發(fā)第五章發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控2課件

1、第五章第五章 發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控第一節(jié)第一節(jié) 厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控第二節(jié)第二節(jié) 好氧發(fā)酵與代謝調(diào)控好氧發(fā)酵與代謝調(diào)控.發(fā)酵機(jī)制發(fā)酵機(jī)制l發(fā)酵機(jī)制：發(fā)酵機(jī)制： 微生物通過(guò)其代謝活動(dòng)，利用基質(zhì)（底物）合微生物通過(guò)其代謝活動(dòng)，利用基質(zhì)（底物）合成人們所需要的代謝產(chǎn)物的成人們所需要的代謝產(chǎn)物的內(nèi)在規(guī)律內(nèi)在規(guī)律l代謝控制發(fā)酵：代謝控制發(fā)酵： 人為的改變?nèi)藶榈母淖兾⑸锏拇x調(diào)控機(jī)制，使有用微生物的代謝調(diào)控機(jī)制，使有用的代謝產(chǎn)物過(guò)量的積累。的代謝產(chǎn)物過(guò)量的積累。.發(fā)酵方式發(fā)酵方式l對(duì)氧需要或不需要對(duì)氧需要或不需要 好氧好氧 厭氧厭氧l培養(yǎng)基液態(tài)或固態(tài)培養(yǎng)基液態(tài)或固

2、態(tài) 液態(tài)發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵 固態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵l發(fā)酵是在培養(yǎng)基表面還是在深層進(jìn)行發(fā)酵是在培養(yǎng)基表面還是在深層進(jìn)行 表面發(fā)酵表面發(fā)酵 深層發(fā)酵深層發(fā)酵l發(fā)酵是間歇還是連續(xù)發(fā)酵是間歇還是連續(xù) 分批發(fā)酵分批發(fā)酵 連續(xù)發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵l菌種是否被固定在載體上菌種是否被固定在載體上 游離發(fā)酵游離發(fā)酵 固定化發(fā)酵固定化發(fā)酵l菌種是單一還是混合的菌種單一菌種是單一還是混合的菌種單一 純種發(fā)酵純種發(fā)酵 混合發(fā)酵混合發(fā)酵.相關(guān)的代謝途徑相關(guān)的代謝途徑lEMP途徑.糖酵解糖酵解(glycolysis)lEMP途徑l葡萄糖葡萄糖 1, 6- 1, 6-二磷酸果糖二磷酸果糖l 1, 6-1, 6-二磷酸果糖二磷酸果糖 3-3-磷

3、酸甘油醛磷酸甘油醛l 3-3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛 2- 2-磷酸甘油酸磷酸甘油酸l 2-2-二磷酸甘油二磷酸甘油酸酸 丙酮酸丙酮酸.第一節(jié)第一節(jié) 厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控l在無(wú)氧條件下，丙酮酸去向在無(wú)氧條件下，丙酮酸去向（1）在酵母中，產(chǎn)生乙醇）在酵母中，產(chǎn)生乙醇 ；酒精發(fā)酵；酒精發(fā)酵（2）在乳酸菌中，產(chǎn)生乳酸；同型乳酸發(fā)酵）在乳酸菌中，產(chǎn)生乳酸；同型乳酸發(fā)酵（3）在梭狀芽孢桿菌中，產(chǎn)生乙酰）在梭狀芽孢桿菌中，產(chǎn)生乙酰CoA、丁醛、丁醇、丙、丁醛、丁醇、丙酮、乙醇；丙酮丁醇發(fā)酵。酮、乙醇；丙酮丁醇發(fā)酵。.第一節(jié)第一節(jié) 厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控l一、酵母

