白介2研究進展2

1、。白細胞介素 2 的研究進展 白細胞介素 -2 （ interleukin-2 ， IL-2 ） 是 T 淋巴細胞所產(chǎn)生的一類重要的淋巴因子， 具有廣泛的生物學(xué)活性，不僅可以促進 T 、 B 淋巴細胞 、 NK 細胞 、 單核細胞的分裂增殖， 還可以促進其它細胞因子如干擾素等的分泌， 增強抗原提呈作用， 是調(diào)節(jié)機體免疫的重要細胞因子，在抗腫瘤 、 抗毒素及感染性疾病的治療中也具有重要用自白細胞介素 -2 發(fā)現(xiàn)以來， 許多學(xué)者對其展開研究， 對白細胞介素 -2 的結(jié)構(gòu) 、 分泌 、 調(diào)節(jié) 、 種屬特異性 、 生物學(xué)活性 、 受體等方面有了較深的認識， 本文就白細胞介素 2 的研究進展作一綜述IL

2、-2 的發(fā)現(xiàn)及命名l 當時分別稱之為 “ 淋巴細胞絲裂原因子 ” （ lymphocyte mitogenic factor ） 、“ 致母細胞性因子 ” （ blastogenic factor ） 、“ T 細胞激活因子 ” （ T cell activating factor ） 。 1976 年， Morgan等發(fā)現(xiàn)，將 T 細胞上世紀 60 年代，一些學(xué)者發(fā)現(xiàn)多種來源于植物的外源凝集素（ lectin ） 可在體外刺激淋巴細胞轉(zhuǎn)化及增殖 。 這些外源凝集素如植物血凝素（ Phytohemagglutinin ， PHA ），刀豆蛋白 A （ Concanavalin A ， Con

3、A ） 對淋巴細胞起著有絲分裂原的作用 。 在絲裂原刺激的淋巴細胞培養(yǎng)上清中具有可溶性絲裂原因子1u 絲裂原（ PHA ） 刺激的人外周血淋巴細胞培養(yǎng)上清加入體外培養(yǎng)的人白血病細胞或骨髓細胞之后， 該上清可導(dǎo)致上述細胞的體外增殖， 作者當時將種上清稱為 “ 條件培養(yǎng)基 ” （ condition medium ， CM ） 。 表型分析及功能測定均證實， CM 誘導(dǎo)生長的細胞為正常 T 細胞群體 。 Gills 和 Smith3等利用 ConA 刺激的大鼠及小鼠 CM 先后在體外建立了小鼠細胞毒性 T 細胞（ Cytotoxic T Lymphocyte ， CTL ） 和輔助性 T 細胞（

4、help T cell ， Th ） 克隆 。 這些傳代培養(yǎng)的 T 細胞克隆株的生長嚴格依賴于 CM ， 去除 CM 后傳代的 T 細胞迅速死亡 。 很顯然， 能夠促進效應(yīng)性 T 細胞體外增殖的關(guān)鍵因素是存在于 CM 中的某些活性分子， 當時根據(jù)生物活性將其命名為 T 細胞生長因子（ T cell growth factor ， TCGF ） 。 1979 年第二屆國際淋巴因子會議將 TCGF 命名為白細胞介素 -2 （ IL-2 ） 。 IL-2 的發(fā)現(xiàn)， 為體外長期培養(yǎng) T 細胞克隆提供了方便， 也揭開了細胞因子網(wǎng)絡(luò)研究的序幕 。 5 2. IL-2 的理化特性和生物學(xué)活性 通過 DEAE

5、-Sephacel 離子交換層析， Sephadex G-100 分子篩過濾， 制備性等電聚焦（ IEF ） 和聚丙烯酰胺凝膠電泳等生化提取手段， 已分離純化了多種種屬 IL-2 。 1979 犬白細胞介素 -2 基因的克隆 、 表達及表達產(chǎn)物的復(fù)性研究 年， Wastson 4 等首次純化了小鼠的 IL-2 ，凝膠分析后認為，小鼠 IL-2 的分子量為 30 KD ，等電聚焦后形成兩條帶，等電點（ pI ） 分別為 4.3 和 4.9 。 此后，大鼠 、 人 、 長臂猿 、 豚鼠 、 兔 、 豬 、 綿羊 、 牛以及雞等的 IL-2 相繼被證實， 他們的一些特點見表 1 ，表 2 5,6 。

