PCR引物設(shè)計(jì)原理資料

1、PCR引物設(shè)計(jì)原理資料PCR引物設(shè)計(jì)原理資料 PCRPCR反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成：反應(yīng)一般由三個(gè)步驟組成： 模板的熱變性；模板的熱變性； 引物復(fù)引物復(fù)性到單鏈模板上；性到單鏈模板上； 熱穩(wěn)定熱穩(wěn)定DNADNA聚合酶催化的延伸聚合酶催化的延伸變性變性在應(yīng)用在應(yīng)用 Taq DNA Taq DNA 聚合酶進(jìn)行聚合酶進(jìn)行 PCR PCR 時(shí)，變性溫時(shí)，變性溫度在度在94-9594-95下進(jìn)行，這也是下進(jìn)行，這也是Taq DNATaq DNA聚合酶進(jìn)聚合酶進(jìn)行行3030個(gè)或個(gè)或3030個(gè)以上個(gè)以上PCRPCR循環(huán)而活力不受到過多循環(huán)而活力不受到過多損失時(shí)能耐受的最高溫度。損失時(shí)能耐受的最高溫度。有時(shí)把變

2、性時(shí)間設(shè)計(jì)為有時(shí)把變性時(shí)間設(shè)計(jì)為 5min5min，以便大分子模，以便大分子模板板 DNA DNA 徹底變性的概率。徹底變性的概率。對于對于 GC GC 含量為含量為 55% 55% 或更低的線性或更低的線性 DNA DNA 模板，模板，推薦推薦 PCR PCR 的變性條件是的變性條件是 94-95 94-95 變性變性45s45s。 復(fù)性溫度（復(fù)性溫度（退火溫度退火溫度）至關(guān)重要）至關(guān)重要！ 退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，退火溫度太高，引物不能與模板很好地復(fù)性，擴(kuò)增效率會非常低；擴(kuò)增效率會非常低； 退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從退火溫度太低，引物將產(chǎn)生非特異性復(fù)性，從而導(dǎo)

3、致非特異性而導(dǎo)致非特異性DNADNA片段的擴(kuò)增；片段的擴(kuò)增； 退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的退火溫度，通常比理論設(shè)計(jì)的引物和模板的TmTm值低值低 3-5 3-5 下進(jìn)行。下進(jìn)行。 最好通過對復(fù)性溫度比兩條引物的最好通過對復(fù)性溫度比兩條引物的Tm Tm 值低值低 2- 2-10 10 內(nèi)進(jìn)行內(nèi)進(jìn)行PCRPCR預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對復(fù)性條件預(yù)實(shí)驗(yàn)（梯度）來對復(fù)性條件的優(yōu)化。的優(yōu)化。引物和模板引物和模板DNA 的復(fù)性的復(fù)性 對對 Taq Taq DNA DNA 聚合酶來說，最適溫度為聚合酶來說，最適溫度為72-78 72-78 ，時(shí)間約為，時(shí)間約為1min1min。引物的延伸引物的延伸與循環(huán)數(shù)

4、目與循環(huán)數(shù)目 哺乳動(dòng)物哺乳動(dòng)物 DNA DNA 為模板時(shí)，至少進(jìn)行為模板時(shí)，至少進(jìn)行2525個(gè)循環(huán)才能得個(gè)循環(huán)才能得到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為到足夠量的擴(kuò)增產(chǎn)物。一般為30-3330-33個(gè)循環(huán)。個(gè)循環(huán)。引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)（1 1）堿基組成：）堿基組成： GCGC含量應(yīng)在含量應(yīng)在40%-60%40%-60%（ 45%-55% 45%-55% ）之間，）之間，4 4中中堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多堿基在引物中分配均勻。沒有多聚嘌呤或多聚嘧啶序列，如聚嘧啶序列，如AAAAAAAAAA等，沒有二核苷酸重復(fù)等，沒有二核苷酸重復(fù)序列，如序列，如GCGCGCGCGCGC等；等；（2 2）引