4、菌的酒精發(fā)酵一、酵母菌的酒精發(fā)酵l二、細(xì)菌的酒精發(fā)酵二、細(xì)菌的酒精發(fā)酵l三、乳酸發(fā)酵（同型、異型）三、乳酸發(fā)酵（同型、異型）l四、甘油發(fā)酵（亞硫酸鹽法、堿法）四、甘油發(fā)酵（亞硫酸鹽法、堿法）.第一節(jié)第一節(jié) 厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控厭氧發(fā)酵機(jī)制與代謝調(diào)控一、酵母菌的酒精發(fā)酵一、酵母菌的酒精發(fā)酵l1.乙醇生成機(jī)制乙醇生成機(jī)制以丙酮酸脫羧產(chǎn)生的乙醛作為以丙酮酸脫羧產(chǎn)生的乙醛作為H受體產(chǎn)生乙醇。受體產(chǎn)生乙醇。丙酮酸丙酮酸丙酮酸脫羧酶丙酮酸脫羧酶COCO2 2 + +乙醛乙醛（酵母菌酒精發(fā)酵（酵母菌酒精發(fā)酵型）型）NADH +H NADH+乙醇乙醇+焦磷酸硫胺素、焦磷酸硫胺素、MgMg2 2乙醇脫氫酶乙醇

5、脫氫酶.葡萄糖生成乙醇葡萄糖生成乙醇l總反應(yīng)式：總反應(yīng)式：lC6H12O6 +2ADP+2H3PO42CH3CH2OH+2CO2+2ATP 2CH3COCOOH 丙酮酸脫羧酶丙酮酸脫羧酶 4ATP CO2 2CH3CHO NADH+H+ 2ADP 乙醇脫氫酶乙醇脫氫酶 NAD+ C6H12 O6 2C2H5OH.巴斯德效應(yīng)巴斯德效應(yīng)l葡萄糖分解為乙醇的過(guò)程中，并無(wú)氧氣參與，是葡萄糖分解為乙醇的過(guò)程中，并無(wú)氧氣參與，是一個(gè)無(wú)氧呼吸過(guò)程。一個(gè)無(wú)氧呼吸過(guò)程。l但在好氧條件下，但在好氧條件下，酵母酵母發(fā)酵能力降低，乙醇的積發(fā)酵能力降低，乙醇的積累減少，實(shí)質(zhì)是糖代謝降低累減少，實(shí)質(zhì)是糖代謝降低巴斯德效應(yīng)

6、巴斯德效應(yīng)。.巴斯德效應(yīng)巴斯德效應(yīng)l機(jī)制：機(jī)制：磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶是第是第一個(gè)限速酶，它是一種變一個(gè)限速酶，它是一種變構(gòu)酶，受構(gòu)酶，受ATP、檸檬酸檸檬酸及其及其他一些高能化合物的抑制，他一些高能化合物的抑制，受受AMP、ADP的激活。的激活。l在在好氧條件好氧條件下，糖代謝進(jìn)下，糖代謝進(jìn)入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生檸檬入三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生檸檬酸等，并通過(guò)氧化磷酸化酸等，并通過(guò)氧化磷酸化生成大量的生成大量的ATP。 ATP反反饋抑制饋抑制此酶的活性。此酶的活性。l細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞內(nèi)檸檬酸檸檬酸生成量的增生成量的增加，反饋?zhàn)瓒艏?，反饋?zhàn)瓒袅姿峁羌ち姿峁羌っ该傅暮铣?，這種阻遏作用的合成，這種阻遏作用由于由

7、于ATP存在而加強(qiáng)。存在而加強(qiáng)。OCH2OHOHOHOHOHHHHHMgOCH2OPO3H2OHOHOHOHHHHH己糖磷酸激酶葡萄糖6磷酸葡萄糖HOH磷酸己糖異構(gòu)酶6-磷酸果糖H2O3POHOHOHCH2OHCH2OH2O3POHOHOHCH2OPO3H2CH2OOHHHOHOHCH2OHCH2OHOOHH磷酸果糖激酶己糖激酶ATPADPMgATPADPATPADPMg果糖1,6-二磷酸果糖由于磷酸果糖激酶受抑制，導(dǎo)致由于磷酸果糖激酶受抑制，導(dǎo)致6-磷酸果糖積累，磷酸果糖積累，反應(yīng)平衡時(shí)，醛糖：酮糖為反應(yīng)平衡時(shí)，醛糖：酮糖為7:3，導(dǎo)致，導(dǎo)致6-磷酸葡萄磷酸葡萄糖積累，糖積累， 6-磷酸葡萄