6、 IL-2 的主要靶細胞是 T 淋巴細胞， 同時也具有下列生物學(xué)活性：（ 1 ） 促進 T 細胞生長及克隆性擴增；（ 2 ） 誘導(dǎo)或增強細胞毒性細胞（如 NK 、 LAK 、 TIL ） 的殺傷活性；（ 3 ） 協(xié)同刺激 B 細胞增殖及分泌；（ 4 ） 增強活化的 T 細胞產(chǎn)生 IFN 和 CSF ；（ 5 ）誘導(dǎo)淋巴細胞表達 IL-2R 。 年， Wastson 4 等首次純化了小鼠的 IL-2 ，凝膠分析后認為，小鼠 IL-2 的分子量為 30 KD ，等電聚焦后形成兩條帶，等電點（ pI ） 分別為 4.3 和 4.9 。 此后，大鼠 、 人 、 長臂猿 、 豚鼠 、 兔 、 豬 、 綿

7、羊 、 牛以及雞等的 IL-2 相繼被證實， 他們的一些特點見表 1 ，表 2 5,6 。 IL-2 的主要靶細胞是 T 淋巴細胞， 同時也具有下列生物學(xué)活性：（ 1 ） 促進 T 細胞生長及克隆性擴增；（ 2 ） 誘導(dǎo)或增強細胞毒性細胞（如 NK 、 LAK 、 TIL ） 的殺傷活性；（ 3 ） 協(xié)同刺激 B 細胞增殖及分泌；（ 4 ） 增強活化的 T 細胞產(chǎn)生 IFN 和 CSF ；（ 5 ）誘導(dǎo)淋巴細胞表達 IL-2R 。 表 1 天然 IL-2 的理化特性 3. IL-2 的結(jié)構(gòu)與功能 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)（包括一級結(jié)構(gòu)和空間結(jié)構(gòu)） 與功能密切相關(guān) 。 近年來， 借助基因工程 、 蛋白質(zhì)工程

8、技術(shù)， 已可在基因水平對 IL-2 進行定向改造， 并制造出多種變異的 IL-2 分子，為分析 IL-2 的結(jié)構(gòu)功能關(guān)系鋪平了道路 。 同時利用 X 線衍射對 IL-2 進行蛋白質(zhì)晶體分析， 并結(jié)合電子計算機技術(shù)設(shè)計出了 IL-2 三維結(jié)構(gòu)模型， 也為進一步闡明 IL-2 空間結(jié)構(gòu)及 IL-2 與 IL-2 受體相互作用的機制奠定了基礎(chǔ) 。 人 IL-2 由 133 個氨基酸組成， 其分子中有 3 個半胱氨酸（ Cys ）， 分別位于第 58 、 105 和 125 位， 第 58 與 105 位 Cys 之間形成一個二硫鍵 7 。 IL-2 的二級結(jié)構(gòu)主要由 6 個 - 螺旋區(qū)組成，分別為螺

9、旋 A （ 11 19 ） 、 螺旋 B （ 33 56 ）（中間被 47 Pro 隔斷，分為 B ， B ），螺旋區(qū) C （ 66 78 ），螺旋區(qū) D （ 83 101 ），螺旋區(qū) E （ 107 113 ） 和螺旋區(qū) F （ 117 133 ） 。 成熟的 IL-2 分子， 6 個螺旋區(qū)折疊， N 端與中區(qū)靠近， 螺旋區(qū) B 、 C 、 D 、 F 形成一個反向平行的 - 螺旋束 8 、 9 。 近年來， 利用基因定位突變法改變 IL-2 中氨基酸的順序， 觀察突變體的活性 、 空間結(jié)構(gòu)及與受體結(jié)合能力的變化， 獲得許多 IL-2 結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)信息 。 國內(nèi)外許多學(xué)者進行了相關(guān)的研究

10、 。 就 IL-2 分子整體而言， 其天然構(gòu)型的穩(wěn)定性對其功能有非常重要的作用 。 IL-2 靠 58 位和 105 位的 Cys 間形成二硫鍵維持其空間結(jié)構(gòu) 。 Wang 等 7 用特異位點誘變法修飾了 IL-2 基因上編碼 Cys 的密碼子，使之編碼絲氨酸（ Ser ） 或丙氨酸（ Ala ），得到了 Ser 58 -IL-2 、 Ser 105 -IL-2 及 Ser 125 -IL-2 變異分子 。 這一突變導(dǎo)致了 IL-2 一級結(jié)構(gòu)的微小改變， 一個氧原子代替了硫原子， 防止突變位點上形成二硫鍵 。 SDS-PAGE 分析證實，各種 IL-2 的分子量仍為 15KD ，但生物學(xué)活性卻