5、物長度：）引物長度： 引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為引物中與模板互補(bǔ)的區(qū)應(yīng)為18-2518-25個(gè)核苷酸長個(gè)核苷酸長度，上下引物長度差別不能大于度，上下引物長度差別不能大于3bp3bp，如上游，如上游引物為引物為19bp19bp，下游引物為，下游引物為24bp24bp等。等。（3 3）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列：）重復(fù)或自身互補(bǔ)序列： 形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會阻止引物和模板之間的復(fù)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，會阻止引物和模板之間的復(fù)性。性。（4 4）上下引物的互補(bǔ)性：）上下引物的互補(bǔ)性： 一個(gè)引物的一個(gè)引物的33末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，末端序列不允許結(jié)合到另一個(gè)引物的任何位點(diǎn)上，因?yàn)橐驗(yàn)镻CRPCR中引物濃度

6、較高，會形成引物二聚體。中引物濃度較高，會形成引物二聚體。 當(dāng)一個(gè)當(dāng)一個(gè)PCRPCR有多對引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)有多對引物時(shí)，注意檢查任何一個(gè)33末端都末端都不能和不能和 其他任何引物互補(bǔ)。其他任何引物互補(bǔ)。（5 5）解鏈溫度（）解鏈溫度（Tm Tm 值）：值）： 計(jì)算出來的兩個(gè)引物的計(jì)算出來的兩個(gè)引物的 Tm Tm 值相差不能大于值相差不能大于5 5 ，擴(kuò)增產(chǎn)物的，擴(kuò)增產(chǎn)物的 Tm Tm 值與引物的值與引物的 Tm Tm 值相差不值相差不能大于能大于10 10 ；引物的；引物的 Tm Tm 值一般為值一般為50-7050-70。 這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)這些特性保證了擴(kuò)增產(chǎn)物在每一個(gè)

7、 PCR PCR 循環(huán)可循環(huán)可有效變性。有效變性。（6 6）33末端末端3 3末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。末端的性質(zhì)非常關(guān)鍵。 如果可能的話，每個(gè)引物的如果可能的話，每個(gè)引物的3 3末端堿基為末端堿基為G G或或C C；最好不要；最好不要A A，或或AAAA等多聚等多聚A A；但不推薦但不推薦3 3末端有末端有.NNNCG.NNNCG或或.NNNGC.NNNGC序列的引物，序列的引物，GCGC高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。高自由能促進(jìn)發(fā)夾及引物二聚體產(chǎn)生。 當(dāng)末端堿基為當(dāng)末端堿基為 A A 時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低；時(shí)，錯(cuò)配時(shí)引發(fā)鏈合成的效率大大降低； 當(dāng)末端堿基為當(dāng)末端堿基為T T時(shí)，

8、錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一時(shí)，錯(cuò)配情況下亦能引發(fā)鏈的合成，所以一般般 PCR PCR 反應(yīng)中，引物反應(yīng)中，引物3 3末端的堿基最好選末端的堿基最好選T T、C C、G G，而不，而不選選A A。 引物引物33端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，端錯(cuò)配時(shí)，不同堿基引發(fā)效率存在著很大的差異，當(dāng)末位的堿基為當(dāng)末位的堿基為A A時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈時(shí)，即使在錯(cuò)配的情況下，也能有引發(fā)鏈的合成，而當(dāng)末位鏈為的合成，而當(dāng)末位鏈為T T時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，時(shí)，錯(cuò)配的引發(fā)效率大大降低，G G、C C錯(cuò)配的引發(fā)效率介于錯(cuò)配的引發(fā)效率介于A A、T T之間，所以之間，所以33

9、端最好選擇端最好選擇T T。？（7 7）5 5端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：端序列添加限制性酶切位點(diǎn)：一些概念一些概念 有意鏈（有意鏈（Sense strandSense strand），正義鏈（），正義鏈（positive positive strandstrand），編碼鏈（），編碼鏈（coding strandcoding strand）；無意鏈（）；無意鏈（anti-anti-sense strandsense strand），負(fù)義鏈（），負(fù)義鏈（negative strandnegative strand），模板），模板鏈（鏈（template strandtemplate strand

10、） 正向引物正向引物 （forward primerforward primer）：處于）：處于DNADNA雙鏈上游的引物。如用于雙鏈上游的引物。如用于測序，則從測序，則從5 533方向讀出方向讀出 DNADNA正鏈的序列。正鏈的序列。 反向引物反向引物 （Reverse primerReverse primer）：處于目的）：處于目的DNADNA雙鏈下游的引物。如用雙鏈下游的引物。如用于測序，則讀出于測序，則讀出 DNADNA負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。負(fù)鏈從下游到上游的反向序列。 Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物軟件設(shè)計(jì)引物 是由加拿大的是由加拿大的 Premier Pr

