土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

1、一一. .研究思路研究思路. .篩選菌株：篩選菌株： 實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：實(shí)驗(yàn)室中微生物的篩選原理：人為提供有人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件利于目的菌株生長(zhǎng)的條件( (包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pHpH等等) )，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的要分離一種微生物，必須根據(jù)該微生物的特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選特點(diǎn)，包括營(yíng)養(yǎng)、生理、生長(zhǎng)條件等，采用選擇培養(yǎng)分離的方法，或抑制使大多數(shù)微生物不擇培養(yǎng)分離的方法，或抑制使大多數(shù)微生物不能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，經(jīng)過(guò)能生長(zhǎng)，或造成有利于該菌生長(zhǎng)的環(huán)境，

2、經(jīng)過(guò)一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，一定時(shí)間培養(yǎng)后使該菌在群落中的數(shù)量上升，再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。再通過(guò)平板稀釋等方法對(duì)它進(jìn)行純培養(yǎng)分離。. .統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目：1.1.直接計(jì)數(shù)法：直接計(jì)數(shù)法：這種方法是利用特定這種方法是利用特定細(xì)菌計(jì)數(shù)板或細(xì)菌計(jì)數(shù)板或血細(xì)胞計(jì)數(shù)板血細(xì)胞計(jì)數(shù)板，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微，在顯微鏡下計(jì)算一定容積里樣品中微生物的數(shù)量。生物的數(shù)量。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌。此法的缺點(diǎn)是不能區(qū)分死菌和活菌。 除上述兩種常用的計(jì)數(shù)方法外，還有除上述兩種常用的計(jì)數(shù)方法外，還有膜過(guò)膜過(guò)濾法、比濁法濾法、比濁法。膜過(guò)濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低。膜

3、過(guò)濾法是當(dāng)樣品中菌數(shù)很低時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等時(shí)，可以將一定體積的湖水、海水或飲用水等樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后將濾膜干燥、染色，樣品通過(guò)膜過(guò)濾器。然后將濾膜干燥、染色，并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上并經(jīng)處理使膜透明，再在顯微鏡下計(jì)算膜上( (或或一定面積中一定面積中) )的細(xì)菌數(shù)；比濁法原理是在一定范的細(xì)菌數(shù)；比濁法原理是在一定范圍內(nèi)，菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，圍內(nèi)，菌的懸液中細(xì)胞濃度與混濁度成正比，即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因即與光密度成正比，菌越多，光密度越大。因此可以借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)此可以借助于分光光度計(jì)，在一定波長(zhǎng)下，測(cè)定菌

4、懸液的光密度，以光密度表示菌量。實(shí)驗(yàn)定菌懸液的光密度，以光密度表示菌量。實(shí)驗(yàn)測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的測(cè)量時(shí)一定要控制在菌濃度與光密度成正比的線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)線性范圍內(nèi)，否則不準(zhǔn)確。微生物計(jì)數(shù)法，發(fā)展迅速，現(xiàn)有多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化展迅速，現(xiàn)有多種多樣的快速、簡(jiǎn)易、自動(dòng)化的儀器和裝置等方法。的儀器和裝置等方法。 P22P22旁欄思考題旁欄思考題想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中想一想，如何從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)？的菌落數(shù)？答：答：統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)統(tǒng)計(jì)某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計(jì)計(jì)3 3個(gè)平

5、板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課個(gè)平板，計(jì)算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。本旁欄的公式進(jìn)行計(jì)算。 P23P23討論問(wèn)題討論問(wèn)題 A A同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解同學(xué)的結(jié)果與其他同學(xué)不同，可能的解釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培釋有兩種。一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個(gè)原因，可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。以通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種實(shí)驗(yàn)方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與方案是可以由其他同學(xué)用與A A同學(xué)一樣的土樣同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與如果結(jié)果與A A同學(xué)一致，則證

6、明同學(xué)一致，則證明A A無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明無(wú)誤；如果結(jié)果不同，則證明A A同學(xué)存在操作同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題。另一種方案是另一種方案是將將A A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，行培養(yǎng)，作為空白對(duì)照，以證明培養(yǎng)基是否以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)受到污染。通過(guò)這個(gè)事例可以看出，實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。果要有說(shuō)服力，對(duì)照的設(shè)置是必不可少的。二二. .實(shí)驗(yàn)的具體操作實(shí)驗(yàn)的具體操作 . .土壤取樣土壤取樣 從肥沃、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層從肥沃、

7、濕潤(rùn)的土壤中取樣。先鏟去表層土土3cm3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中。信封中。取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌。前都要滅菌。. .制備培養(yǎng)基：制備培養(yǎng)基：制備以尿素為唯一氮源的制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基選擇培養(yǎng)基。應(yīng)在火焰旁稱取土壤應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g10g。將稱好的土樣倒入盛有。將稱好的土樣倒入盛有90mL90mL無(wú)菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。無(wú)菌水的錐形瓶中，塞好棉塞。在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。在稀釋土壤溶液的過(guò)程中，每一步都要在火焰旁進(jìn)行。分離不同的微