8、糖抑制磷酸葡萄糖抑制己糖激酶己糖激酶，從而抑制，從而抑制葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞。葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞。.二、細(xì)菌的酒精發(fā)酵二、細(xì)菌的酒精發(fā)酵lED途徑：途徑：又稱(chēng)又稱(chēng)2-酮酮-3-脫氧脫氧-6-磷酸葡糖酸（磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途徑）裂解途徑lED途徑總反應(yīng)式：途徑總反應(yīng)式：C6H12O6+ADP+H3PO42C2H5OH+2CO2+ATP.ED途徑中的關(guān)鍵反應(yīng)途徑中的關(guān)鍵反應(yīng)lKDPG 2-酮酮-3-脫氧脫氧-6-磷酸葡糖酸磷酸葡糖酸.ED途徑途徑l1952年在年在Pseudomonas saccharophila（嗜糖假（嗜糖假單胞菌）中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)證明存在于多種細(xì)菌中（革單胞菌）中發(fā)現(xiàn)，后來(lái)證明存在

9、于多種細(xì)菌中（革蘭氏陰性菌中分布較廣）。蘭氏陰性菌中分布較廣）。l ED途徑可不依賴(lài)于途徑可不依賴(lài)于EMP和和HMP途徑而途徑而單獨(dú)存在單獨(dú)存在，是少數(shù)是少數(shù)缺乏缺乏完整完整EMP途徑的微生物的一種途徑的微生物的一種替代替代途徑，途徑，未發(fā)現(xiàn)存在于其它生物中。未發(fā)現(xiàn)存在于其它生物中。l少數(shù)假單胞桿菌（少數(shù)假單胞桿菌（Pscudomonas),如林氏假單胞菌如林氏假單胞菌（Ps.lindneri)能利用葡萄糖經(jīng)能利用葡萄糖經(jīng)ED途徑進(jìn)行酒精發(fā)途徑進(jìn)行酒精發(fā)酵。酵。.細(xì)菌酒精發(fā)酵細(xì)菌酒精發(fā)酵l在末端假單胞菌中能使在末端假單胞菌中能使2分子丙酮酸脫羧，然后還原乙醛生成分子丙酮酸脫羧，然后還原乙醛生成

10、2分子乙醇和分子乙醇和2分子分子CO2。l而在其他假單胞菌中氫載體氧化后，生成而在其他假單胞菌中氫載體氧化后，生成1分子乙醇、分子乙醇、1分子乳分子乳酸酸和和1分子分子CO2。lED途徑總反應(yīng)式：途徑總反應(yīng)式：C6H12O6+ADP+H3PO42C2H5OH+2CO2+ATP.細(xì)菌的酒精發(fā)酵特點(diǎn)細(xì)菌的酒精發(fā)酵特點(diǎn)l20世紀(jì)世紀(jì)70年代出現(xiàn)年代出現(xiàn)l代謝速度快代謝速度快l發(fā)酵周期短發(fā)酵周期短l酒精產(chǎn)率高（比酵母菌）酒精產(chǎn)率高（比酵母菌）l厭氧和耐高溫厭氧和耐高溫l代謝副產(chǎn)物少代謝副產(chǎn)物少l能利用各種糖類(lèi)能利用各種糖類(lèi)l但耐酒精度比酵母菌低但耐酒精度比酵母菌低lpH5 （酵母菌（酵母菌pH3 ）

11、，較易染菌，較易染菌.三、乳酸發(fā)酵三、乳酸發(fā)酵l1.同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵 通過(guò)通過(guò)EMP途徑，由途徑，由丙酮酸丙酮酸還原生成還原生成乳酸乳酸。發(fā)酵產(chǎn)物中只有。發(fā)酵產(chǎn)物中只有乳酸。乳酸。 進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的細(xì)菌主要有進(jìn)行同型乳酸發(fā)酵的細(xì)菌主要有乳鏈球菌、乳酪桿菌、保乳鏈球菌、乳酪桿菌、保加利亞桿菌、德氏乳桿菌。加利亞桿菌、德氏乳桿菌。l2.異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵 通過(guò)通過(guò)HMP(PK)途徑，產(chǎn)物中除乳酸外，還有乙醇、乙酸等途徑，產(chǎn)物中除乳酸外，還有乙醇、乙酸等有機(jī)化合物的發(fā)酵。有機(jī)化合物的發(fā)酵。 進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵的有進(jìn)行異型乳酸發(fā)酵的有腸膜明串珠菌、葡聚糖明串珠菌。腸膜明串珠菌、葡聚糖明串