11、emier 公司開發(fā)的專業(yè)用于公司開發(fā)的專業(yè)用于PCRPCR或測序引物以及雜交探針或測序引物以及雜交探針的設(shè)計(jì)、評估的軟的設(shè)計(jì)、評估的軟件件 主要界面分為序列編輯窗口（主要界面分為序列編輯窗口（genetankgenetank）、）、primer designprimer design、酶切分析（、酶切分析（restriction restriction sitesite）和）和 Motif Motif 正向（正向（As isAs is）、反向（）、反向（reversedreversed）、互補(bǔ)（）、互補(bǔ)（complementedcomplemented）及反向互）及反向互補(bǔ)（補(bǔ)（revers

12、e complemented reverse complemented ）。）。正向（正向（As isAs is）反向（反向（reversedreversed）互補(bǔ)（互補(bǔ)（complementedcomplemented）Enzyme軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊軟件默認(rèn)以表格方式顯示酶切結(jié)果。單擊Seq Seq 或或 MapMap，分別以序列或圖示，分別以序列或圖示的方式顯示結(jié)果。的方式顯示結(jié)果。缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)果。缺點(diǎn)：不能以文本的形式保存結(jié)果。Motif Primer點(diǎn)擊點(diǎn)擊 SearchSearch，進(jìn)行引物搜索，進(jìn)行引物搜索Search criteria Searc

13、h criteria 窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。窗口：多種參數(shù)可以調(diào)整。Primer LengthPrimer Length常設(shè)置在常設(shè)置在181830bp,30bp,短了特異短了特異性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的性不好，長了沒有必要。當(dāng)然有特殊要求的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之之間，小于間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于電泳出來，條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。上限倒

14、也不必要求苛刻。ManualSearch parameters ManualSearch parameters 人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。人工搜索參數(shù)設(shè)置窗口。Search stringencySearch stringency應(yīng)選應(yīng)選HighHigh。GCGC含量一般是含量一般是40406060。其它參數(shù)默認(rèn)就可以其它參數(shù)默認(rèn)就可以。Search progress Search progress 窗口中顯示窗口中顯示Search CompletedOKSearch CompletedOK鍵鍵結(jié)果窗口結(jié)果窗口有三種顯示形式，上游引物、下游引物和成對顯示。引物按優(yōu)有三種顯示形式，上游引物、下游引物和

15、成對顯示。引物按優(yōu)劣次序排列，滿分為劣次序排列，滿分為100100。選其中的一對引物，在主窗口顯示結(jié)果。選其中的一對引物，在主窗口顯示結(jié)果。對于對于上述上述引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可引物，如果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，以，可可在引物末端去掉一個(gè)不滿意在引物末端去掉一個(gè)不滿意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。估參數(shù)有沒有變好點(diǎn)。搜索出來的引物，按搜索出來的引物，按RatingRating排序，排序，逐個(gè)送逐個(gè)送OligoOligo軟件里評估。軟件里評估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它短，你可以不選擇它。引

16、物引物3 3端端22個(gè)個(gè)A A或或T,T,或引物內(nèi)部連續(xù)或引物內(nèi)部連續(xù)的的G G或或C C太多，或引物太多，或引物3 3端端22個(gè)個(gè)G G或或C C，這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就這樣的引物應(yīng)作為次選，沒得選了就選它。選它。該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，該圖分為四部分：最上面是圖示模板及產(chǎn)物位置，“S”S”和和“A”A”可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊可查看有義鏈或反義鏈的引物。右邊是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物是兩個(gè)引物在模板上結(jié)合位置的直觀圖；第二層是模板及引物序列的配對情況；第三層顯示引物的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引

17、物的最佳退火溫度！第四層：四種重要指標(biāo)的分析的各種參數(shù)。注意：尾末給出該引物的最佳退火溫度！第四層：四種重要指標(biāo)的分析引物長度：控制著引物的特異性和在引物長度：控制著引物的特異性和在PCR反應(yīng)中的退火溫度。長的反應(yīng)中的退火溫度。長的PCR引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高引物能給擴(kuò)增帶來更好的特異性，可以通過降低退火溫度提高反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等反應(yīng)的靈敏度，不過長引物易形成包括發(fā)夾結(jié)構(gòu)二聚體自身互補(bǔ)等二級結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為二級結(jié)構(gòu)。適宜引物長度為18-27 nt。Tm 融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿融鏈溫度：根據(jù)相鄰二堿基對作用原理來計(jì)算融鏈