11、有顯著差別 。 Cys 58 和 Cys 105 被 Ser 替代后， IL-2 的活性幾乎完全消失 10 ， 說明 58 位的 Cys 和 105 位 Cys 間的二硫鍵對維持 IL-2 的活性構(gòu)像是必需的 。 Wang 等 7 發(fā)現(xiàn) Ser 58 突變型 IL-2 活性低于 Ser 105 -IL-2 ， 這提示 58 位的 Cys 除參與二硫鍵外， 可能還有其它作用， 推測可能與結(jié)合 IL-2 受體有關(guān) 。 而當用 Ser （或 Ala ） 替代 Cys 125 時， IL-2 活性明顯提高 10 ， 這說明 125 位的 Cys 不參與二硫鍵的形成，也不參與受體結(jié)合 。 對于基因工程重

12、組 IL-2 來說， 125 位的 Cys 的存在會引起分子內(nèi)二硫鍵的錯配，或分子間二聚體的形成，這雖不直接影響 IL-2 與受體的結(jié)合，但破壞了 IL-2 分子的天然構(gòu)型，從而影響 IL-2 的活性，若將其改成 Ser 或 Ala ，就排除了 Cys 125 與 Cys 58 或 Cys 105 之間形成錯配二硫鍵的可能性， 從而提高了 IL-2 的活性 。 Fukuhara 11 用質(zhì)譜技術(shù)分析了 Turkat 細胞分泌的 IL-2 和基因工程產(chǎn)生的重組 IL-2 的氨基酸順序也證實了上述結(jié)論 。 于忠國等 12 應(yīng)用 PCR 和定點突變技術(shù)將編碼 125 位的 Cys 的密碼子突變成編碼

13、丙氨酸（ Ala ） 的密碼子， 將此突變基因受控于 P R P L 串連啟動子和人工合成 SD 序列， 在 E.coli 中獲得高效表達， 用凝膠過濾法分離表達產(chǎn)物獲得新型白細胞介素 2 ， 其比活性達 1 × 10 7 IU/mg 蛋白 。 在 IL-2 空間結(jié)構(gòu)中，不同的 螺旋區(qū)結(jié)構(gòu)變化對其功能有不同影響 。 螺旋 A 的存在是 IL-2 活性所必需的 9 、 13 。 螺旋 B 區(qū)中當 30 49 位氨基酸缺失時， IL-2 活性急劇下降 13 、 14 。 螺旋 E 是 IL-2 與 IL-2 受體 亞基的結(jié)合部位， 而與 IL-2 的活性毫無關(guān)系 。 螺旋 A 、 B 、

14、 F 均為兩親性螺旋，其疏水面相互靠近成為一疏水核，是一重要的結(jié)構(gòu)域， 可能與 IL-2 與 亞基的結(jié)合有關(guān)， 這三個 螺旋的穩(wěn)定性及某些氨基酸如 17 Leu 、 20 Asp 、 42 Phe 、 44 Phe 、 45 Tyr 、 56 Leu 、 121 Trp 的側(cè)鏈基團的極性和空間位置對活性有重要影響 10 。 4. IL-2 的基因結(jié)構(gòu)與表達調(diào)控 自 1983 年 Taniquchi 15 等首次克隆了 IL-2 的 cDNA 后， 人們對 IL-2 的基因結(jié)構(gòu) 、 表達調(diào)控進行了深入的研究 。 1984 年， Mita 、 Fujita 9 、 16 等從人類基因組文庫中分離了

15、人 IL-2 的基因組基因，分析了人 IL-2 基因結(jié)構(gòu)并確定其核苷酸序列和側(cè)翼序列 。 IL-2 基因由 4 個外顯子和 3 個內(nèi)含子組成 。 外顯子 1 含 5 端不翻譯區(qū)并且編碼 IL-2 起始的 49 個氨基酸， 其中前 20 個氨基酸為信號肽，在 IL-2 成熟時被水解掉 。 91bp 的間隔區(qū)（內(nèi)含子） 后是編碼 20 個氨基酸的外顯子 2 ，隨后是 2292bp 的長間隔順序，其中含有與病毒增強子核心序列相似的核苷酸序列，有人認為這些序列對活化 T 細胞 IL-2 基因的表達可能有一定作用 。 外顯子 3 編碼接續(xù)的 48 個氨基酸，接下去的第三內(nèi)含子長 1346bp 。 第 4

