47、成像；的單分子成像；在納米尺度對細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用以及組織中細(xì)胞的相互作用進(jìn)行成像。在納米尺度對細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用以及組織中細(xì)胞的相互作用進(jìn)行成像。3 3）熒光蛋白）熒光蛋白5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)58584）量子點(diǎn)）量子點(diǎn)Quantum dots又稱為半導(dǎo)體納米微晶體（又稱為半導(dǎo)體納米微晶體（semiconductor nanocrystal），是一種由），是一種由-族或族或-族元素組成的納米顆粒。目前研究較多的主要是族元素組成的納米顆粒。目前研究較多的主要是CdX（X=S, Se, Te）QD由于由于粒徑很小（約粒徑很小（約1100nm），），電子和空穴被量子限域，連續(xù)能電子和

48、空穴被量子限域，連續(xù)能帶變成具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，因此光學(xué)行為與一些大分子帶變成具有分子特性的分立能級結(jié)構(gòu)，因此光學(xué)行為與一些大分子很相似，可以發(fā)射熒光很相似，可以發(fā)射熒光 。與傳統(tǒng)熒光團(tuán)（有機(jī)染料）相比，量子點(diǎn)具有與傳統(tǒng)熒光團(tuán)（有機(jī)染料）相比，量子點(diǎn)具有窄的、可調(diào)的、對稱窄的、可調(diào)的、對稱的發(fā)射光譜的發(fā)射光譜、高的發(fā)光亮度和光化學(xué)穩(wěn)定性高的發(fā)光亮度和光化學(xué)穩(wěn)定性，可應(yīng)用于生物單分子，可應(yīng)用于生物單分子檢測和生物納米技術(shù)。檢測和生物納米技術(shù)。5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)59595.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)60605.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)6161Quantum dots5.

49、3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)62激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄且對稱。激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄且對稱。62Quantum dots5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)63尺寸不同，發(fā)射譜不同；尺寸不同，發(fā)射譜不同；激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄且對稱。激發(fā)譜寬，發(fā)射譜窄且對稱。63生物納米顆粒生物納米顆粒NP 單量子點(diǎn)易受雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，量子效率低。但單量子點(diǎn)易受雜質(zhì)和晶格缺陷的影響，量子效率低。但當(dāng)以其為核心，用另一種半導(dǎo)體材料包覆，形成核殼結(jié)當(dāng)以其為核心，用另一種半導(dǎo)體材料包覆，形成核殼結(jié)構(gòu)后，就可將量子產(chǎn)率提高到約構(gòu)后，就可將量子產(chǎn)率提高到約50%甚至更高，并在消甚至更高，并在消光系數(shù)上有數(shù)倍的增加，因而有很強(qiáng)的熒

50、光發(fā)射。光系數(shù)上有數(shù)倍的增加，因而有很強(qiáng)的熒光發(fā)射。 目前已合成了多種核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒，如目前已合成了多種核殼結(jié)構(gòu)的納米顆粒，如CdS/Ag2S, CdS/Cd(OH)2, CdS/ZnS, ZnS/CdSe, ZnSe/CdSe, CdS/HgS, CdS/PbS等以及多層結(jié)構(gòu)的等以及多層結(jié)構(gòu)的CdS/HgS/CdS。 5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)6464生物納米顆粒生物納米顆粒NP 以以CdSe為核心為核心ZnS為外殼的納米顆粒為外殼的納米顆粒(CdSe)ZnS具有許多具有許多特別的光學(xué)特性：特別的光學(xué)特性： 激發(fā)波長范圍很寬，激發(fā)波長范圍很寬， 因此不同大小的因此不同大小的(CdS

51、e)ZnS量子點(diǎn)可以由同一量子點(diǎn)可以由同一波長的光激發(fā)，給生物學(xué)研究帶來很大方便；而對于不同的有機(jī)波長的光激發(fā)，給生物學(xué)研究帶來很大方便；而對于不同的有機(jī)熒光分子則很難做到，常常要用不同波長的光來激發(fā)。熒光分子則很難做到，常常要用不同波長的光來激發(fā)。 具有較大的斯托克紅移和狹窄對稱的熒光譜峰（半高峰寬具有較大的斯托克紅移和狹窄對稱的熒光譜峰（半高峰寬FWHM常常只有常常只有40nm或更?。?，這樣就允許同時(shí)使用不同光譜特征的量或更?。?，這樣就允許同時(shí)使用不同光譜特征的量子點(diǎn)，而發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊，或只有很少交疊，使標(biāo)記生物分子點(diǎn)，而發(fā)射光譜不出現(xiàn)交疊，或只有很少交疊，使標(biāo)記生物分子熒光譜的區(qū)分、