12、珠菌。.1.同型乳酸發(fā)酵同型乳酸發(fā)酵l無(wú)氧條件下，葡萄糖先經(jīng)無(wú)氧條件下，葡萄糖先經(jīng)經(jīng)經(jīng)EMP途徑得到丙酮酸途徑得到丙酮酸.2.異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵HMP途徑途徑戊糖磷酸途徑戊糖磷酸途徑.異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵HMP途徑途徑.l在微生物分類(lèi)研究中，通常把發(fā)酵在微生物分類(lèi)研究中，通常把發(fā)酵1mol葡萄糖產(chǎn)生的乳葡萄糖產(chǎn)生的乳酸少于酸少于1.8mol，同時(shí)還產(chǎn)生較多乙醇、，同時(shí)還產(chǎn)生較多乙醇、CO2或乙酸、甘油、或乙酸、甘油、甘露醇等產(chǎn)品的乳酸菌稱(chēng)為異型乳酸菌。甘露醇等產(chǎn)品的乳酸菌稱(chēng)為異型乳酸菌。l同型乳酸菌同型乳酸菌的微生物已經(jīng)用來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。的微生物已經(jīng)用來(lái)發(fā)酵產(chǎn)生乳酸。l異型乳酸異型乳

13、酸發(fā)酵的微生物，例如發(fā)酵的微生物，例如雙歧桿菌雙歧桿菌，已經(jīng)用于發(fā)酵生，已經(jīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)活菌飲料，并越來(lái)越受重視。產(chǎn)活菌飲料，并越來(lái)越受重視。異型乳酸發(fā)酵異型乳酸發(fā)酵.四、甘油發(fā)酵四、甘油發(fā)酵1.亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵l正常情況正常情況酵母酵母菌在無(wú)氧條件下：菌在無(wú)氧條件下： 丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛乙醇乙醇l當(dāng)加入當(dāng)加入NaHSO3, 乙醛乙醛+ NaHSO3, CH3CHOSO2Na(難溶結(jié)晶狀加成物）難溶結(jié)晶狀加成物） OHl乙醛不能作為受氫體，而迫使乙醛不能作為受氫體，而迫使磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮作為受氫體，作為受氫體，生成生成-磷酸甘油，磷酸甘油， -磷酸甘油磷酸甘油經(jīng)脫

14、磷酸而有經(jīng)脫磷酸而有甘油甘油累積。累積。1,6-二磷酸果糖HOHH2O3POHOHOHCH2OPO3H2CH2OCH2OPO3H2CCH2OHOCH2OPO3H2CHOHCHO磷酸二羥丙酮3磷酸甘油醛磷酸丙糖異構(gòu)酶964醛縮酶.亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵CH2OP CH2OP CH2OHC=O + NADH + H+ CHOH CHOHCH2OH CH2OH CH2OH CH2OH OHC6H12O6 + NaHSO3 CHOH + C3CHOSO2Na +CO2 CH2OH-磷酸甘油磷酸二羥丙酮.亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵亞硫酸鹽法甘油發(fā)酵l1mol葡萄糖只產(chǎn)生葡萄糖只產(chǎn)生1mol甘油，不

15、產(chǎn)生甘油，不產(chǎn)生ATP，整個(gè)過(guò)程無(wú)，整個(gè)過(guò)程無(wú)ATP結(jié)余，結(jié)余，可見(jiàn)在甘油發(fā)酵過(guò)程中亞硫酸氫鈉不能加太多可見(jiàn)在甘油發(fā)酵過(guò)程中亞硫酸氫鈉不能加太多，否則會(huì)使酵母菌因得不到能量而終止發(fā)酵，必須留一部分否則會(huì)使酵母菌因得不到能量而終止發(fā)酵，必須留一部分酒精發(fā)酵，以便獲得一些能量，供生命活動(dòng)所需。酒精發(fā)酵，以便獲得一些能量，供生命活動(dòng)所需。l在果酒發(fā)酵中，由于利用亞硫酸作為殺菌劑，故副產(chǎn)物甘在果酒發(fā)酵中，由于利用亞硫酸作為殺菌劑，故副產(chǎn)物甘油量較大，甘油具有調(diào)味功能，使酒口感圓潤(rùn)。油量較大，甘油具有調(diào)味功能，使酒口感圓潤(rùn)。.2.堿法甘油發(fā)酵堿法甘油發(fā)酵l正常情況正常情況酵母菌酵母菌在無(wú)氧條件下：在無(wú)氧

