免疫技術(shù)的原理與進(jìn)展

1、熒光免疫層析技術(shù)的原理與進(jìn)展介紹人：羅敏 熒光免疫層析技術(shù)的基本原理層析法(chromatography)的原理是利用混合物中各組分的物理性質(zhì)之差(如吸附力、分子形狀和大小、分子極性、分子親和力、分配系數(shù)等)而建立來(lái)的一種分離技術(shù)。層析系統(tǒng)是由固定相(stationary phase)和流動(dòng)(Mobile Phase)相組成。 固定相是固體物質(zhì)或固定于固體物質(zhì)上的成分。 流動(dòng)相是可以流動(dòng)的物質(zhì)，如水或各種溶劑。 層析過(guò)程：當(dāng)待分離混合物隨流動(dòng)相通過(guò)固定相時(shí)，由于混合物各組分的理化性質(zhì)的差異，與固定相相互作用弱的組分隨流動(dòng)相移動(dòng)時(shí)受到的阻滯作用小，向前移的速度快；與固定相相互作用強(qiáng)的組分向前移動(dòng)

2、的速度慢。從而實(shí)現(xiàn)混合物中各組分的分離。 免疫層析法 免疫層析技術(shù)是建立在層析技術(shù)和抗原一抗體特異性免疫反應(yīng)基礎(chǔ)上的一項(xiàng)新興免疫檢測(cè)技術(shù)。 免疫層析技術(shù)以固定有檢測(cè)線和控制線的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，通過(guò)毛細(xì)作用使待測(cè)物在層析條上移動(dòng)。 待測(cè)物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。 游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測(cè)物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖熒光熒光（fluorescencefluorescence） 熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍熒光物質(zhì)吸收激發(fā)光的能量后，電子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式遷到激發(fā)態(tài)，當(dāng)其回復(fù)至基態(tài)時(shí)，以發(fā)射光形式釋

3、放出能量，稱為熒光。釋放出能量，稱為熒光。 發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜和激發(fā)光譜發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下發(fā)射光譜是指固定激發(fā)波長(zhǎng)，在不同波長(zhǎng)下記錄的樣品發(fā)射熒光的強(qiáng)度。記錄的樣品發(fā)射熒光的強(qiáng)度。激發(fā)光譜是指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不同波激發(fā)光譜是指固定檢測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)，用不同波長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射長(zhǎng)的激發(fā)光激發(fā)樣品記錄的相應(yīng)的熒光發(fā)射強(qiáng)度。強(qiáng)度。熒光效率熒光效率定義定義: :熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率熒光物質(zhì)分子將光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率計(jì)算公式計(jì)算公式: : 熒光效率熒光效率= = 發(fā)光強(qiáng)度）吸收光的光量子數(shù)（激熒光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)（熒光壽命熒光壽命定

4、義定義: :熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程熒光物質(zhì)被激發(fā)后所產(chǎn)生的熒光衰減到一定程度時(shí)所用的時(shí)間。度時(shí)所用的時(shí)間。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。各種熒光物質(zhì)的熒光壽命不同。 熒光淬滅熒光淬滅 定義定義: :熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)熒光物質(zhì)在某些理化因素作用下，發(fā)射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。射熒光減弱甚至消退稱為熒光淬滅。 引起熒光淬滅的因素：有如紫外線照射、引起熒光淬滅的因素：有如紫外線照射、高溫高溫、某些硝基化合物、重氮化合物等。某些硝基化合物、重氮化合物等。 免疫層析技術(shù)以固定有檢測(cè)線和控制線的條狀纖維層析材料為固定相，測(cè)試液為流動(dòng)相，通過(guò)毛細(xì)作用使待測(cè)物在層析條上移動(dòng)

5、。 待測(cè)物在T線處發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。 游離物在C線處發(fā)生免疫反應(yīng)。待測(cè)物層析方向免疫反應(yīng)TC免疫層析技術(shù)基本原理示意圖常用熒光免疫層析法夾心法競(jìng)爭(zhēng)法雙抗原夾心法雙抗體夾心法競(jìng)爭(zhēng)法 待測(cè)物中的某種抗原與T（檢測(cè)線）線處同種抗原競(jìng)爭(zhēng)性地與標(biāo)記抗體相結(jié)合的過(guò)程。 競(jìng)爭(zhēng)法含抗原AY1:A的單抗與標(biāo)記物的偶聯(lián)體Y2：抗原AY3:羊抗鼠二抗結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)的實(shí)物圖夾心法 待測(cè)物中某種抗體（抗原）與T線處抗原A（抗原A）以及熒光標(biāo)記的抗原（抗體）特異性相結(jié)合的過(guò)程，在T線處形成抗體A+抗原+抗體B形式的夾心結(jié)構(gòu)。結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)的實(shí)物圖雙抗體夾心法(k)Ab1-Ag-Ab2(k)Ab1(k)Ab1

