重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點

1、1重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝與質(zhì)重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝與質(zhì)量控制要點量控制要點起草人/日期： . 批準人/日期： . 審核人/日期： . 文件編號： T09-SS10生效日期： 年 月 日版本號：01培訓目的及范圍培訓目的培訓目的1、熟悉生物制品一般生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制要點。2、了解檢驗項目設置緣由及控制標準。培訓范圍培訓范圍1、QC部2、QA部23蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)蛋白質(zhì)的基本性質(zhì)1、蛋白質(zhì)大?。ㄒ话?、蛋白質(zhì)大?。ㄒ话?-10nm）2、蛋白質(zhì)形狀、蛋白質(zhì)形狀3、蛋白質(zhì)核電性、蛋白質(zhì)核電性4、蛋白質(zhì)等電點（一般、蛋白質(zhì)等電點（一般4.0-10.0）5、蛋白質(zhì)疏水性、蛋白質(zhì)疏水性6、蛋白質(zhì)溶解度、蛋

2、白質(zhì)溶解度7、蛋白質(zhì)密度（一般、蛋白質(zhì)密度（一般1.3-1.4g/cm3）8、蛋白質(zhì)與配體結(jié)合能力（酶，抗體）、蛋白質(zhì)與配體結(jié)合能力（酶，抗體）9、蛋白質(zhì)與金屬螯合能力（、蛋白質(zhì)與金屬螯合能力（CU2+、ZN2+、CA2+、NI2+）10、蛋白質(zhì)其它特殊性質(zhì)、蛋白質(zhì)其它特殊性質(zhì)(抗熱性、抗蛋白酶抗熱性、抗蛋白酶)基本知識基本知識4第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點第三部分：第三部分： 注射用重組人胸腺肽注射用重組人胸腺肽1與注射用重組白與注射用重組白介素介素-2（125SER）生產(chǎn)工藝）生產(chǎn)工藝第四部

3、分：注射用重組人胸腺肽第四部分：注射用重組人胸腺肽1與注射用重組人與注射用重組人白介素白介素-2(125SER)質(zhì)量控制標準質(zhì)量控制標準培訓內(nèi)容培訓內(nèi)容第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第一部分：重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝第一步：工程菌構(gòu)建第二步：菌體發(fā)酵與誘導表達第三步：目標蛋白提取與純化第四步：配液與凍干5重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n第一步：工程菌構(gòu)第一步：工程菌構(gòu)6重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n目標產(chǎn)物鑒定目標產(chǎn)物鑒定n基因序列測定n表達產(chǎn)物結(jié)構(gòu)確證n特異性鑒別實驗nN末端氨基酸序列分析n氨基酸組成分析nC末端氨基酸序列分析n激光解析飛行時間質(zhì)譜分析nX射線晶體衍射分析7重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝

4、n原始菌種鑒定原始菌種鑒定n宿主菌鑒定（顯微鏡、電鏡檢查，生化反應，對抗生素抗性，質(zhì)粒檢查）n質(zhì)粒檢查-遺傳穩(wěn)定性n外源因子有：1、細菌檢查2、霉菌檢查3、支原體檢查4、噬菌體檢查8重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n第二步：菌第二步：菌體發(fā)酵與誘體發(fā)酵與誘導表達導表達9重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝10n第三步：目標蛋白分離與破碎第三步：目標蛋白分離與破碎重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝11n第三步：目標蛋白分離與破碎第三步：目標蛋白分離與破碎重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n第三步：目標蛋第三步：目標蛋白純化白純化12重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝13n第三步：目標蛋白純化（反相與超濾）第三步：目標蛋白純化（反相與超濾）重組蛋

5、白藥物一般生產(chǎn)工藝n蛋白純化方法蛋白純化方法14分離方法分離方法蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎分離方法分離方法蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎蛋白質(zhì)性質(zhì)基礎沉淀法層析法 硫酸銨溶解度 離心交換層析電荷及分布 丙酮溶解度 疏水作用層析疏水性 聚乙烯亞胺電荷、大小 反相層析疏水性、大小 等電點溶解度、等電點 親和層析配體結(jié)合雙水相法溶解度 外源凝集素親和層析糖基內(nèi)容與種類電泳法 凝膠電泳電荷、大小、形狀 金屬親和層析金屬螯合能力 等點聚焦電泳等電點 免疫親和層析特異抗原位點離心法大小、形狀、密度 層析聚焦等電點超律法大小、形狀 凝膠過濾層析大小、形狀重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n蛋白純化原理蛋白純化原理n親和層析n離子交