16、條件下： 丙酮酸丙酮酸乙醛乙醛乙醇乙醇l酒精酵母，酒精酵母，發(fā)酵液保持堿性發(fā)酵液保持堿性，pH7.6以上，發(fā)酵產(chǎn)生的以上，發(fā)酵產(chǎn)生的乙醛乙醛不能作為不能作為受氫體，而是受氫體，而是2分子分子乙醛乙醛之間發(fā)生之間發(fā)生歧化反應(yīng)歧化反應(yīng)，相互氧化還原，生成等，相互氧化還原，生成等量的乙醇和乙酸。此時(shí)，由量的乙醇和乙酸。此時(shí)，由3-磷酸甘油醛磷酸甘油醛脫氫生成的脫氫生成的NADH2用來(lái)還原用來(lái)還原磷酸二羥丙酮磷酸二羥丙酮，并進(jìn)而生成甘油。不產(chǎn)生，并進(jìn)而生成甘油。不產(chǎn)生ATP。 CH2OH 3C6H12O6 + H2O 2CHOH + C2H5OH + CH3COOH + CO2 CH2OH.五、丙酸和

17、丁酸發(fā)酵五、丙酸和丁酸發(fā)酵 葡萄糖葡萄糖（EMP途徑）乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸草酰乙酸草酰乙酸蘋(píng)果酸蘋(píng)果酸富馬酸富馬酸琥珀酸琥珀酸丙酸丙酸+CO2 乙酸乙酸+CO2丙酸丙酸發(fā)酵：先經(jīng)過(guò)發(fā)酵：先經(jīng)過(guò)EMP途徑，再經(jīng)途徑，再經(jīng)Wood-Werk-man途徑途徑.第二節(jié)第二節(jié) 好氧發(fā)酵與代謝調(diào)控好氧發(fā)酵與代謝調(diào)控l一、檸檬酸發(fā)酵一、檸檬酸發(fā)酵l二、醋酸發(fā)酵二、醋酸發(fā)酵l三、氨基酸發(fā)酵三、氨基酸發(fā)酵l四、核苷酸發(fā)酵四、核苷酸發(fā)酵l五、抗生素發(fā)酵五、抗生素發(fā)酵.1.代謝途徑代謝途徑TCA循環(huán)循環(huán)l提供微生物生命活動(dòng)的提供微生物生命活動(dòng)的大量能量（大量能量（38個(gè)個(gè)ATP)。l中間代謝產(chǎn)物是一些重中間代謝產(chǎn)物

18、是一些重要的細(xì)胞物質(zhì)。如各種要的細(xì)胞物質(zhì)。如各種氨基酸、嘌呤、嘧啶和氨基酸、嘌呤、嘧啶和脂類(lèi)等生物合成前體物。脂類(lèi)等生物合成前體物。l是糖類(lèi)有氧降解的主要是糖類(lèi)有氧降解的主要途徑，也是脂肪、蛋白途徑，也是脂肪、蛋白質(zhì)降解的必經(jīng)途徑。徹質(zhì)降解的必經(jīng)途徑。徹底氧化成底氧化成CO2和和H2O。l提供各種碳架原料。提供各種碳架原料。一、檸檬酸發(fā)酵一、檸檬酸發(fā)酵p119.2.檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié) （1）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)以下酶要強(qiáng)以下酶要強(qiáng)檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶磷酸烯醇式丙酮酸磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)羧化酶羧化酶以下酶要弱以

