大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫后再生內(nèi)皮細(xì)胞表型改變的研究

1、大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫后再生內(nèi)皮細(xì)胞表型改變的研究摘要目的：探索大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫后，內(nèi)皮修復(fù)過程中再生內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。方法：大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫2周和6周對內(nèi)膜進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察，同時測定血管反應(yīng)性、亞硝酸鹽含量和NOS的活性。結(jié)果：剝脫2周和6周后，再生內(nèi)皮細(xì)胞不僅結(jié)構(gòu)與正常內(nèi)皮細(xì)胞不同，而且血管再生內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)減弱、NO的釋放明顯減少、血管組織iNOS和cNOS活性均比正常降低；剝脫6周后的iNOS比剝脫2周時有所增加，但cNOS則無明顯差別。結(jié)論：實驗提示在大鼠主動脈內(nèi)膜剝脫后的內(nèi)皮細(xì)胞再生增殖過程中，再生內(nèi)皮細(xì)胞功能發(fā)生了表型改變，從而不能有效地抑制平滑肌細(xì)胞的增殖

2、和遷移；提示再生內(nèi)皮細(xì)胞功能的功能不足或紊亂可能是再狹窄病變形的重要因素之一。主題詞再生；內(nèi)皮；一氧化氮；大鼠 Studyb on the changes of structure and function in regenerated endothelial cells after the denudation of endothelium in rat aortic artery OU He-Sheng, LIU Nai-Kui, TANG Chao-Shu, YAO Xing-Hai, WANG Pei-Yong, CHENG YanCardiovascular Disease Rese

3、arch Center of Beijing Medical University, Beijing (100083)Abstract AIM: To investigate the changes of structure and function in regenerated endothelial cells (REC) after the denudation of endothelium in rat aortic artery.METHODS：After the denudation of endothelium in rat artery by balloon, REC stru

4、cture was revealed by H E staining, the reactivity of endothelial dependent relaxation (EDR) in vessels, release of endothelial nitric oxide(NO) and vascular nitric oxide synthase (NOS) were investigated.RESULTS： REC structures were different from normal endothelial cell; EDR in vessels after denuda

5、tion for 2 weeks and 6weeks decreased, and release of endothelial nitric oxide(NO) decreased companied with inhibited vascular inducible nitric oxide synthase(iNOS) and constructional nitric oxide synthase(cNOS).CONCLUSION：Phenotypic shift of REC during neointima formation after endothelial removal

6、by balloon-injury, and dysfunction of REC might enhance neointimal impairment during retenosis formation after angioplasty.MeSHRegeneration; Endothelium; Nitric oxide; Rats血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷及旁/自分泌功能紊亂是血管成形術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化等病變的重要發(fā)生機制1血管內(nèi)皮剝脫后的再生修復(fù)包括結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)，直接參與并調(diào)節(jié)上述病變的發(fā)生發(fā)展過程。一般認(rèn)為再生內(nèi)皮能有效地抑制內(nèi)膜下平滑肌細(xì)胞的增殖而有利于防止再狹窄的發(fā)展。然而

7、有資料表明，大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫后內(nèi)皮細(xì)胞再生的高峰期(2周)，平滑肌細(xì)胞的增殖并未受抑制，而且增殖迅速，即使在內(nèi)皮再生停止并完全覆蓋傷口的情況下，內(nèi)膜下的平滑肌細(xì)胞增殖仍處于活躍狀態(tài)2，因此有理由推測再生內(nèi)皮細(xì)胞存在功能不足或紊亂從而不能有效地抑制平滑肌細(xì)胞增殖。為驗證這一假說，本實驗驗用大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫的模型，觀察再生內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)和功能的改變，以探討再生的內(nèi)皮細(xì)胞表型改變在再狹窄和動脈粥樣硬化等病理發(fā)生發(fā)展中的意義，為這些病變的臨床防治提供理論依據(jù)。材料與方法1.材料：大鼠由本校實驗動物中心提供：3H-L-Arginie系英國Amersha International Pic.產(chǎn)