6、換層析n疏水層析n凝膠過濾層析n反相層析15重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n帶組氨酸標簽的親和層析帶組氨酸標簽的親和層析 組氨酸是具有雜環(huán)的氨基酸，每個組氨基酸含有一個咪唑基團，這個化學結(jié)構(gòu)帶有很多額外電子，對于帶正電的化學物質(zhì)有靜電引力，親和層析是利用這個原理來進行吸附的，親和配體（也就是填料）上的陽離子（一般是鎳離子）帶正電對組氨酸有親和作用。組氨酸標簽是原核表達載體上6-14個組氨酸的區(qū)段,這個標簽在PH8.0時不帶電,且無免疫原性,對蛋白質(zhì)的分泌,折疊,功能基本上無影響.能高度親和鎳離子,用于蛋白質(zhì)的親和純化16重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n第四步：配液與凍干第四步：配液與凍干n生物制品藥用輔料

7、按使用目的，分為：n疫苗培養(yǎng)液n生物制品穩(wěn)定保護劑（人血白蛋白，糖類）n免疫佐劑（鋁鹽，植物油類）n防腐劑(硫柳汞與苯酚)n脫毒劑與滅活劑（甲醛溶液與b-丙內(nèi)酯）n冷凍干燥保護劑（鹽類，糖類，醇類）17重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n凍干過程凍干過程n預凍干n一次升華n二次升華18重組蛋白藥物一般生產(chǎn)工藝n典型凍干曲線典型凍干曲線19第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點第二部分：重組蛋白藥物質(zhì)控要點原輔料、包材、菌種發(fā)酵液、原液半成品、成品20重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原輔料原輔料-符合藥典和生物制品主要原輔料質(zhì)控標準等符合藥典和生物制品主要原輔料質(zhì)控標準等-略略n包材包材-符國家藥品包裝容器（材料）標準符國

8、家藥品包裝容器（材料）標準-略略n菌種菌種-符合藥典或注冊要求符合藥典或注冊要求n發(fā)酵液發(fā)酵液-符合藥典或注冊要求符合藥典或注冊要求n原液原液-符合藥典或注冊要求符合藥典或注冊要求n半成品半成品-符合藥典或注冊要求符合藥典或注冊要求n成品成品-符合藥典或注冊要求符合藥典或注冊要求21重組蛋白藥物質(zhì)控要點n菌種：一般檢測項目菌種：一般檢測項目22中間體名稱質(zhì)量標準檢測項目合格標準菌種劃種LB平板應呈典型大腸桿菌集落形態(tài)，無其他雜菌生長染色鏡檢應為典型的革蘭陰性桿菌對抗生素抗性應與原始菌種相符電鏡檢查應為典型大腸桿菌形態(tài)，無支原體、病毒樣顆粒及其他微生物污染生化反應應符合大腸桿菌生物學性狀表達量在

9、搖床中培養(yǎng)，應不低于原始菌種表達量質(zhì)粒檢查質(zhì)粒酶切圖譜應與原始重組質(zhì)粒相符目的基因核苷酸序列檢查符合規(guī)定質(zhì)粒穩(wěn)定性符合規(guī)定質(zhì)粒檢查質(zhì)粒酶切圖譜應與原始重組質(zhì)粒相符重組蛋白藥物質(zhì)控要點n發(fā)酵液：一般檢測項目發(fā)酵液：一般檢測項目23中間體名稱現(xiàn)質(zhì)量標準檢測項目合格標準發(fā)酵菌體表達量25%質(zhì)粒丟失率檢查符合規(guī)定重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：一般檢測項目原液：一般檢測項目241生物學活性（有效項目）2蛋白含量（有效項目）3比活測定（有效項目）4純度測定（有效項目）5分子量（鑒別項目）6紫外吸收光譜（鑒別項目）7肽圖（鑒別項目）8等電點（鑒別項目）9N-末端氨基酸序列測定（鑒別項目）10外源性DNA含量（