16、 外顯子編碼余下的 36 個氨基酸 。 PolyA 信號在終止密碼后的 261 個核苷酸處 。 小鼠 IL-2 基因基本組成與人類相似 9 、 17 、 18 ， 內(nèi)含子區(qū)極少有同源部位， 但在外顯子區(qū)， 二種基因的核苷酸順序有 72 一致， 在 5 - 側(cè)區(qū)的 500bp 中 85 同源 。 這種高度同源現(xiàn)象也 提示這一區(qū)域可能參與控制激活 T 細胞 IL-2 基因的表達 。 它們的結(jié)構(gòu)特征與其它諸如 IL-4 、 GM-CSF 等一些細胞因子的基因結(jié)構(gòu)類似， 這一特征提示， 這類細胞因子也許是由一個共同的基因進化而來 19 。 休止淋巴細胞不表達 IL-2 基因，只有經(jīng)外源抗原或絲裂原刺激

17、后 IL-2 基因才活化 。 T 細胞絲裂原 PHA 和 ConA 等可誘導(dǎo) T 細胞表達 IL-2 mRNA ，而 B 細胞絲裂原 LPS （脂質(zhì)體） 、 MDP （胞壁酰二肽） 等則無此作用，表明 IL-2 基因活化是受特定因素調(diào)節(jié)的 。 較多的實驗證明，人靜止或活化 T 細胞的基因組以及分泌或不分泌 IL-2 細胞系的基因組都只含一個 IL-2 的拷貝 20 ， 所以除有等位基因的差異外，人 IL-2 的不均一性均由翻譯后修飾所致 21 。 IL-2 分泌水平和細胞內(nèi) mRNA 的水平密切相關(guān)，這一現(xiàn)象提示， IL-2 的表達調(diào)控很可能是由體內(nèi) mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平所控制 。 Ellio

18、tt 等 22 報導(dǎo)環(huán)孢素 A （ CSA ） 阻斷 IL-2 的產(chǎn)生是由于其抑制 IL-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄及其去穩(wěn)定作用選擇性抑制了細胞內(nèi) IL-2 mRNA 的積聚所致，初步證實了表達調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平 。 6. IL-2 受體（IL-2R） 在早期的研究中 2 、 3 、 40 ， 人們注意到 T 細胞必須經(jīng)抗原或有絲分裂原的刺激才能對 IL-2 起反應(yīng)，這提示人們，外界刺激可使 T 細胞發(fā)生某種形式的變化或產(chǎn)生某種新的成分對 IL-2 起反應(yīng) 。 1981 年， Robb 41 等發(fā)現(xiàn) T 細胞表面存在 IL-2 受體（ IL-2 receptor ， IL-2R ）， IL-2 必須

19、和受體結(jié)合后方能發(fā)揮作用 。 1982 1983 年， Leonard 42 等和 Smith 43 等分別建立了 IL-2R 和 IL-2 單克隆抗體（ monoclonal antibody ， McAb ） 。 Doreen 44 等用 IL-2R mcAb 對 IL-2R 的動態(tài)變化進行了研究，發(fā)現(xiàn) T 細胞受到有絲分裂原等刺激后 IL-2R 即在其表面積累 。 至此， 開創(chuàng)了 IL-2R 及 IL-2 功能研究的新局面 。 IL-2 發(fā)揮其生物學(xué)作用是通過與免疫細胞表達的特異性 IL-2R 結(jié)合，傳導(dǎo) IL-2 信號而實現(xiàn)的 。 T 細胞 、 B 細胞 、 自然殺傷細胞（ NK ）