6、-AgAb2Ab3-(k)Ab1TC陽(yáng)性結(jié)果T,C均有顏色待測(cè)液含抗原Ag待測(cè)液，不含抗原Ag(k)Ab1(k)Ab1(k)Ab1Ab2TCAb3-(k)Ab1陰性結(jié)果T無(wú)顏色，C有顏色雙抗體加心法檢測(cè)原理圖 K代表某一標(biāo)記物結(jié)合墊免疫層析法檢測(cè)的實(shí)物圖雙抗原夾心法雙抗原夾心反應(yīng)模式陽(yáng)性檢測(cè)（左）與陰性檢測(cè)（右） 利用熒光免疫層析試紙條可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)物的定性或者定量檢測(cè).其他碳納米管納米磁性材料有機(jī)納米粒子鑭系元素量子點(diǎn)膠體金標(biāo)記物 金顆粒之間存在的靜電斥力使其在水中保持相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，形成穩(wěn)定的水溶性膠體，即稱為膠體金膠體金 膠體金既有明亮的色彩，又有高電子密度，可以吸附生物大分子，且不影響

7、生物分子的活性，故可作為生物分子的標(biāo)志物，用于免疫反應(yīng)中抗原或抗體的標(biāo)記定位，定性甚至定量研究。層析試紙標(biāo)記用金顆粒的直徑大多在 20 40 nm，呈深紅色。 膠體金標(biāo)記蛋白質(zhì)的過(guò)程是蛋白被動(dòng)吸附到金顆粒表面的過(guò)程。 由于蛋白分子牢固地結(jié)合在金顆粒表面，形成一個(gè)蛋白層，阻止了膠體金顆粒的相互接觸，而使膠體金處于穩(wěn)定狀態(tài)。 膠體金作為標(biāo)志物有以下優(yōu)勢(shì): 幾乎可標(biāo)記所有的蛋白分子，過(guò)程簡(jiǎn)單，效率高，用量少，便宜，基本不改變被標(biāo)記蛋白的活性。且穩(wěn)定，無(wú)毒，使用方便，保質(zhì)期長(zhǎng)。 不同直徑的納米金可以用于多重標(biāo)記。 結(jié)果判斷只需普通光學(xué)儀器或直接肉眼觀察。膠體金作為標(biāo)記物的應(yīng)用試孕紙 應(yīng)用（定量） 08

8、天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院與天津市進(jìn)出口檢驗(yàn)檢疫局合作開發(fā)研發(fā)一種便攜式儀器。 競(jìng)爭(zhēng)法原理 用于農(nóng)藥殘留定量檢測(cè)2 鑭系元素 鑭系元素又稱為稀土金屬元素，指元素周期表中原子序數(shù) 5771 的所有元素。 兩種不同鑭系元素離子( 分別作為光吸收子和發(fā)射子) 摻雜入亞微米尺寸的陶瓷顆粒( 作為主基質(zhì)) 中，會(huì)構(gòu)成一類能上轉(zhuǎn)發(fā)光產(chǎn)生熒光的特殊材料。 UCP( up-converting phosphor，UCP) 顆粒。 UCP 顆粒主要含有如下三種成分: 主基質(zhì)：氧硫化物（Y2O2S,GdO2S）、氟化物(YF3,GdF3）、硅酸鹽(YSi2O5,YSi3O7）. 吸收子Yb3+ Er3+ S