10、安全項目）11宿主菌蛋白殘留量（安全項目）12圓二色譜分析（鑒別項目）12細菌內(nèi)毒素（安全項目）重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：生物學活性檢測原液：生物學活性檢測n生物學活性測定是保證基因工程藥物產(chǎn)品有效性的重要手段。參照中國藥典標準中的規(guī)定及注冊質(zhì)量研究資料，采用脫E受體法或MTT比色法檢出本品，專屬性強、方法可靠。25重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：蛋白含量檢測原液：蛋白含量檢測n在質(zhì)量標準中設定此項目主要用于原液比活性計算和成品規(guī)格的控制。目前實際應用最多的是(Lowry)法，也稱之為福林一酚試劑法，其靈敏度比雙縮脲法高約100倍，比紫外吸收法高約102O倍，是蛋白質(zhì)量化的較可靠方法，具體操作可

11、按照中國藥典2010年版三部(附錄第二法)的規(guī)定。參照中國藥典三部的標準的規(guī)定及本品質(zhì)量研究資料，此方法能夠檢出本品，專屬性強、方法可靠，能夠控制本品含量。如不適用此類方法則采用液相法。26重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：比活測定檢測原液：比活測定檢測n比活性是指單位重量蛋白的活性，反應單位蛋白活性的高低。是活性生物制品的重要指標和檢測依據(jù)。27重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：純度檢測原液：純度檢測n根據(jù)人用重組DNA產(chǎn)品質(zhì)量控制技術(shù)指導原則有關要求，應用至少兩種不同原理的方法進行純度分析，且純度均不得低于95.0，才能判為合格。因胸腺肽a1與白介素-2（125Ser）在臨床上使用劑量在毫克級，故純度

12、要求應較嚴格。n高效液相法本檢測采用protein C18反相色譜柱，可精確地測定產(chǎn)品的純度，及對空間構(gòu)相作初步分析。一般盡量采用與SDSPAGE法原理不同的RPHPLC或其它離子交換HPLC法進行分析，而不采用SECHPLC進行分析。n電泳法用SDSPAGE法分析，可將不同分子量的蛋白質(zhì)分開，從而測定蛋白質(zhì)的純度，通過凝膠掃描儀掃描進行純度分析。樣品在凝膠電泳上顯現(xiàn)出條區(qū)帶，說明樣品在該電泳條件分子量是一致的，為分析是否存在相同分子量的雜蛋白，還應選擇另一種方法進行純度分析。28重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：分子量檢測原液：分子量檢測n分子量是蛋白質(zhì)理化性質(zhì)之一。一般采用還原型SDS-PAGE

13、法測定，蛋白質(zhì)在SDS和B-巰基乙醇存在下沸水浴5min，形成表面帶大量負電荷的桿狀分子，降低了分子形態(tài)和電荷的影響，在電泳過程中蛋白遷移率基本只與其分子量相關，目前廣泛用于蛋白分子量的測定。該法具有簡便，快速，直觀等特點，目前作為基因工程藥物原液檢定的常規(guī)方法。該法可將蛋白質(zhì)按分子量大小進行分離，因此，可用于蛋白質(zhì)純度分析，同時還能對聚合體進行分析。29重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：紫外光譜掃描檢測原液：紫外光譜掃描檢測n這是基因工程藥物的一個重要物理常數(shù)，對于一個蛋白質(zhì)來說，它的最大吸收波長是固定的。對某一重組蛋白質(zhì)來說，其最大吸收波長是固定的；在生產(chǎn)過程中每批產(chǎn)品的紫外吸收光譜應當是一致的

14、。測定時以生理鹽水為對照，在200350 nm范圍內(nèi)對待檢樣品溶液進行掃描，每批制品紫外吸收圖譜應與對照品一致且在280nm附近最大吸收波長應與理論值相符。30重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：肽圖檢測原液：肽圖檢測n肽圖分析是DNA產(chǎn)品質(zhì)控的重要手段之一。通過肽圖分析，可從一級結(jié)構(gòu)研究重組產(chǎn)品與天然品的同質(zhì)性。重組產(chǎn)品與天然產(chǎn)品具有相同的指紋圖譜，它們具有相同的一級結(jié)構(gòu)。進一步驗證了它們的同質(zhì)性。n大多基因工程產(chǎn)品都將肽圖分析作為控制其一致性的重要常規(guī)指標之一，而采用的方法中又以HPLC肽圖分析最為多見。肽圖譜對每一種蛋白質(zhì)來說是特征和專一的。因此可用于檢查各批產(chǎn)品蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的一致性在膚圖分析