20、、 淋巴因子活化的殺傷細胞（ LAK ）及單核巨噬細胞表面都存在不同數(shù)量的 IL-2R 45 。 抗原或絲裂原刺激 T 細胞產(chǎn)生 IL-2 ，同時表達 IL-2R 。 此時 T 細胞轉(zhuǎn)變?yōu)?IL-2 應(yīng)答細胞 。 IL-2 與受體結(jié)合誘導(dǎo) T 細胞產(chǎn)生一系列反應(yīng)， 包括細胞增殖 、 分化， 產(chǎn)生其他一些淋巴因子等 。 事實上 IL-2/IL-2R 結(jié)合誘導(dǎo)的細胞增殖反應(yīng)是整個免疫應(yīng)答過程中的關(guān)鍵 46 。 隨著重組 DNA 技術(shù)在免疫學(xué)中的深入應(yīng)用， IL-2R 的研究不斷獲得新的突破： 1987 年 Mitchell 等發(fā)現(xiàn)激活后的 T 細胞表面出現(xiàn)一種能與 IL-2 結(jié)合的抗原成分并稱 之

21、為 Tac 抗原 47 、 48 ； 1989 年， Hatakeyama 等首先分離到了 IL-2R 的基因 49 ；接著 Queen 等研制出了抗 IL-2R 鏈的人 - 鼠嵌合型基因工程抗體 50 ； 1990 年， Tsudo 提出了 IL-2R 可能還有第三種成分 - 鏈 51 。 現(xiàn)已證實 IL-2R 至少由三種獨特的膜成分組成： 鏈（ IL-2R ）， 鏈（ IL-2R ）和 鏈（ IL-2R ） 。 三種成分以不同方式結(jié)合可形成不同類型的 IL-2R 受體， 每種受體與 IL-2 有不同的親和力，依據(jù)與 IL-2 親和力的大小，可將 IL-2R 分成 3 類 。 中 、 高親和

22、力受體分別由 、 和 、 、 鏈組成， 能夠傳導(dǎo) IL-2 介導(dǎo)的細胞增殖和細胞溶解信息； 低親和力受體由 鏈組成， 不能傳導(dǎo) IL-2 介導(dǎo)的信息 。 從表 3 中可見， 、 鏈的結(jié)合是信號鏈所必需的， 但高親和力的 IL-2R （ KD=10 -11 M ）的形成必須有 IL-2R 的參與 48 、 52 。 人們認為 IL-2 的結(jié)合可以誘導(dǎo) IL-2R 的鏈成分發(fā)生構(gòu)象改變，隨后即發(fā)生分子重排而形成功能上更具競爭力的形式 高親和力受體 46 。 不同種類的細胞或同種細胞處于不同的狀態(tài)（靜止或活化）， IL-2 受體的表達不同 。 IL-2 只在活化的 T 細胞中表達 。 Ohashi

23、53 報導(dǎo)外周血單核細胞（ PBMC ）中 CD4 + T 細胞表達少量 鏈（可能由部分處于激活狀態(tài)細胞表達）， 而無任何 鏈表達， CD8 + T 細胞則表達 鏈，而不表達 鏈 。 CD8 + T 細胞靜止時表達 鏈數(shù)量是 180 240 個 / 細胞 。 用 PHA 刺激后 T 細胞既表達 鏈， 又表達 鏈， 其 鏈的表達為 2 × 10 4 4 × 10 4 個 / 細胞， 鏈為 1 × 10 3 2 × 10 3 個 / 細胞 。 活化的 CD4 + T 細胞和 CD8 + T 細胞， 鏈和 鏈表達無顯著差異 。 B 細胞可表達 鏈，有小部分還表

24、達 鏈，而 NK 細胞僅表達 鏈 54 。 一般認為： 鏈屬于結(jié)構(gòu)性蛋白，其表達不需要特異性抗原刺激；而 鏈屬于輔助蛋白， 具有調(diào)節(jié)功能活性的作用， 它的表達需抗原誘導(dǎo) 55 。 所以說 IL-2 鏈只在活化的 T 細胞中表達， 如果異常表達， 則往往與疾病相關(guān) 。 最近的研究表明 56 ， 29.4% 的艾滋?。?AIDS ） 病患者末梢血單核細胞上的 IL-2R 鏈的表達呈陽性，而正常人為陰性 。 除 AIDS 病之外， 在白血病患兒的外周血單核細胞上也觀察到了比正常高的 IL-2R 鏈的表達 55 。 IL-2R 鏈為淋巴細胞特異性分布， RNA 印跡分析表明， 人 T 淋巴細胞系 MO