18、溫基對作用原理來計(jì)算融鏈溫度。度。PCR 反應(yīng)的合適反應(yīng)的合適 Tm 范范圍為圍為56-63 （50-70）GC% 含量：對于含量：對于PCR 反應(yīng)來說反應(yīng)來說 GC含含量在量在50% 左右比較合左右比較合適。適。（40-60%,45-55%）Degeneracy多義性，盡量減少引物多義性，盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異多義性，這樣會帶來更好的特異性，盡量避免性，盡量避免3末端的多義性，末端的多義性，因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)因?yàn)檫@個(gè)位置即使一個(gè)堿基的錯(cuò)配都能阻止引物延伸。配都能阻止引物延伸。 BLAST 驗(yàn)證引物驗(yàn)證引物 , 點(diǎn)擊點(diǎn)擊Basic BLAST中的中的 nucleot

19、ide blast 選項(xiàng)選項(xiàng) 在在Enter Query SequenceEnter Query Sequence欄中輸入引物序列：欄中輸入引物序列： 例例：引物為引物為5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3;5-CTGAGATCCTGAGCCTTTGG-3; 5-TGCCCATCACAACATCATCT-35-TGCCCATCACAACATCATCT-3 同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從同時(shí)輸入上下游引物。輸入上下游引物都從5 5 3 3。輸。輸入上游引物后，加上入上游引物后，加上2020個(gè)字母個(gè)字母n n，再輸入下游引物。，再輸入下游引物。 在在Choose Search

20、SetChoose Search Set欄中：欄中：DatabaseDatabase根據(jù)預(yù)操作基因根據(jù)預(yù)操作基因的種屬定了，可選的種屬定了，可選Human genomic + transcriptHuman genomic + transcript或或OthersOthers 在在Program SelectionProgram Selection中：選擇中：選擇Somewhat similar sequences Somewhat similar sequences (blastn)(blastn)項(xiàng)，如下圖：項(xiàng)，如下圖： 在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊在此界面最下面關(guān)鍵要點(diǎn)擊Algorithm

21、parametersAlgorithm parameters參數(shù)參數(shù)設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。設(shè)置，進(jìn)入?yún)?shù)設(shè)置界面。 在在General ParametersGeneral Parameters中：中：Expect thressholdExpect thresshold期望閾值須改為期望閾值須改為10001000，大，大于于10001000也可以；在也可以；在Word sizeWord size的下拉框?qū)?shù)字改為的下拉框?qū)?shù)字改為7 7。圖中：序列與引物匹配的得分值小于圖中：序列與引物匹配的得分值小于4040分、分、40405050分、分、50-8050-80分、分、80-20080-200分

22、分等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照等，分值越高，特異性越好；線段代表上或下游引物，其顏色和上面對照后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基后就可得出該條引物的分值。兩線段間沒有連線的，表示單條引物與該基因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（因一致。有連線的代表這些序列與上游引物匹配（Strand=Plus/PlusStrand=Plus/Plus）、）、并與下游引物互補(bǔ)（并與下游引物互補(bǔ)（Strand=Plus/MinusStrand=Plus/Minus），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。），理論上可以擴(kuò)增出基因片斷。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)

23、到該基因的結(jié)果信息概要。點(diǎn)擊線段，就能跳轉(zhuǎn)到該基因的結(jié)果信息概要。Accession，數(shù)據(jù)庫系列數(shù)據(jù)庫系列的身份證：點(diǎn)擊之后的身份證：點(diǎn)擊之后可以獲得該序列的信可以獲得該序列的信息息Desscription序列序列的的簡單描述簡單描述高的就是有兩線段間有連線高的就是有兩線段間有連線的的代表隨機(jī)匹配的可能性代表隨機(jī)匹配的可能性。E值接近零時(shí)最有意義，值接近零時(shí)最有意義，也就是說序列完全匹配也就是說序列完全匹配了。了。比對到的序列長度比對到的序列長度E值越小為好！值越小為好！匹配上的堿基數(shù)占總匹配上的堿基數(shù)占總序列長度的比例序列長度的比例缺失或插入，用缺失或插入，用“-”來表示來表示Query1、

