細胞培養(yǎng)標準操作流程

1、Car-T細胞培養(yǎng)標準操作流程1 目的：保證Car-T細胞制備和培養(yǎng)符合要求。2 范圍：適用于符合實驗的要求患者外周血制備和培養(yǎng)3 責任人：實驗員人、臨床相關(guān)人員。4 內(nèi)容4.1耗材：50ml離心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培養(yǎng)瓶，150 cm2培養(yǎng)瓶，EP管，1.8ml凍存管4.2試劑：X-VIVO 15TM，PBS緩沖液，75%醫(yī)用酒精，人淋巴細胞分離液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。4.3環(huán)境：4.3.1外周血分離，培養(yǎng)應(yīng)在恒溫恒濕的萬級層流室內(nèi)進行，開放操作必須在百級生物安全柜內(nèi)進行。4.3.2實驗人員應(yīng)提前對凈化室和生物安全柜進行殺菌消毒，紫外

2、線照射時間不少于30min，消毒消毒后，凈化空調(diào)開啟時間不少于30min，生物安全柜運行穩(wěn)定后方可操作。4.4操作：4.4.1采集接收外周血4.4.1.1患者符合治療方案，各項檢測符合要求，采集患者外周血60-80ml。4.4.1.2接收外周血并填寫外周血采集交接記錄，核對外周血患者相關(guān)信息，及相應(yīng)檢測報告，報告由醫(yī)院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。4.4.2操作前準備4.4.2.1凈化室，生物安全柜消毒完畢后，開啟凈化空調(diào)運行30min，生物安全柜運行穩(wěn)定。4.4.2.2從試劑間冰箱中取出細胞培養(yǎng)基，恢復(fù)室溫。4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精

3、消毒，外周血袋表面酒精消毒轉(zhuǎn)入安全柜內(nèi)。4.4.3  分離單個核細胞（PBMC）：4.4.3.1使用滅菌消毒的剪刀剪斷血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋內(nèi)外周血轉(zhuǎn)入50ml離心管中。4.4.3.2用PBS緩沖液按1:1稀釋外周血，混勻。4.4.3.3將稀釋好的血樣緩慢加入室溫的15ml人淋巴細胞分離液的離心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血樣，伸至分離液液面上方0.5cm處，血樣自然滑落鋪至分離液面上，然后輕輕加入血樣，注意不要沖破液面。4.4.3.4配平離心1200g（2100r/min）離心20min，慢升慢降。4.4.3.5離心完成后，離心管出現(xiàn)明顯分層由下至上：紅細胞

4、層，粒細胞層，F(xiàn)icoll層，單個核細胞層和血漿層。吸取血漿層至距白膜層5mm左右處棄之。小心吸取紅細胞層以上的所有液體至離心管中，PBS稀釋，與細胞懸液體積比應(yīng)大于1:3，混勻。4.4.3.6離心600g（1600r/min）5min，PBS重懸細胞混勻，取少量細胞計數(shù)。4.4.3.7離心300g（1200r/min）5min，上清液送檢無菌檢測。4.4.4細胞培養(yǎng)：4.4.4.1細胞培養(yǎng)條件：恒溫37，CO2濃度 5%，相對飽和濕度95%，細胞培養(yǎng)基PH值7.2-7.4。4.4.4.2根據(jù)細胞計數(shù)調(diào)密度2x106/ml加入培養(yǎng)瓶中（T150 200x106/100ml, T75 100x1

5、06/50ml ,T25 50x106/25ml）。混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2小時。4.4.4.3取出培養(yǎng)瓶，輕搖，使沉降于底部的懸浮細胞浮起，培養(yǎng)瓶傾斜30度角，移液管吸取培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入離心管中，少些培養(yǎng)基洗培養(yǎng)瓶將懸浮細胞全部收集，混勻計數(shù)。4.4.4.4根據(jù)細胞計數(shù)調(diào)整細胞濃度1.2x106/ml接種培養(yǎng)瓶中（100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25），加CD3/CD28磁珠，按細胞與磁珠比例為1:3（加之前磁珠用培養(yǎng)基洗滌3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.5次日細胞培養(yǎng)1

6、天，調(diào)整細胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI為1-5）混勻放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。4.4.4.6細胞培養(yǎng)3天，細胞計數(shù)補加培養(yǎng)基，IL-2  100U/ml細胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.7細胞培養(yǎng)5天去磁珠，細胞混勻轉(zhuǎn)離心管中，在磁力架上去除磁珠，細胞計數(shù)補加培養(yǎng)基，IL-2  100U/ml細胞密度調(diào)整至0.6x106/ml繼續(xù)培養(yǎng)。4.4.4.8定期觀察細胞生長情況，主要觀察其形態(tài)的變化，數(shù)目及增值情況，細胞碎片及雜質(zhì)情況，每2-3天加液培養(yǎng)。4.4.4.9根據(jù)細胞狀態(tài)和臨床治療需要，培養(yǎng)9天時細胞數(shù)量達到要求，各項檢測合格。包括：無

7、菌檢測，內(nèi)毒素檢測，細胞活力，細胞表型等。4.4.5 Car-T細胞收集：4.4.5.1確認細胞各項檢測己符合要求。4.4.5.2根據(jù)治療方案（一般一個療程分多次回輸，間隔時間為1天），取出相應(yīng)細胞懸液，剩余細胞補加培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，供再次回輸。4.4.5.3細胞懸液轉(zhuǎn)入離心管中，300g離心5min。4.4.5.4除去上清培養(yǎng)液，加PBS緩沖液稀釋混勻，300g離心5min，棄上清，PBS緩沖液300g/min離心5min。4.4.5.5細胞裝袋（一般靜脈回輸，采用100ml雙閥鹽水袋），離心完成后取上清，做無菌檢測，20ml生理鹽水重懸細胞，100m細胞濾網(wǎng)過濾，取少量細胞懸液進行細胞數(shù)量，細胞活率，革蘭氏檢測，內(nèi)毒素檢測。細胞過濾完成，轉(zhuǎn)入100ml鹽水袋中，加5%注射用人血白蛋白，貼上標簽，并填寫相關(guān)記錄。4.5細胞運輸與保存：4.5.1核對細胞標簽內(nèi)容，填寫回輸發(fā)放記錄。4.5.2細胞鹽水袋放置于運