25、LT 、 MOLT4 、 Jurkat 、 MT-1 、 MT-2 以及 Raji 細胞（ B 細胞系） 表達 IL-2R 鏈的 mRNA ， 而非淋巴細胞系如原單核細胞 THP-1 、 類上皮細胞 HeLa 和肝細胞 HepG-2 不表達 IL-2R mRNA 57 。 小鼠 IL-2R 的分布與人類似，具有顯著的組織特異性 。 IL-2R 在小鼠脾臟和胸腺細胞中表達水平特別高，在單陽性（ CD4 + CD8 - 或 CD4 - CD8 + ） 富集的胸腺細胞比雙陰性（ CD4 - CD8 - ） 胸腺細胞表達水平更高 58 ， 這表明 鏈與淋巴細胞成熟有關(guān) 59 。 鏈的突變往往會引起嚴重

26、的免疫缺陷 。 Noguchi 6 等的研究證實了 鏈的突變與人類 X 染色體隱性遺傳性疾?。?XSCID ） 有關(guān)， 該病以細胞免疫和體液免疫嚴重聯(lián)合缺陷為特征 59 。 IL-2R 的組分中， 除 IL-2R 鏈外， 、 鏈屬于造血因子超家族中的紅細胞生成素家族 。 該受體家族（亦稱 I 型 CKP 家族） 成員的胞外區(qū)與紅細胞生成素（ EPO ） 受體胞外區(qū)在氨基酸序列中有較高的同源性， 分子結(jié)構(gòu)也有較大類似性 。 該家族包括了大多數(shù)細胞因子受體（ CKR ）， 如 IL-2R 和 鏈， IL-3R ， IL-4R ， IL-5R ， IL-6R ， IL-7RIL-9R ， IL-11

27、R ， EPOR ， TPOR ， GM-CSFR ， LIFR ， CNTFR ， OSMR ， KH97 ， GP13 等， 它們的共同特征是： 功能上， 都與造血細胞的增生 、 分化有關(guān)； 分子結(jié)構(gòu)上胞外區(qū)均包括由 200 個氨基酸構(gòu)成的同源區(qū)， N 端有 4 個保守氨基酸 半胱氨酸（ Cys ）其 C 端存在由 Trp-Ser-X-Trp-Ser 組成的 WSXWS 構(gòu)型 4661 。 14 7. IL-2 的種屬特異性 對不同動物 IL-2 交叉作用的研究表明， IL-2 具有一定的種屬特異性， 且有一定規(guī)律， 總的呈下行性， 即進化程度高的動物的 IL-2 可以作用于進化程度較低的

28、動物 。 如人和猿的 IL-2 幾乎可以作用于所有哺乳動物的 T 細胞，但其它哺乳動物的 IL-2 很少可以作用于人 。 在進化程度相當?shù)膭游镏校?也顯示出種屬特異性 。 哺乳動物 IL-2 之間有交叉性：如牛 IL-2 可以作用于水牛和山羊，但活性僅有 35% 74 。 但豬的 IL-2 是一個例外，其作用范圍僅次于人和猿，可以分別作用于豬 、 牛 、 羊 、 鼠和人的 T 細胞 。 對其氨基酸分析表明， 這與其受體結(jié)合部位氨基酸序列較保守有關(guān) 28, 。 另外， 除了受體結(jié)合部位的氨基酸種類外， 其排列順序及其形成的空間構(gòu)型在決定 IL-2 的種屬特異 文獻綜述 性方面可能具有更重要的作用

29、 。 禽類由于進化過程中分離較早， 與哺乳動物的種間隔離較大， 因此哺乳動物的 IL-2 不作用于家禽 75 、 76 。 在 IL-2 體外誘生實驗中， 禽與哺乳動物細胞培養(yǎng)條件不同，細胞密度 、 培養(yǎng)時間 、 溫度 、 絲裂原的量都有不同 77 、 78 、 79 、 80 。 禽脾細胞加 ConA 和 2 同種雞血清誘導(dǎo) 20 hr 后，分泌類似人 IL-2 的因子，能使 ConA 活化的雞 T cell 生長，而未活化的則不能生長 。 8. 重組 IL-2 的研究 IL-2 是一種重要的細胞因子，參與機體多方面的生物性活動， 具有多種生物學(xué)功能 。 人醫(yī)臨床上發(fā)現(xiàn)， 許多自身免疫性疾病