19、下酶要弱順烏頭酸水合酶順烏頭酸水合酶草酰乙酸水解酶草酰乙酸水解酶異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸脫氫酶異檸檬酸裂解酶異檸檬酸裂解酶葡萄糖葡萄糖丙酮酸丙酮酸檸檬酸檸檬酸乙酰乙酰-CoA-CoA草酰乙酸草酰乙酸EMPEMP途徑途徑氧化脫羧氧化脫羧羧化羧化乙醛酸乙醛酸 乙酰輔酶A.2.檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié) （1）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)黑曲霉生長(zhǎng)時(shí)：黑曲霉生長(zhǎng)時(shí)：EMP與與HMP途徑為途徑為2:1檸檬酸合成時(shí)：檸檬酸合成時(shí)：EMP與與HMP途徑為途徑為4:1EMP途徑的調(diào)節(jié)對(duì)檸檬酸合成非途徑的調(diào)節(jié)對(duì)檸檬酸合成非常重要。常重要。有關(guān)酶的調(diào)節(jié)有關(guān)酶的調(diào)節(jié)a.磷酸果糖激

20、酶磷酸果糖激酶b.丙酮酸激酶丙酮酸激酶c.丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶乙醛酸乙醛酸 乙酰輔酶A葡萄糖葡萄糖磷酸烯醇磷酸烯醇式丙酮酸式丙酮酸檸檬酸檸檬酸乙酰乙酰-CoA-CoA草酰乙酸草酰乙酸EMPEMP途徑途徑氧化脫羧氧化脫羧羧化羧化丙酮酸丙酮酸cba.（1）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)葡萄糖葡萄糖磷酸烯醇磷酸烯醇式丙酮酸式丙酮酸檸檬酸檸檬酸乙酰乙酰-CoA-CoA草酰乙酸草酰乙酸EMPEMP途徑途徑氧化脫羧氧化脫羧羧化羧化丙酮酸丙酮酸cba激活劑激活劑抑制劑抑制劑a.磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶（PFK)NH4 +、AMP、 Pi檸檬酸檸檬酸 、PEP 、ATPb.丙酮酸激酶丙

21、酮酸激酶NH4 、K+（糖酵解中為第（糖酵解中為第二個(gè)調(diào)節(jié)酶，二個(gè)調(diào)節(jié)酶，在某些真菌在某些真菌得到證實(shí)，但黑曲霉未被得到證實(shí)，但黑曲霉未被證實(shí)。證實(shí)。）（變構(gòu)酶）乙酰（變構(gòu)酶）乙酰CoA、 ATP、 丙酮酸是變構(gòu)抑丙酮酸是變構(gòu)抑制劑制劑c.丙酮酸羧化酶丙酮酸羧化酶-酮戊二酸僅有微弱的抑酮戊二酸僅有微弱的抑制作用，制作用，K+，與其它真菌，與其它真菌相反，不受乙酰輔酶相反，不受乙酰輔酶A的的抑制。抑制。(組成酶）該酶的調(diào)節(jié)性組成酶）該酶的調(diào)節(jié)性很差，幾乎不受代謝產(chǎn)很差，幾乎不受代謝產(chǎn)物的調(diào)節(jié)。物的調(diào)節(jié)。.淀粉淀粉葡萄糖葡萄糖6-6-磷酸果糖磷酸果糖1 1，6-6-二磷酸果糖二磷酸果糖磷酸丙糖磷酸

22、丙糖磷酸烯醇丙酮酸磷酸烯醇丙酮酸丙酮酸丙酮酸乙酰乙酰CoACoA草酰乙酸草酰乙酸檸檬酸檸檬酸CO2CO2CO2CO2CO2CO2NH4+PiK+AMPATP.錳離子充足和缺乏下黑曲霉錳離子充足和缺乏下黑曲霉PFK活力活力lNH4+在細(xì)胞內(nèi)生理濃度水平下，在細(xì)胞內(nèi)生理濃度水平下，PFK(磷酸果糖激酶磷酸果糖激酶)酶對(duì)檸檬酶對(duì)檸檬酸不敏感。酸不敏感。l錳離子錳離子是催化核糖核酸形成聚合階段第一步反應(yīng)酶所需要是催化核糖核酸形成聚合階段第一步反應(yīng)酶所需要的，的，錳離子缺乏錳離子缺乏，核酸、蛋白質(zhì)合成受阻，而使細(xì)胞內(nèi)，核酸、蛋白質(zhì)合成受阻，而使細(xì)胞內(nèi)銨銨離子離子水平升高。水平升高。l因此，因此，嚴(yán)格限制