24、2表示輸入的表示輸入的兩對引物，兩對引物，Sbjct表示在表示在庫里比對的序列庫里比對的序列Primer BLAST的詳細(xì)結(jié)果的詳細(xì)結(jié)果ncbi 在線在線 primer 設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從默認(rèn)的參數(shù)實(shí)際上是從100到到1000，這個(gè)，這個(gè)你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小你得自己改，如果你希望產(chǎn)物的大小符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，符合你的預(yù)期，盡可能把范圍改小，比如比如480-500 至于至于RT-PCR所用的引物，最好是使得產(chǎn)所用的引物，最好是使得產(chǎn)物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在物跨過內(nèi)含子，這樣避免潛在DNA對對RT-PCR的干擾。的干擾。 用用OligoOligo軟件軟件設(shè)計(jì)設(shè)計(jì)

25、/ /評估評估PCRPCR引物引物 啟動(dòng)啟動(dòng)OligoOligo，選擇，選擇FileFileopenopen，打開要進(jìn)行引物分析的序列。，打開要進(jìn)行引物分析的序列。 圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：圖中顯示的三個(gè)指標(biāo)：TmTm值、值、GG和和 Frequencies Frequencies。退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的退火溫度窗口是設(shè)計(jì)引物的主窗口，其他兩個(gè)具有輔助主窗口，其他兩個(gè)具有輔助作用。作用。 因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動(dòng)窗口的因?yàn)榉治鲆婕岸鄠€(gè)指標(biāo)，啟動(dòng)窗口的Cascade Cascade 排列方式排列方式不太方便，可從不太方便，可從windowswindows菜單改為菜單改為TileTile方式。

26、方式。用用TileTile方式顯方式顯示窗口示窗口TmTm，退火溫度窗口，退火溫度窗口TmTm值曲線以選取值曲線以選取7272附近為佳；附近為佳；5 5到到3 3端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。端的下降性狀也有利于引物引發(fā)聚合反應(yīng)。圈出來的序列部分及黃色的圈出來的序列部分及黃色的barbar即代即代表當(dāng)前分析的表當(dāng)前分析的2121個(gè)堿基的個(gè)堿基的TmTm值值 可點(diǎn)擊窗口的左下角的可點(diǎn)擊窗口的左下角的UpperUpper、LowerLower按鈕按鈕選擇上游引物、下游引物。選擇上游引物、下游引物。 TmTm值似乎太低了值似乎太低了TmTm值似乎太高了值似乎太高了顯示了裝載的整個(gè)序列的顯示了

27、裝載的整個(gè)序列的 6-7 mers6-7 mers寡核苷酸順序的相對頻寡核苷酸順序的相對頻率。寡核苷酸的率。寡核苷酸的3 3端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫端如果在一個(gè)特定的數(shù)據(jù)庫（GenBankGenBank的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），的子數(shù)據(jù)庫）更普遍（即出現(xiàn)的頻率更高），那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。那么更容易導(dǎo)致錯(cuò)誤引發(fā)。FrequenciesFrequencies，堿基頻率窗口，堿基頻率窗口如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為如果選擇出現(xiàn)頻率較低的位點(diǎn)作為3 3末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物末端，那么就減少了在復(fù)雜的底物（比如整個(gè)（比如整個(gè)基因組基因組DNADNA）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾

28、率，從而）內(nèi)的許多位點(diǎn)結(jié)合、引發(fā)的幾率，從而減少了非特異性減少了非特異性PCRPCR產(chǎn)物的形成。產(chǎn)物的形成。 平均頻率為平均頻率為10001000的話，的話，CTTGGCCTTGGC的頻率的頻率為為15001500以上，而以上，而TTGGCGTTGGCG德頻率很低，德頻率很低，約約300300。GG，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口，序列內(nèi)部堿基穩(wěn)定性窗口 顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性顯示了寡核苷酸的內(nèi)部穩(wěn)定性( (五聚體的自有能五聚體的自有能) )。-1.9-1.9值值=-=-（3.1+3.1+3.1+1.63.1+3.1+3.1+1.6）GG值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；值反應(yīng)了序列與模板的結(jié)合強(qiáng)度；