30、 、 免疫缺陷病和腫瘤都與 IL-2 產(chǎn)生缺陷有關(guān)， 作為臨床用藥， IL-2 在多種疾病的治療上顯示出療效 。 在動物生產(chǎn)中， IL-2 被認為是一種理想的免疫增強劑和免疫治療劑 81 。 用動物的脾細胞或人外周血單個核細胞， 經(jīng)與絲裂原或同種異體抗原共同培養(yǎng)收獲細胞培養(yǎng)上清來獲得 IL-2 ， 產(chǎn)量十分有限， 使臨床應(yīng)用受到限制 。 近年來， 隨著基因工程重組技術(shù)的不斷發(fā)展， 使通過構(gòu)建重組 IL-2 表達質(zhì)粒來大量生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的重組 IL-2 成為可能 。 雖然 IL-2 是一種含糖基的多功能細胞因子，但實踐表明糖基化與否基本不影響 IL-2 的活性 82 。 IL-2 表達載體多

31、為質(zhì)粒 。 常用啟動子有 PL 、 PR 、 Trac 、 SV 40 早期啟動子等 。 表達體系有二類： 原核表達體系和真核表達體系， 前者主要是大腸桿菌， 后者包括酵母 、 哺乳動物細胞 、 昆蟲細胞和無翻譯體系等 。 11. IL-2 的應(yīng)用 在人和動物的細胞因子中，IL-2 是最先搞清楚分子結(jié)構(gòu) 、 受體組成和生物學(xué)性能的細胞因子，IL-2 研究一直居于細胞因子的最前沿， 其應(yīng)用也是研究得最廣泛的 124 。 在人醫(yī)上， IL-2 已在腫瘤 、 艾滋病 、 乙型肝炎等嚴重危害人類健康的疾病治療中發(fā)揮了中要作用 125 、 126 ； 在動物醫(yī)學(xué)上， 重組 IL-2 已在一些動物疾病的免

32、疫預(yù)防 、 免疫治療和構(gòu)建新一代基因工程苗等方面顯示出廣闊的應(yīng)用前景 124 、 126 。 在人醫(yī)上，研究結(jié)果表明： IL-2 具有廣譜免疫增強作用，能維持 Th 、 Tc 在體外長期存活和增殖，增強 Tc 的殺傷效應(yīng)，直接激活 B 細胞，提高 NK 細胞活性，目前在臨床應(yīng)用方面的研究已取得良好進展 127 。 王思勤等 128 應(yīng)用 IL-2 采用不同療法對不同肺癌積水患者進行了有關(guān)臨床觀察 。 結(jié)果表明 IL-2 對治療癌性胸水有效 。 IL-2 有明顯的抗腫瘤作用， 如黑色素瘤 、 腎細胞癌等 129 。 重組 IL-2 在一定濃度時，有抗乙型肝炎病毒的效果 130 。 目前對 IL-

33、2 在體內(nèi)的作用還不完全清楚， 但醫(yī)學(xué)和動物醫(yī)學(xué)的研究已經(jīng)證明， IL-2 的免疫增強作用至少體現(xiàn)在以下幾個方面： （ 1 ） 活化 T 細胞 131 ； （ 2 ） 促進 B 細胞的分化和分泌抗體 132 ；（ 3 ） 活化 NK 、 CTL 和 LAK 細胞 133 ；（ 4 ） 促進其它免疫調(diào)節(jié)因子的釋放，如 IFN- 、 IFN- 等 134 ； （ 5 ） 增強淋巴細胞和內(nèi)皮細胞表面黏附分子的表達， 促進淋巴細胞及其它活化細胞的粘附及移動能力 135 ； （ 6 ） 增加抗原提呈細胞表面 MHC 和類分子的量，增強抗原提呈作用 136 。 作為研究最多的細胞因子，人們試圖開發(fā) IL-