8、生物采用不同的稀釋度分離不同的微生物采用不同的稀釋度，其原因是不，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落同微生物在土壤中含量不同，其目的是保證獲得菌落數(shù)在數(shù)在3030300300之間、適于計(jì)數(shù)的平板。之間、適于計(jì)數(shù)的平板。細(xì)菌稀釋度為細(xì)菌稀釋度為10104 4、10105 5、10106 6，放線菌稀釋度為，放線菌稀釋度為10103 3、10104 4、10105 5，真菌稀釋度，真菌稀釋度為為10102 2、10103 3、10104 4。P24P24旁欄思考題：旁欄思考題： 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量

9、和測(cè)定土壤中能釋度？測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？嗎？答：答：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：這是因?yàn)橥寥乐懈黝愇⑸锏臄?shù)量（單位：株株/kg/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為樣本中：好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為21852185萬(wàn)，萬(wàn)，放線菌數(shù)約為放線菌數(shù)約為477477萬(wàn)，霉菌數(shù)約為萬(wàn)，霉菌數(shù)約為23.123.1萬(wàn)。因萬(wàn)。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有

10、針對(duì)性地提的稀釋度進(jìn)行分離，同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件。供選擇培養(yǎng)的條件。實(shí)驗(yàn)時(shí)實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)皿作好標(biāo)記。注明記。注明培養(yǎng)基類培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)型、培養(yǎng)時(shí)間、稀時(shí)間、稀釋度、培釋度、培養(yǎng)物等。養(yǎng)物等。 在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔在菌落計(jì)數(shù)時(shí)，每隔24h24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目。選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果，以防止以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。為了提高效率，在操作時(shí)更加有條不紊，應(yīng)為了提高效率，在操作時(shí)更加有條不紊，應(yīng)當(dāng)事先規(guī)劃時(shí)間。當(dāng)事先規(guī)劃時(shí)間。 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同

11、培養(yǎng)溫度。培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度。細(xì)菌一般在細(xì)菌一般在30303737培養(yǎng)培養(yǎng)1 12d2d，放線菌一般在，放線菌一般在25252828培養(yǎng)培養(yǎng)5 57d7d，霉菌一般在，霉菌一般在25252828的溫的溫度下培養(yǎng)度下培養(yǎng)3 34d4d。思考與討論思考與討論在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，為什么每隔在微生物培養(yǎng)過(guò)程中，為什么每隔24h24h統(tǒng)計(jì)一統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目？菌種鑒定的依據(jù)是什么？次菌落數(shù)目？菌種鑒定的依據(jù)是什么？答：答：不同種類的微生物，往往需不同的培養(yǎng)溫不同種類的微生物，往往需不同的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間，每隔度和培養(yǎng)時(shí)間，每隔24h24h統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì)1 1次菌落數(shù)目，選次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)

12、目穩(wěn)定時(shí)記錄作為結(jié)果，這樣可以防取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)記錄作為結(jié)果，這樣可以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。不止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目。不同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光同種類的細(xì)菌形成的菌落，在大小、形狀、光澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的澤度、顏色、硬度、透明度等方面具有一度的特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。特征，菌落特征可作為菌種鑒定的重要依據(jù)。1.1.對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（對(duì)細(xì)菌群體生長(zhǎng)規(guī)律測(cè)定的正確的表述是（ ） A.A.在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行在液體培養(yǎng)基上進(jìn)行 B.B.至少接種一種細(xì)菌至少接種一種細(xì)菌 C.C.接種一個(gè)細(xì)菌接種一個(gè)細(xì)

13、菌 D.D.及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)及時(shí)補(bǔ)充消耗的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 2.2.使用選擇培養(yǎng)基的目的是（使用選擇培養(yǎng)基的目的是（ ） A.A.培養(yǎng)細(xì)菌培養(yǎng)細(xì)菌 B.B.培養(yǎng)真菌培養(yǎng)真菌 C.C.使需要的微生物大量繁殖使需要的微生物大量繁殖 D.D.表現(xiàn)某微生物的特定性狀，與其他微生物加以區(qū)表現(xiàn)某微生物的特定性狀，與其他微生物加以區(qū)別別3.3.能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是能合成脲酶的微生物所需要的碳源和氮源分別是( )( ) A.CO A.CO2 2和和N N2 2 B. B.葡萄糖和葡萄糖和NHNH3 3 C.COC.CO2 2和尿素和尿素 D.D.葡萄糖和尿素葡萄糖和尿素A AC CD D4.4.下列說(shuō)法不正確的是（下列說(shuō)法不正確的是（ ） A.A.科學(xué)家從科學(xué)家從70708080度熱泉中分離到耐高溫的度熱泉中分離到耐高溫的TaqDNATaqDNA聚聚合酶合酶 B.B.統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的統(tǒng)計(jì)某一稀釋度的5 5個(gè)平板的菌落數(shù)依次為個(gè)平板的菌落數(shù)依次為M1M1、M2M2、M3M3、M4M4、M5M5，以，以M3M3作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值作為該樣品菌落數(shù)的估計(jì)值 C.C.設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)