15、中的應用基因重組藥物的肽圖分析是評價基因重組制品和天然蛋白質(zhì)的同一性以及不同批制品間同一性的重要手段，也是證明細胞遺傳穩(wěn)定性的有效手段之一。31重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：等電點檢測原液：等電點檢測n不同蛋白質(zhì)由于某些帶電氨基酸帶負電荷的Glu，Asp和帶正電荷的Lys，Arg,His等的存在，其凈電荷各不相同，即等電點各不相同。均一的蛋白質(zhì)只有一個等電點，有時因加工修飾等影響可出現(xiàn)多個等電點，但應有一定的范圍。所以等電點測定是控制重組產(chǎn)品生產(chǎn)工藝穩(wěn)定性的重要指標。32重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：原液： N-末端氨基酸序列測定末端氨基酸序列測定n可以確證表達產(chǎn)物的編碼準確性。對蛋白質(zhì)的全氨基酸

16、序列分析，難度大，耗時長，從統(tǒng)計學觀點只要測定N-末端15個氨基酸便可保證其順序的正確性。故N-末端15個氨基酸序列分析可作為重組蛋白質(zhì)的重要鑒別指標。 33重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：外源性原液：外源性DNA含量檢測含量檢測n宿主細胞DNA只作為一種細胞污染因素而不作為一種危險因素。目前均采用DNA雜交實驗，用固相斑點雜交法，以地高辛標記檢測試劑盒或者用同位素標記DNA探針進行測定，必須提供相應宿主細胞DNA標準品。由于設備和消耗試劑昂貴，一定程度限制了該方法的普及。n由于基因工程藥物的生產(chǎn)過程中所使用的各種表達系統(tǒng)中都含有大量的DNA。因此世界各國的藥品管理機構(gòu)都對基因工程藥物中所允許的D

17、NA殘余量嚴加限定。WHO和FDA將此限量定在100pg劑量。參照藥典三部附錄IX B外源性DNA殘留量測定法每1次人用劑量應不高于10ng。34重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：宿主菌蛋白殘留量檢測原液：宿主菌蛋白殘留量檢測n如在臨床使用中需要反復多次注射的藥品，則需要做殘余菌體蛋白含量測定，所用方法以雙抗體夾心ELISA為宜，盡量不用點免疫。因為用點免疫測菌體蛋白含量，實驗結(jié)果不客觀，主要是因為檢品和菌體蛋白標準難以在同等條件下進行直接點膜，當檢品濃度較高時，在硝酸纖維膜上形成一定厚度的樣品模塊，影響了菌體蛋白與膜的結(jié)合，導致測定結(jié)果偏低。n不同表達體系對菌體蛋白含量標準不同，如來自大腸桿菌的產(chǎn)

18、品為不大于01 ；來自CHO細胞表達產(chǎn)品為不大于005。本檢品中宿主蛋白含量應不高于總蛋白的0.1%。35重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：圓二色譜分析原液：圓二色譜分析n對R和L兩種圓偏振光吸收程度不同的現(xiàn)象，這種吸收程度的不同與波長的關系稱圓二色譜，是測定分子不對稱結(jié)構(gòu)的光譜法。n用于測定蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)，核酸和多糖的立體結(jié)構(gòu)。n在蛋白質(zhì)分子中，肽鏈可形成-螺旋、-折疊、-轉(zhuǎn)角等特定的立體結(jié)構(gòu)。這些立體結(jié)構(gòu)都是不對稱的。36重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：圓二色譜檢測原液：圓二色譜檢測n蛋白質(zhì)的肽鍵在紫外185240納米處有光吸收，因此它在這一波長范圍內(nèi)有圓二色性。幾種不同的蛋白質(zhì)立體結(jié)構(gòu)所表現(xiàn)的橢