52、識別變得很容易。子熒光譜的區(qū)分、識別變得很容易。 5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)65655.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)6666定位定位(蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)、DNA和脂類和脂類)：靶標(biāo)定位：靶標(biāo)定位相互作用、構(gòu)象變化：成像、追蹤相互作用、構(gòu)象變化：成像、追蹤細(xì)胞環(huán)境的測量細(xì)胞環(huán)境的測量 (pH, Ca2+, 酶活動酶活動)：探針測量：探針測量基因表達(dá)：成像基因表達(dá)：成像選擇探針的依據(jù)選擇探針的依據(jù):光譜分離光譜分離毒性毒性光穩(wěn)定性光穩(wěn)定性亮度亮度5 5）熒光探針的在體應(yīng)用）熒光探針的在體應(yīng)用5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)67674 4、常見的熒光顯微技術(shù)、常見的熒光顯微技術(shù)全場熒光顯微全場熒光

53、顯微 HBO/XBO弧光燈弧光燈 CCD相機(jī)相機(jī) 價(jià)格便宜，靈敏度高，光譜價(jià)格便宜，靈敏度高，光譜選擇性好選擇性好熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù) 照明方法照明方法 探測器探測器 優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn) 共聚焦共聚焦 LSCNipkow激光激光激光激光/弧光燈弧光燈對比度高，成像深度深對比度高，成像深度深(150um)，分辨率更高，漂白實(shí)驗(yàn)分辨率更高，漂白實(shí)驗(yàn)PMT/APDCCD相機(jī)相機(jī)雙光子雙光子脈沖激光脈沖激光對比度高，成像深度更深對比度高，成像深度更深(500um)，分辨率更高，分辨率更高，PMT/APD5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)6868 正置顯微鏡正置顯微鏡 倒置顯微鏡倒置顯微鏡全場熒光顯微全場熒光顯

54、微: :熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)熒光顯微鏡的結(jié)構(gòu)5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)6969/primer/index.html熒光濾塊熒光濾塊filter cubes5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)7070熒光顯微：探測器熒光顯微：探測器 PMT （光電倍增管）（光電倍增管） APD（雪崩光電二極管）（雪崩光電二極管） CCD（電荷耦合器件）相機(jī)（電荷耦合器件）相機(jī) 制冷型、慢掃描制冷型、慢掃描 增強(qiáng)型增強(qiáng)型 EM增益增益沒有空間分辨率沒有空間分辨率高靈敏度高靈敏度低噪聲低噪聲5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)7171寬場熒光顯微圖像的采集寬場熒光顯微圖

55、像的采集CCD相機(jī)的參數(shù)：相機(jī)的參數(shù)：量子效率像素?cái)?shù)像素大小幀速滿井電子數(shù)讀出噪聲暗電流A/D轉(zhuǎn)換（12到16位）非均勻性圖像采集參數(shù)：圖像采集參數(shù)：時(shí)間增益ROIBinning/primer/index.html5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)7272寬場熒光顯微圖像的采集寬場熒光顯微圖像的采集軟件：軟件：數(shù)據(jù)采集（數(shù)據(jù)采集（CCD相機(jī)本身提供）相機(jī)本身提供）=原始圖像（原始圖像（e.g.TIFF文件）文件）12位位TIFF-所有信息；所有信息；8位位TIFF-如屏幕所示如屏幕所示圖像處理（圖像處理（e.g.Photoshop; NIH Image J etc）數(shù)據(jù)采集數(shù)據(jù)采集/圖像處理（圖像處理（e.g.Metamorph）優(yōu)化全場采集：優(yōu)化全場采集：顯微鏡的校準(zhǔn)（照明的均勻性；球差；光闌，偏振片）顯微鏡的校準(zhǔn)（照明的均勻性；球差；光闌，偏振片）最佳濾片組最佳濾片組合適的合適的CCD相機(jī)（在所測光譜范圍有高的相機(jī)（在所測光譜范圍有高的QE；噪聲；放大）；噪聲；放大）5.3 熒光顯微技術(shù)熒光顯微技術(shù)7373寬場熒光顯微圖像的處理寬場熒光顯微圖像的處理簡單的圖像處理包括：簡單的圖像處理包括： 減背景（暗圖像減背景（暗圖像/空視場）