23、供給錳離子等金屬離子嚴(yán)格限制供給錳離子等金屬離子，降低菌體中糖代，降低菌體中糖代謝轉(zhuǎn)向合成蛋白質(zhì)、脂肪酸、核酸的能力，使細(xì)胞中形成謝轉(zhuǎn)向合成蛋白質(zhì)、脂肪酸、核酸的能力，使細(xì)胞中形成高水平的銨離子，從而解除檸檬酸和高水平的銨離子，從而解除檸檬酸和ATP對(duì)對(duì)PFK酶的反饋酶的反饋抑制，增加抑制，增加EMP代謝流量，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，代謝流量，丙酮酸和草酰乙酸水平升高，而使檸檬酸大量積累。而使檸檬酸大量積累。因子因子檸檬酸檸檬酸/(mmol/L）銨離子銨離子/(mmol/L）活力活力/u缺錳缺錳4151.1錳足錳足131.0.2.檸檬酸積累檸檬酸積累的的代謝調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)（2）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)

24、循環(huán)的調(diào)節(jié)d.檸檬酸合成酶檸檬酸合成酶(限速酶）限速酶）促進(jìn)作用促進(jìn)作用 檸檬酸合成酶對(duì)乙酰檸檬酸合成酶對(duì)乙酰CoA的親和力取決于的親和力取決于草草酰乙酸酰乙酸的濃度，在檸檬的濃度，在檸檬酸積累的情況下，草酰酸積累的情況下，草酰乙酸的濃度可提高此酶乙酸的濃度可提高此酶對(duì)乙酰對(duì)乙酰CoA的親和力。的親和力。加入草酰乙酸不經(jīng)濟(jì)。加入草酰乙酸不經(jīng)濟(jì)。而檸檬酸大量產(chǎn)酸時(shí)而檸檬酸大量產(chǎn)酸時(shí)TCA檸檬酸后續(xù)反應(yīng)基本阻斷。檸檬酸后續(xù)反應(yīng)基本阻斷。（補(bǔ)充代謝強(qiáng)的菌液）（補(bǔ)充代謝強(qiáng)的菌液）dee.2.檸檬酸積累檸檬酸積累的的代謝調(diào)節(jié)代謝調(diào)節(jié)（2）TCA循環(huán)的調(diào)循環(huán)的調(diào)節(jié)節(jié)e.順烏頭酸酶順烏頭酸酶Fe2+抑制作用

25、抑制作用 該酶需要該酶需要Fe2+ ，當(dāng)菌體，當(dāng)菌體生長(zhǎng)到足夠數(shù)量時(shí)，若生長(zhǎng)到足夠數(shù)量時(shí)，若用配位劑（如亞鐵氰化用配位劑（如亞鐵氰化鉀）除去反應(yīng)液中的鉀）除去反應(yīng)液中的Fe2+ ，則酶活被抑制，則酶活被抑制，而積累檸檬酸。而積累檸檬酸。篩選優(yōu)良生產(chǎn)菌篩選優(yōu)良生產(chǎn)菌 通過(guò)誘變或其它方法，通過(guò)誘變或其它方法，造成生產(chǎn)菌種順烏頭酸造成生產(chǎn)菌種順烏頭酸酶缺損或活力很低，可酶缺損或活力很低，可積累大量的檸檬酸。積累大量的檸檬酸。dee.2.檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)（2）TCA循環(huán)的調(diào)節(jié)循環(huán)的調(diào)節(jié) f.順烏頭酸水合酶、順烏頭酸水合酶、g.異檸檬酸脫氫酶調(diào)節(jié)異檸檬酸脫氫酶調(diào)節(jié) 檸檬酸檸檬酸順