29、最好引物的最好引物的GG值在值在5 5端和中間值比較高，而在端和中間值比較高，而在3 3端相對低。端相對低。在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰在一個(gè)雙鏈結(jié)構(gòu)中，堿基對的相對穩(wěn)定性是由其鄰近堿基決定的，以自由能近堿基決定的，以自由能GG表示。表示。第二個(gè)核苷酸第二個(gè)核苷酸第一個(gè)（第一個(gè)（5 5）核苷酸）核苷酸例子：雙鏈例子：雙鏈d d（ACGG/CCGTACGG/CCGT）的）的GG是：是： G G（ACGGACGG）=G=G（ACAC）+ +GG（CGCG）+ +GG（GGGG） 顯示了顯示了3 3末端序列末端序列GG值較低，值較低，適合引發(fā)。適合引發(fā)。 3 3末端序末端序列列GG太

30、高。太高。你可以在三個(gè)窗口中你可以在三個(gè)窗口中自行設(shè)計(jì)引物。自行設(shè)計(jì)引物。選擇了自己認(rèn)為順眼選擇了自己認(rèn)為順眼的位置，此時(shí)，點(diǎn)的位置，此時(shí)，點(diǎn)擊擊UperUper，上游引物，上游引物即可顯示。即可顯示。同時(shí)在序列下游尋找下同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示下游引物。即可顯示下游引物。對你設(shè)計(jì)的引物對你設(shè)計(jì)的引物質(zhì)量進(jìn)一步分析。質(zhì)量進(jìn)一步分析。同時(shí)在序列下游尋找下同時(shí)在序列下游尋找下游引物，點(diǎn)擊游引物，點(diǎn)擊LowerLower，即可顯示下游引物。即可顯示下游引物。 參數(shù)設(shè)置與搜索選擇參數(shù)設(shè)置與搜索選擇searchfor primers and probes

31、searchfor primers and probes，進(jìn)行如右圖設(shè)置。進(jìn)行如右圖設(shè)置。 點(diǎn)擊點(diǎn)擊search rangessearch ranges，設(shè)置引物范圍和，設(shè)置引物范圍和 PCR PCR產(chǎn)物的大小產(chǎn)物的大小 點(diǎn)擊點(diǎn)擊parametersparameters，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。，進(jìn)行參數(shù)設(shè)置。因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都因?yàn)樵O(shè)計(jì)的是一對引物，正、負(fù)鏈的復(fù)選框都要選上。同時(shí)選要選上。同時(shí)選compatible pairscompatible pairs默認(rèn)下，對引物的要求：無二聚默認(rèn)下，對引物的要求：無二聚體、體、3 3高度特異、高度特異、GC%GC%含量含量有限定、去除錯(cuò)誤

32、引發(fā)引物等。有限定、去除錯(cuò)誤引發(fā)引物等。 引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。引物的長度及產(chǎn)物的長度設(shè)置。 Primer LengthPrimer Length設(shè)置在設(shè)置在181830bp,30bp,短了特異短了特異性不好，長了沒有必性不好，長了沒有必要要; ; PCR Product sizePCR Product size最好是最好是100100500bp500bp之間，小于之間，小于100bp100bp的的PCRPCR產(chǎn)物產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊瓊脂糖凝膠電泳出來，條帶很模糊。上限沒有太多的限定。上限沒有太多的限定。 普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù)普通設(shè)置、參數(shù)及更多參數(shù) 從高到低六個(gè)等級的

33、設(shè)定，從高到低六個(gè)等級的設(shè)定，最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。最后有一個(gè)用戶定制選項(xiàng)。當(dāng)對軟件功能不了解時(shí)，當(dāng)對軟件功能不了解時(shí)，應(yīng)應(yīng)選選very high/very high/HighHigh。 選選automatically change string automatically change string 后，搜索引物時(shí)，如果在高等后，搜索引物時(shí)，如果在高等級設(shè)定中無法搜索到引物對時(shí)級設(shè)定中無法搜索到引物對時(shí)自動(dòng)降級一個(gè)等級來搜索，直自動(dòng)降級一個(gè)等級來搜索，直到找到為止。到找到為止。反向引物時(shí)用反向引物時(shí)用讓引物的長度可以改變，以讓引物的長度可以改變，以適應(yīng)設(shè)定的適應(yīng)設(shè)定的TmTm值或值或PEP