9、m3+ 發(fā)射子Er3+ Ho3+ Tm3+ A2S1S2A1A3UCP獨(dú)特的優(yōu)勢(shì) 高敏感性，有報(bào)道 UCP 的靈敏度可達(dá)膠體金的 100 倍。 高穩(wěn)定性，UCP 的發(fā)光信號(hào)不受檢測(cè)環(huán)境或樣品腐蝕或標(biāo)志物自身衰變等的影響，可長(zhǎng)期存放和可重復(fù)。 使用簡(jiǎn)便，安全無(wú)毒，可適用于定量分析與多重分析，在一般的實(shí)驗(yàn)室或野外現(xiàn)場(chǎng)都可輕松應(yīng)用. 中科院報(bào)道了一種用于免疫活性檢測(cè)的UCP試紙條讀數(shù)計(jì)，采用半導(dǎo)體激光器作為光源，CCD作為光電接收器，步進(jìn)電機(jī)帶動(dòng)控制試紙條移動(dòng)的裝置 UCP應(yīng)用舉例 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院研制出一種UPT十通道免疫層析試紙盤，同時(shí)檢測(cè)多種抗體以確證是否感染鼠疫菌 霍亂弧菌霍亂烈性腸道傳染病

10、甲胎蛋白(AFP）-肝癌的特異性指標(biāo)。3 量子點(diǎn) 量子點(diǎn)( quantum dots，QDs)，主要指主族 ( 如 CdSe) ， ( 如 InP、InAs、GaSe) ，副族化合物以及 Si 等元素組成的納米顆粒 QDs 有可精確調(diào)諧的發(fā)射波長(zhǎng)，通過(guò)調(diào)整粒子尺寸可得到不同發(fā)射光譜，即可使用大小不同的同種 QDs 顆粒實(shí)現(xiàn)不同顏色標(biāo)記。 較大的Stokes 位移和狹窄對(duì)稱的熒光譜峰。 使得用同一激發(fā)光源可同時(shí)激發(fā)不同大小的量子點(diǎn)，產(chǎn)生不同發(fā)射光譜，使同步檢測(cè)多樣本成為可能。 QDs 熒光性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存，經(jīng)受反復(fù)多次激發(fā)。生物相容性好 物理結(jié)合 化學(xué)偶聯(lián) 量子點(diǎn)是一種新的熒光標(biāo)記物，目前在

11、免疫層析中得應(yīng)用相對(duì)UCP，膠體金較少見報(bào)道。 張國(guó)華，賴衛(wèi)華等，量子點(diǎn)標(biāo)記免疫層析試紙條快速檢測(cè)萊克多巴胺的研究J，2009，以CdSe為標(biāo)記物，對(duì)萊克多巴胺(一種苯酚胺類-腎上腺素激動(dòng)劑)快速定量檢測(cè)。 胡華軍，付 濤等，CdTe / ZnSe 核殼量子點(diǎn)免疫層析試紙條檢測(cè)克倫特羅的研究，2010,檢測(cè)克倫特羅( Clenbuterol，CLE) 屬于 -興奮劑類藥物,又稱“瘦肉精”量子點(diǎn)在免疫層析中的應(yīng)用4有機(jī)納米粒子 熒光素衍生物等熒光染料類有機(jī)納米粒子是早期常用于免疫層析技術(shù)中的一大類標(biāo)志物，如異硫 氰酸酯熒光素，標(biāo)記原理基本都是利用熒光分子中的異硫氰酸根為反應(yīng)基團(tuán)，與蛋白分子中的氨

12、基結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)蛋白的標(biāo)記，同時(shí)以分子中的熒光素為檢測(cè)信號(hào)，早期應(yīng)用研究較多。有機(jī)納米粒子的熒光發(fā)射依賴于粒子本身的化學(xué)發(fā)光集團(tuán)不具有無(wú)機(jī)納米粒子的波長(zhǎng)可調(diào)控的尺寸效應(yīng)。5納米磁性顆粒 納米磁性顆粒( magnetic nanoparticle，MNs) 也被稱為超順磁顆粒，它結(jié)合了磁性粒子和納米材料的優(yōu)點(diǎn)，具有粒徑小、超順磁性和比表面積大等特性。 典型的是以磁性材料四氧化三鐵. 表面引入活性基團(tuán)，通過(guò)耦聯(lián)反應(yīng)與酶、抗體等生物分子結(jié)合形成生物標(biāo)志物. 超順磁性. 6碳納米管 碳納米管( carbon nanotubes，CNTs) 的結(jié)構(gòu)可看成是石墨的六角形網(wǎng)格結(jié)構(gòu)發(fā)生一定彎曲而形成的空間拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。