34、2 作為新的治療藥物，曾在許多動物模型中研究過 IL-2 的佐劑作用 137 。 對于某些抗原應(yīng)答能力差的動物，IL-2 可使其克服遺傳性免疫缺陷或?qū)Φ鞍踪|(zhì)抗原產(chǎn)生低水平應(yīng)答； 對于那些能夠發(fā)生免疫應(yīng)答的動物，IL-2 能夠增強免疫應(yīng)答， 同時也能降低雜種動物的應(yīng)答不穩(wěn)定性 。 李祥瑞等 138 試驗發(fā)現(xiàn)， 重組 IL-2 可以減輕 PRRS 感染所引起的免疫抑制， 提高豬瘟疫苗的免疫效果 。 和抗原一起在油水乳化的 IL-2 注射后能克服對肽抗原的 MHC-聯(lián)結(jié)的遺傳性無應(yīng) 答性 。 正常情況下， 對特定抗原不產(chǎn)生抗體應(yīng)答的小鼠， 用這種方法可誘導(dǎo)產(chǎn)生應(yīng)答 。 研究表明，IL-2 和疫苗一起

35、使用可有效提高免疫效果， 也有一定的治療作用，IL-2和抗生素一起使用， 可以增強抗生素的藥效 。 Weinberg 等 139 報道了 IL-2 對豚鼠生殖系統(tǒng)單純性皰疹病毒（HV） 反復(fù)感染的治療作用，發(fā)現(xiàn)反復(fù)使用 IL-2 可明顯降低復(fù)發(fā)率 。 隨即又證明， 將 IL-2 和 HV 粗提物或其糖蛋白 D（gD） 亞單位苗一起使用，攻毒后可使發(fā)病率由 63 100降低到 0 43 。 1989 年 Nanberg 等 140 報導(dǎo)，以 IL-2和狂犬病滅活苗一起使用，攻毒后，疫苗對試驗鼠的保護作用最少提高 25 倍 。 2002年李祥瑞等 141 報導(dǎo)， 使用 IL-2 配合抗生素， 可以

36、明顯提高豬鏈球菌的治療效果： 縮短療程 2 5 天，治愈率提高 50左右，停藥后不復(fù)發(fā) 。 當 IL-2 用于滅活疫苗和正常接種對象時，其免疫原性的增強，取決于給予抗原后的連續(xù)注射 。 IL-2 只有在一段較長時間內(nèi)釋放， 才能表現(xiàn)出良好的免疫效果， 其佐劑活性只有在每個時間段， 注射到一定劑量才會表現(xiàn)出來 142 、 143 、 144 。 根據(jù)這一結(jié)論設(shè)計了延長 IL-2 釋放時間的實驗方法 。 Singh-Hora 等報導(dǎo)將聚乙二醇（PEG） 修飾的IL-2 摻入生物降解微球中，使其緩慢釋放 。 摻入脂質(zhì)體的 IL-2 與疫苗混合注射，能增強對甲型流感的防御作用 。 關(guān)于 IL-2 作為

37、佐劑，其使用方法 、 劑量等是目前研究的熱點 145 。目前已有研究者通過基因重組將 IL-2 基因插入到缺失苗或活載體內(nèi)， 使之表達，這為 IL-2 作為佐劑使用提供了另一種思路， 也為構(gòu)建基因工程苗開辟了途徑 。 Ramshaw 146 等 、 Flexner 147 等先后報道，將小鼠或人 IL-2 基因與痘病毒重組后接種裸鼠，同時以含有 HA 基因以及含有 LacZ 基因的病毒為對照；對照組 9 天內(nèi) 9/10 死亡， 試驗組第 60 天仍無異常 。 該作者還比較了表達 IL-2 與缺失某些基因?qū)Χ徊《局氯踝饔玫膹娙酰?結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 缺失某些基因， 如 TK（thymidine kina

38、se） 基因與表達IL-2 均可致弱痘病毒， 但后者更有效； 作者還證明， 將 IL-2 和 HA 基因同時重組于痘病毒內(nèi)， 無論是在免疫缺陷的裸鼠內(nèi)還是正常鼠內(nèi)， 均不影響 HA 的免疫原性 。 可見，IL-2 不管是作為免疫佐劑 、 免疫治療劑還是用作構(gòu)建新型基因工程苗都有其廣闊的前景 。 關(guān)于 IL-2 的研究正呈現(xiàn)一個蓬勃發(fā)展的局面， 從 IL-2 的結(jié)構(gòu)到功能， 從其生物學(xué)活性的研究到應(yīng)用等都取得較大進展， 顯示出廣闊的應(yīng)用前景， 這也是我們研究的最終目的 。 從重組蛋白藥物到作為免疫佐劑， 從單獨使用到聯(lián)合使用再到構(gòu)建基因工程疫苗，都是目前研究的熱點 。 我們有理由相信，IL-2

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