19、圓值波長的變化曲線圓二色譜是不同的。-螺旋的譜是雙負峰形的，-折疊是單負峰形的，無規(guī)卷曲在波長很短的地方出單峰。蛋白質(zhì)的圓二色譜是它們所含各種立體結(jié)構(gòu)組分的圓二色譜的代數(shù)加和曲線。因此用這一波長范圍的圓二色譜可研究蛋白質(zhì)中各種立體結(jié)構(gòu)的含量。蛋白質(zhì)含酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸,它們在240350納米處有光吸收,當它們處于分子不對稱環(huán)境中時也表現(xiàn)出圓二色性。這一范圍的圓二色性反映出在蛋白質(zhì)分子中上述氨基酸殘基環(huán)境的性質(zhì)。37重組蛋白藥物質(zhì)控要點n原液：細菌內(nèi)毒素檢測原液：細菌內(nèi)毒素檢測n細菌內(nèi)毒素是革蘭氏陰性菌的細胞壁成分,當細菌死亡或自溶后便會釋放出內(nèi)毒素.因此,細菌內(nèi)毒素廣泛存在于自然界中.當

20、內(nèi)毒素通過消化道進入人體時并不產(chǎn)生危害,但內(nèi)毒素通過注射等方式進入血液時則會引起不同的疾病.內(nèi)毒素小量入血后被肝臟細胞滅活,不造成機體損害.內(nèi)毒素大量進入血液就會引起發(fā)熱反應“熱原反應”.因此,生物制品類,注射用藥劑,化學藥品類,放射性藥物,抗生素類,疫苗類,透析液等制劑以及醫(yī)療器材類（如一次性注射器,植入性生物材料）必須經(jīng)過細菌內(nèi)毒素檢測試驗合格后才能使用。按照藥典三部注射劑通則，需要檢測細菌內(nèi)毒素的含量，采用鱟試劑法。由于鱟試劑法簡單快速靈敏準確,目前已廣泛用于臨床,制藥工業(yè)藥品檢驗等方面。38重組蛋白藥物質(zhì)控要點n半成品：一般檢測項目半成品：一般檢測項目n可見異物（安全項目）n無菌檢查（

21、安全項目）n細菌內(nèi)毒素（安全項目）39重組蛋白藥物質(zhì)控要點n半成品：可見異物檢測半成品：可見異物檢測n“可見異物”是指目視可以觀測到的玻璃屑、金屬屑、長度或最大粒徑超過2mm的纖毛和塊狀物等外來異物?！捌渌梢姰愇铩眲t是指長度或最大粒徑在2mm以下的短纖毛及白點、白塊等。這些物質(zhì)進入人體靜脈能夠堵塞血管，形成血栓。危害人體健康。按照藥典三部的注射劑通則要求，檢查可見異物，并符合規(guī)定。注射劑，滴眼劑應在符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范的條件下生產(chǎn)，產(chǎn)品在出廠前應采用適宜的方法逐一檢查并同時剔除不合格產(chǎn)品。40重組蛋白藥物質(zhì)控要點n半成品：無菌檢查半成品：無菌檢查n無菌檢查法系用于確定要求無菌的生物制品，原料

22、，輔料及要求無菌的其他品種是否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢查法的規(guī)定，僅表明供試品在該檢驗條件下未發(fā)現(xiàn)微生物污染。本法參照藥典三部的無菌檢查法，應符合規(guī)定。n半成品：細菌內(nèi)毒素半成品：細菌內(nèi)毒素n略41重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：一般檢測項目成品：一般檢測項目42檢測項檢測項1、鑒別試驗（鑒別項目）7、水分測定（安全項目）13、I誘導物殘留量檢查（安全項目）2、外觀（安全項目）8、活性測定（有效項目）14、有機溶劑殘留量檢查（安全項目）3、復溶時間（安全項目）9、含量檢查（有效項目）15、抗生素殘留量檢查（安全項目）4、可見異物（安全項目）10、無菌檢查（安全項目）16、異常毒性檢查（安

23、全項目）5、裝量差異（有效項目11、細菌內(nèi)毒素檢查（安全項目）17、滲透壓摩爾濃度檢查（安全項目）6、PH值（安全項目）12、HBsAg檢查（安全項目）18、不溶性微粒檢查（安全項目）重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：鑒別實驗成品：鑒別實驗n主要確定供試品的抗原性，根據(jù)抗原抗體特異性反應建立的方法。將供試品通過電泳分離成區(qū)帶的各抗原，然后與相應的抗體進行雙相免疫擴散，當兩者比例合適時形成可見的沉淀弧。將沉淀弧與已知標準抗原，抗體生成的沉淀弧的位置和形狀進行比較。分析供試品中成分及其性質(zhì)。43重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：外觀成品：外觀n因質(zhì)量研究本制品凍干樣品為白色無雜色的疏松體，所以成品檢驗質(zhì)量標準