26、烏頭酸順烏頭酸異檸檬酸異檸檬酸a-酮戊二酸酮戊二酸 有研究有研究La Nnuze 等（等（1966）當(dāng)銅離子）當(dāng)銅離子0.3mg/L、鐵離子、鐵離子2mg/L和和pH2.0情況下情況下，以上酶不出現(xiàn)活力，而發(fā)酵中檸，以上酶不出現(xiàn)活力，而發(fā)酵中檸檬酸正是在這個(gè)酸度下積累的。檬酸正是在這個(gè)酸度下積累的。 黑曲霉中有一種單純的線粒體順烏頭酸水合酶（細(xì)胞質(zhì)中黑曲霉中有一種單純的線粒體順烏頭酸水合酶（細(xì)胞質(zhì)中也有該酶）在催化時(shí)有也有該酶）在催化時(shí)有檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸檸檬酸：順烏頭酸：異檸檬酸=90=90：3 3：7 7 的平衡，這個(gè)平衡可能就是造成檸檬酸的最初積累的平衡，這個(gè)平衡可能就是造成檸檬

27、酸的最初積累而使而使pHpH值降低。值降低。 .2.檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)檸檬酸積累的代謝調(diào)節(jié)（3）氧對(duì)檸檬酸代謝的調(diào)節(jié)氧對(duì)檸檬酸代謝的調(diào)節(jié) 乙酰乙酰CoACoA和草酰乙酸縮合生成檸檬酸過(guò)程中要引進(jìn)一個(gè)氧原子，因此氧也可和草酰乙酸縮合生成檸檬酸過(guò)程中要引進(jìn)一個(gè)氧原子，因此氧也可以看作為檸檬酸合成底物。以看作為檸檬酸合成底物。 氧對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用：氧對(duì)檸檬酸發(fā)酵的作用： a.a.氧是發(fā)酵過(guò)程（氧是發(fā)酵過(guò)程（EMPEMP途徑和丙酮酸脫氫）生成的途徑和丙酮酸脫氫）生成的NADHNADH2 2重新氧化的受體。重新氧化的受體。 b.b.除標(biāo)準(zhǔn)的呼吸鏈（氧化時(shí)產(chǎn)生除標(biāo)準(zhǔn)的呼吸鏈（氧化時(shí)產(chǎn)生ATPATP反饋

28、抑制反饋抑制PFKPFK酶酶) )外，黑曲霉中有一條側(cè)外，黑曲霉中有一條側(cè)呼吸鏈，不產(chǎn)生呼吸鏈，不產(chǎn)生 ATPATP，但當(dāng)缺氧時(shí)，該呼吸鏈不可逆失活，從而導(dǎo)致檸檬，但當(dāng)缺氧時(shí)，該呼吸鏈不可逆失活，從而導(dǎo)致檸檬酸產(chǎn)酸急劇下降。酸產(chǎn)酸急劇下降。因此因此發(fā)酵中特別是產(chǎn)酸期要充足供氧，以保證更多的發(fā)酵中特別是產(chǎn)酸期要充足供氧，以保證更多的NHDHNHDH2 2通過(guò)側(cè)系呼吸鏈將通過(guò)側(cè)系呼吸鏈將H H交給交給O O2 2生成生成COCO2 2和和H H2 2O,O,使總體使總體ATPATP減少。減少。 側(cè)呼吸鏈對(duì)水楊酸酰異羥側(cè)呼吸鏈對(duì)水楊酸酰異羥肟酸（肟酸（SHAM）敏感：）敏感： 黑曲霉生長(zhǎng)期：側(cè)鏈不受黑曲霉生長(zhǎng)期：側(cè)鏈不受SHAM抑制。抑制。 產(chǎn)檸檬酸期：側(cè)鏈?zhǔn)墚a(chǎn)檸檬酸期：側(cè)鏈?zhǔn)躍HAM強(qiáng)烈抑制。強(qiáng)烈抑制。.（1）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)）糖酵解及丙酮酸代謝的調(diào)節(jié)葡萄糖葡萄糖磷酸烯醇磷酸烯醇式丙酮酸式丙酮酸檸檬酸檸檬酸乙酰乙酰-CoA-CoA草酰乙酸草酰乙酸EMPEMP途徑途徑氧化脫羧氧化脫羧