8、品；去甲腎上腺素(NE)、乙酰膽堿(Ach)、Dowex AG-50等購自Sigma公司。液閃儀為FJ-2107型。2.大鼠主動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)3：選280350 g雄性Wistar大鼠隨機分為3組，即剝脫2周組、剝脫6周組和假手術(shù)組。剝脫組動物用0.6%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉后，暴露分離左頸總動脈，并插入自制2F球囊導(dǎo)管至腹主動脈，注入0.1 mL生理鹽水?dāng)U張球囊后緩慢外拉以剝脫內(nèi)膜，反復(fù)牽拉3次?？p合傷口后置于靜室飼養(yǎng)。3.主動脈組織學(xué)觀察：取大鼠主動脈中段(經(jīng)橫隔處)約3 mm長，置于10%中性甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色后，在顯微鏡下觀察血管內(nèi)膜、中膜及細(xì)胞形態(tài)

9、。4.主動脈血管反應(yīng)性測定4：取大鼠主動脈中段，去除周圍脂肪組織后剪成3 mm長的血管環(huán)，置于盛有Krebs-Henseleit(K-H)液、37、95% O2和5% CO2平衡的浴槽中，通過張力傳感器連接記錄儀以記錄張力變化。平衡60 min，每20 min換液一次。用10-6mol/L的NE預(yù)激2次，直到引起等張收縮，重調(diào)靜息張力為2.0 g，依次做(1)NE10-910-5mol/L累積濃度收縮曲線，以產(chǎn)生最大的張力Tmax和ED50表示血管收縮性；(2)用硝普鈉(SNP)10-910-5mol/L記錄血管舒張反應(yīng)性；(3)10-710-55的方法稍有改良測定血管孵育液中NO2-含量，以

10、反映血管釋放NO的量。血管組織NOS活性的測定按Scott等6的方法有所改良，根據(jù)1 mol精氨酸在NOS作用下生成NO的同時產(chǎn)生1 mol瓜氨酸，應(yīng)用液體閃爍儀測定3H標(biāo)記的精氨酸生成3t檢驗。結(jié)果1.組織學(xué)觀察：正常血管橫切面可見內(nèi)膜、中層和外膜，其中內(nèi)膜由一層內(nèi)皮細(xì)胞所組成。剝脫后2周可見內(nèi)膜層明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞有多層，排列不整，細(xì)胞呈較細(xì)長的梭形或菱形；內(nèi)膜下的基層破壞，中層平滑肌明顯增厚，并有平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜下遷移形成新內(nèi)膜(neointima)，剝脫6周后的病變與剝脫2周組相類似。2.血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)變化：與正常血管相比較，剝脫組的血管舒張反應(yīng)性明顯減弱。剝脫2周組血管內(nèi)皮依

11、賴性舒張反應(yīng)降低了78.9%(18.0%4.4% vs 85.5%6.5%，P0.01)，剝脫6周組血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)降低了71.6%(24.3%6.8% vs 85.5%6.5%，Pvs2.2320.481 mool/L，P0.01)；剝脫6周組比剝脫2周組有所增加(1.5020.286 vs 0.8170.139 mol/L，P0.05)，但仍明顯低于正常(1.5020.286 vs 2.2320.481 mol/L，P0.01)，如表1所示。剝脫2周組血管組織iNOS和cNOS活性均明顯低于正常；剝脫6周組的iNOS和cNOS活性也明顯低于正常；但剝脫2周組和剝脫6周組之間比較，2周

12、組的iNOS活性低于6周組，但cNOS活性無明顯差別，結(jié)果見表2所示。表1大鼠主動脈內(nèi)膜剝脫后血管孵育液中亞硝酸鹽含量的變化Tab 1NO?2 in media of rat aortic artery cultures after balloon-injury(1 (164 bytes) Groupn(mol/L)2weeks60.8170.139*6weeks61.5020.286*Control62.2320.481 *P0.01，vs control表2大鼠主動脈內(nèi)膜剝脫后血管組織氧化氮合酶活性的變化.min-1/mg pro)GroupniNOScNOS2weeks61.0160.2