24、為白色或微黃色疏松體。n成品：復溶時間成品：復溶時間n檢查法：按標示量加入2025滅菌注射用水，輕松搖動，應于15秒內(nèi)完全溶解。應與質(zhì)量標準一致。44重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：可見異物成品：可見異物n“可見異物”是指目視可以觀測到的玻璃屑、金屬屑、長度或最大粒徑超過2mm的纖毛和塊狀物等外來異物?！捌渌梢姰愇铩眲t是指長度或最大粒徑在2mm以下的短纖毛及白點、白塊等。這些物質(zhì)進入人體靜脈能夠堵塞血管，形成血栓。危害人體健康。按照藥典三部的注射劑通則要求，檢查可見異物，并符合規(guī)定。注射劑，滴眼劑應在符合藥品生產(chǎn)管理規(guī)范的條件下生產(chǎn)，產(chǎn)品在出廠前應采用適宜的方法逐一檢查并同時剔除不合格產(chǎn)品。45

25、重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：裝量差異成品：裝量差異n按照藥典三部的注射劑通則要求進行裝量差異檢查。除制劑通則中規(guī)定檢查重量差異的制劑及放射性藥品外，按上述方法檢查，應符合規(guī)定。n成品：成品：pH值值n根據(jù)質(zhì)量研究資料，胸腺肽a1在PH6.3-7.8條件下穩(wěn)定，規(guī)定本品酸堿度為6.3-7.8,白介素-2（125Ser）在PH6.5-7.5質(zhì)檢性質(zhì)穩(wěn)定。46重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：水分測定成品：水分測定n水分檢測主要指對凍干制劑的要求，是重要的質(zhì)量和經(jīng)濟指標之一，在一般情況下要控制水分低一點，防止微生物生長，但是并非水分越低越好。通常微生物作用比生化作用更加強烈。目前美國藥典和歐洲藥典公認的標

26、準為不超過3.0% ，所用的方法有費休氏法。n成品：活性測定成品：活性測定n略n成品：含量測定成品：含量測定n略n成品：無菌檢查成品：無菌檢查n略47重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：細菌內(nèi)毒素檢查成品：細菌內(nèi)毒素檢查n略n成品：成品：HBsAg檢查檢查n乙肝表面抗原（HBsAg）是乙肝病毒的外殼蛋白，本身不具有傳染性，但它的出現(xiàn)常伴隨乙肝病毒的存在，所以它是已感染乙肝病毒的標志。檢查HbsAg的目的是為了控制乙肝表面抗原蛋白在制品中的含量。采用ELISA雙抗體夾心法，即酶聯(lián)免疫吸附法，包被HBsAb于瓊脂微孔與標本中的HBsAg形成Ab-Ag復合物，再于酶標HBs抗體結(jié)合，加入TMB底物產(chǎn)生顯色反

27、應。48重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：誘導物殘留量檢查成品：誘導物殘留量檢查nIPTG作為大腸桿菌和哺乳動物細胞等的表達誘導劑，一般以1mM左右的濃度加入液體培養(yǎng)基中。在本工藝中使用了IPTG作為誘導劑，在培養(yǎng)液中的終濃度為0.5-1mM。發(fā)酵完畢后，經(jīng)過菌液離心分離、包含體分離、凝膠過濾、反相層析、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)等多步純化，可以有效地去除IPTG殘留，故IPTG殘留量甚微。Liu HS 等人的研究也表明，IPTG在一定的濃度范圍內(nèi)（5mM），對細胞是沒有毒性的。而5mM 的IPTG濃度是生物制品IPTG殘留檢測值（極限值以下）濃度的四百萬倍。49重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：有機溶劑殘留量檢查成品：有