34、E（prime Efficeinceprime Efficeince）值）值（引發(fā)效率）。（引發(fā)效率）?？梢韵薅ㄋx引物對的最可以限定所選引物對的最大數(shù)目。大數(shù)目。實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有實(shí)際上需要我們改動(dòng)的只有引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)引物的長度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求做相應(yīng)改動(dòng)。需求做相應(yīng)改動(dòng)。其他的參數(shù)就使用其他的參數(shù)就使用OligoOligo默認(rèn)默認(rèn)值，一般無需改動(dòng)。值，一般無需改動(dòng)。直接使用直接使用OligoOligo默認(rèn)值，一般默認(rèn)值，一般也無需改變。也無需改變。 參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)參數(shù)設(shè)置完畢后，點(diǎn)擊確認(rèn)OKOK，程序即進(jìn)行引物搜索。，程序即進(jìn)行引物搜索。引物搜索結(jié)果如入：引物搜索結(jié)果如入

35、： OligoOligo提供了按引物位置、提供了按引物位置、產(chǎn)物大小、退火溫度、產(chǎn)物大小、退火溫度、GCGC含量等的排列方式。含量等的排列方式。OligoOligo最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它最突出的功能不在于引物搜索而在于引物分析。它提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。提供了多種分析方法并以不同的形式展現(xiàn)出來。選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動(dòng)彈出一個(gè)選擇其中的一對引物，這時(shí)程序自動(dòng)彈出一個(gè)PCRPCR分析分析窗口。窗口。PCRPCRoptimal annealing temperatureoptimal annealing temperature （最佳退（最佳退火溫度

36、）火溫度）數(shù)值得參考。在數(shù)值得參考。在PCRPCR摸索條件的摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2 2的范圍就可的范圍就可以了。以了。產(chǎn)物產(chǎn)物TmTm值與引值與引物物TmTm值（低的那個(gè)）的值（低的那個(gè)）的差異，一般控制在差異，一般控制在2020度以內(nèi)。度以內(nèi)。引引物間物間TmTm值的差異，一般控制值的差異，一般控制在在5-65-6度以內(nèi)。度以內(nèi)。引發(fā)效率：上（下）引物對于正、引發(fā)效率：上（下）引物對于正、負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。負(fù)鏈正確引發(fā)效率比。最佳引物濃度最佳引物濃度在在Analyze Analyze 菜單中，菜單中，Oligo Oligo 提供了眾多分析提供了眾多

37、分析功能。選擇相應(yīng)的功能，功能。選擇相應(yīng)的功能，分析結(jié)果。分析結(jié)果。點(diǎn)擊點(diǎn)擊Selected primersSelected primers，會給，會給出兩條引物的概括性信息出兩條引物的概括性信息; ;其中包括引物的其中包括引物的TmTm值，此值值，此值OligoOligo是采用是采用nearest neighbor nearest neighbor methodmethod計(jì)算，會比計(jì)算，會比Primer5Primer5中引中引物的物的TmTm值略高值略高; ;引物的引物的Delta GDelta G和和33端的端的Delta Delta G G: : 33端的端的Delta GDelta

38、G過高，會在過高，會在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNADNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對值應(yīng)該小一些，最好不要超過值應(yīng)該小一些，最好不要超過9 9。Key InfoKey InfoDuplex formation Duplex formation ，引物二聚體，引物二聚體引物引物二聚體是影響二聚體是影響PCRPCR反應(yīng)異常的重要因素反應(yīng)異常的重要因素應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物應(yīng)避免，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其G G值應(yīng)該偏低值應(yīng)該偏低由由退火溫度決定，退火溫度決定，5050的退的退火溫度和火溫度和65

39、65對二聚體的影響對二聚體的影響肯定肯定不一樣不一樣。The most stable 3-DimerThe most stable 3-Dimer Delta GDelta G絕對絕對值一般不要超過值一般不要超過4.5kcal/mol4.5kcal/mol。G G絕對值越絕對值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。結(jié)合堿基對不要超過結(jié)合堿基對不要超過3 3個(gè)。個(gè)。t the most stable Dimer overallhe most stable Dimer overall絕對絕對值一般應(yīng)小于多少值一般應(yīng)小于多少kcal/molkcal/mol跟跟PCRPCR退火溫度有關(guān)退火溫度有關(guān)。實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)表