13、32*3.5600.692*6weeks62.6180.493*5.2281.023Control66.5250.5849.3611.316 *P0.05，vs control討論正常血管內(nèi)膜是維持血管壁正常結(jié)構(gòu)與功能的必要條件，血管內(nèi)膜損傷及其以后發(fā)生的內(nèi)皮細(xì)胞再生、血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移是血管成形術(shù)后再狹窄、動脈粥樣硬化等病變特征。在大鼠主動脈內(nèi)膜剝脫的模型上對內(nèi)皮細(xì)胞再生的研究表明，內(nèi)皮剝脫24 h后開始出現(xiàn)增殖，2周左右增殖速度達(dá)到最大，6周后再生停止；內(nèi)皮細(xì)胞再生覆蓋面積與剝脫程度有關(guān)，輕度剝脫時可完全覆蓋創(chuàng)傷面7，而較大面積的剝脫時即使在半年以后也不能完全覆蓋創(chuàng)傷面8；而同時對平

14、滑肌細(xì)胞增殖的觀察研究顯示，在內(nèi)皮再生速度高峰期平滑肌細(xì)胞的增殖速度亦很快，即使在內(nèi)皮再生完全覆蓋創(chuàng)傷面的情況下平滑肌細(xì)胞也呈現(xiàn)增殖活躍狀態(tài)2，因此再生內(nèi)皮細(xì)胞能否象正常內(nèi)皮細(xì)胞一樣具有抑制平滑肌細(xì)胞增殖的能力值得懷疑，換言之，新生的內(nèi)皮細(xì)胞是否存在細(xì)胞表型的改變從而表現(xiàn)出某些功能缺陷或紊亂，是十分值得探討的問題。本實驗在大鼠主動脈內(nèi)膜球囊剝脫的模型上，研究再生內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能變化。從組織切片觀察到，損傷后2周的大鼠主動脈內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮細(xì)胞層次增多，排列紊亂；細(xì)胞變得細(xì)長，可能因為相互擠壓的結(jié)果；平滑肌細(xì)胞層明顯增厚，并向內(nèi)膜下遷移形成新內(nèi)膜。剝脫6周后的主動脈內(nèi)膜及平滑肌細(xì)胞層病變與

15、剝脫2周時基本相似。為了觀察新生內(nèi)皮的功能狀況，本實驗檢測血管內(nèi)皮依賴性舒張反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)剝脫2周和6周時均比正常血管明顯降低，而剝脫2和6周組之間無明顯差別，說明剝脫后再生內(nèi)皮細(xì)胞依賴性舒張反應(yīng)比正常內(nèi)皮減弱，即使在剝脫6周后亦無明顯改善。本實驗的結(jié)果與De Meyer等910的體外細(xì)胞培養(yǎng)實驗的報道結(jié)果不一致；剝脫6周后的iNOS活性比2周時有所增加，可能與平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)，而兩組的cNOS活性并無明顯區(qū)別，提示剝脫2周后內(nèi)皮細(xì)胞的再生修復(fù)并不伴隨細(xì)胞cNOS活性的增加。本實驗NOS活性的降低可能是再生內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的表現(xiàn)之一，它將導(dǎo)致再生內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生NO的能力減弱，從而導(dǎo)致血管平滑肌

16、細(xì)胞層增殖的抑制因素減弱。本實驗NOS活性降低的原因機制不明，可能與再生內(nèi)皮細(xì)胞合成內(nèi)源性NOS活性的抑制物增加、抑或細(xì)胞本身NOS的合成及活性表達(dá)減少有關(guān)，確切機理有待進(jìn)一步研究。作者單位：北京醫(yī)科大學(xué)心血管基礎(chǔ)研究所(北京100083)參考文獻(xiàn)1Clowes AW, Reidy MA, Clowes MM. Mechanisms of stenosis after arterial injury. Lab Invest, 1983,49:208.2Reidy MA. In vivo proliferation of vascular smooth muscle cells in vesse

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