28、機溶劑殘留量檢查n在原料、輔料、制劑制備過程中未能完全除去的有機溶劑。按照與ICH殘留溶劑指導原則與HGPH7-1化學藥物殘留溶劑研究的指導原則為依據(jù)制定藥典標準n第一類：避免使用n第二類：限制使用n第三類：GMP或其它質(zhì)量要求限制使用n第四類：尚無足夠毒理資料的溶劑50重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：抗生素殘留量檢查成品：抗生素殘留量檢查n抗生素的濫用已經(jīng)引起大量的耐藥菌株的出現(xiàn)，嚴重威脅了人類健康。在生物制品中應嚴格規(guī)定抗生素的含量。本工藝需在種子制備和發(fā)酵過程中使用抗生素，故需要在成品中檢測抗生素的殘留。按照藥典三部的抗生素殘留量檢查方法應為陰性。n成品：異常毒性檢查成品：異常毒性檢查n主要

29、檢查目標產(chǎn)物以外的有毒物質(zhì).目的是通過動物試驗檢查制品中外源性毒性物質(zhì)的污染情況以及是否存在意外的不安全因素，以保證人體使用安全。51重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：滲透壓摩爾濃度檢查成品：滲透壓摩爾濃度檢查n生物膜具有半透性，在涉及溶質(zhì)的擴散和轉(zhuǎn)運過程中，滲透壓起著重要作用。因此在制備注射劑和眼用制劑時，必需關注其滲透壓。正常人體血液的滲透壓摩爾濃度范圍為285-310mOsmol/kg,0.9氯化鈉溶液和5%葡萄糖溶液的滲透壓摩爾濃度與人體血液相當。52重組蛋白藥物質(zhì)控要點n成品：不溶性微粒檢查成品：不溶性微粒檢查n藥典標準（注射用無菌粉末）：每容器（份） 10um微粒不過6000粒， 25u

30、m微粒不得過600粒。n不溶性微粒進入人體會血栓，熱原反應，器官病理，肉芽，血液凝結(jié)，變態(tài)反應，即使微粒直徑712m，即使檢驗符合的注射劑中的異物 ，一旦進入極細的血管中可立即引起阻塞 ，造成損傷或壞死。53第三部分：注射用重組人胸腺肽第三部分：注射用重組人胸腺肽11與注射與注射用重組人白介素用重組人白介素-2-2（125SER125SER）生產(chǎn)工藝）生產(chǎn)工藝注射用重組人胸腺肽1生產(chǎn)工藝注射用重組人白介素-2（125Ser）生產(chǎn)工藝注射用重組人胸腺肽1與注射用重組人白介素-2生產(chǎn)工藝對比54注射用重組人T1與白介素-2生產(chǎn)工藝n注射用重組人胸腺肽注射用重組人胸腺肽1生產(chǎn)工藝生產(chǎn)工藝55注射用重

31、組人T1與白介素-2生產(chǎn)工藝56n注射用重組人白介素注射用重組人白介素-2生產(chǎn)工藝生產(chǎn)工藝注射用重組人T1與白介素-2生產(chǎn)工藝n注射用重組人注射用重組人T1與白介素與白介素-2生產(chǎn)工藝對比生產(chǎn)工藝對比57序號序號胸腺肽胸腺肽1白介素白介素-2(125Ser)1大腸桿菌表達體系（BL21(DE3) / pTRX-T1）大腸桿菌表達體系（PBV220/125Ser-IL-2/DH5）2重組質(zhì)粒表達（pTRX-T1）重組質(zhì)粒表達（PBV220/125Ser-IL-2）3高密度發(fā)酵（胞內(nèi)表達）低密度發(fā)酵（包涵體表達）4機械破碎超聲破碎5親和層析包涵體變性6超濾與酶切凝膠過濾（分子篩）7親和層析凝膠過濾（脫鹽）8凝膠過濾氧化復性9反相層析反相層析10凝膠過濾旋蒸第四部分：注射用重組人胸腺肽第四部分：注射用重組人胸腺肽11與注射與注射用重組人白介素用重組人白介素-2(125SER)-2(125SER)質(zhì)量控制標準質(zhì)量控制標準注射用重組人胸腺肽1質(zhì)量控制標準注射用重組人白介素-2(125SER)質(zhì)量控制標準58注射用重組人T1與125Ser質(zhì)控標準59n注射用重組人胸腺肽注射用重組人胸腺肽1的質(zhì)量控制標準的質(zhì)量控制標準成品名稱質(zhì)量標準檢測項目