40、明。表明。Hairpin formation Hairpin formation ，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物發(fā)夾結(jié)構(gòu)Delta GDelta G絕對值一般不要絕對值一般不要超過。超過。結(jié)合堿基對不要超過結(jié)合堿基對不要超過3 3個(gè)。個(gè)。特定的發(fā)夾如果沒有顯示特定的發(fā)夾如果沒有顯示TmTm值，那么值，那么發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)就不容易形成 。結(jié)合堿基對已經(jīng)超過結(jié)合堿基對已經(jīng)超過3 3個(gè)。個(gè)。在在3 3形成發(fā)夾會引發(fā)引形成發(fā)夾會引發(fā)引物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少物內(nèi)部的延伸反應(yīng)，減少了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)了參加正式反應(yīng)引物的數(shù)量量。Composition and TmComposition and Tm上

41、下游引物的上下游引物的GCGC控制在控制在40406060。最后一種是最后一種是Primer5Primer5所采用的方所采用的方法。法。Td is a normalized Tm in Td is a normalized Tm in 1M salt conditions1M salt conditionsthe Tm is a variable value, that the Tm is a variable value, that depends on salt and DNA depends on salt and DNA concentration set in the Search

42、concentration set in the Search Parameters windowParameters windowTmTm值高時(shí)錯(cuò)配很少，特值高時(shí)錯(cuò)配很少，特異性強(qiáng)。異性強(qiáng)。False priming sitesFalse priming sites，錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)oligooligo會給正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引會給正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率。發(fā)效率。一般的原則一般的原則：使誤引發(fā)效率使誤引發(fā)效率控制控制在在100100以下。以下。有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話，比如達(dá)到話，比如達(dá)到400400500500，錯(cuò)誤引，錯(cuò)誤引發(fā)效率超過發(fā)效率

43、超過100100幅度若不大的話，也幅度若不大的話，也可以接受?？梢越邮?。PrimerPrimer的的priming efficiencypriming efficiency應(yīng)該應(yīng)該是錯(cuò)配地方的是錯(cuò)配地方的4 4倍左右，更多當(dāng)然倍左右，更多當(dāng)然更好。更好。下游引物對于下游引物對于負(fù)鏈，沒有發(fā)負(fù)鏈，沒有發(fā)現(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)?，F(xiàn)錯(cuò)誤引發(fā)。Selected OligoSelected OligoPrimer pairsPrimer pairs系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對。系統(tǒng)設(shè)計(jì)出的所有引物對。internal stabilityinternal stabilityInternal stabilityInterna

44、l stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證低的弧形，最起碼保證3 3端不要過于穩(wěn)定。端不要過于穩(wěn)定。引物引物3 3端過于穩(wěn)定，很端過于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。上游引物的參數(shù)上游引物的參數(shù)注意：必需把方框拉到上游引物處。注意：必需把方框拉到上游引物處。對應(yīng)的下游引物的參對應(yīng)的下游引物的參數(shù)數(shù)注意：必需把方框拉到下游引物處。注意：必需把方框拉到下游引物處。Hybridization timeHybridization time，雜交時(shí)間，雜交時(shí)間該窗口顯示了不同長度、不同濃度的寡該窗

45、口顯示了不同長度、不同濃度的寡核苷酸的雜交時(shí)間核苷酸的雜交時(shí)間 ConcentrationConcentration您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地您只需點(diǎn)一下鼠標(biāo)，就輕松地實(shí)現(xiàn)對你地引物、實(shí)現(xiàn)對你地引物、PCRPCR產(chǎn)物、產(chǎn)物、DNADNA模版鏈即時(shí)的濃度、體積、模版鏈即時(shí)的濃度、體積、ODOD值、分子量的轉(zhuǎn)換。值、分子量的轉(zhuǎn)換。該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間該濃度窗口是一個(gè)強(qiáng)大的時(shí)間保存計(jì)算器。保存計(jì)算器。 OligoOligo不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本不僅能以圖表的方式將結(jié)果展示出來，還能以文本的形式保存。的形式保存。 在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇在軟件所出現(xiàn)的任何一個(gè)窗口，選擇Filedata AsFiledata As，把數(shù)據(jù)存，把數(shù)據(jù)存為一個(gè)文本文件。為一個(gè)文本文件。文本保存的結(jié)果如下：文本保存的結(jié)果如下：最佳退火溫度最佳引物濃度、鹽濃度Primer premier 5Primer premier 5設(shè)計(jì)引物設(shè)計(jì)引物OligoOligo引物評估引物評估 舉例說明：舉例說明：ncbincbi里查找里查找基因基因 LIF LIF 的