SSR分子標(biāo)記在雜交稻種子純度精確鑒定中的應(yīng)用分析

1、 郭承亮，男，(1982-)，湖北黃岡人，碩士研究生，畢業(yè)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，現(xiàn)主要從事種子質(zhì)量檢測和分子標(biāo)記輔助育種等研究。E-mail：51097143。SSR分子標(biāo)記在雜交稻種子純度精確鑒定中的應(yīng)用郭承亮 (湖北省種子集團有限公司 武漢 430602）摘要：傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植純度鑒定方法由于時間滯后不能滿足種子企業(yè)的需求，而現(xiàn)有的SSR標(biāo)記檢測雜交水稻種子純度的方法，雖能有效鑒定出雜交種的父、母本，但不能將一些混雜的雜株、串粉所致的雜交種區(qū)分開，也無法滿足種子企業(yè)的全面質(zhì)量信息需求。本文結(jié)合自身工作實踐，介紹了一種利用篩選的多對SSR分子標(biāo)記深入檢測雜交水稻種子純度及開展雜株類型定量鑒定的方

2、法，這種方法不僅能更精確的檢測雜交水稻種子純度，還能將種子所含的雜株類型及其各自占比鑒定出來，為種子企業(yè)提供更準(zhǔn)確、更全面的質(zhì)量信息和可操作性強的加工處理辦法。本方法廣泛適用于各種子企業(yè)對主營骨干水稻品種的質(zhì)量監(jiān)控和生產(chǎn)經(jīng)營決策。關(guān)鍵詞：SSR分子標(biāo)記 純度鑒定 雜株類型 定量鑒定 純度是種子質(zhì)量的核心指標(biāo)，既是種子企業(yè)生存的根本，也是企業(yè)種子加工、銷售決策的關(guān)鍵依據(jù)。種子純度檢測主要有海南種植鑒定（以下簡稱“南鑒”）、正季種植鑒定（以下簡稱“正鑒”）以及SSR分子標(biāo)記鑒定等方法。這三種方法各有特點：南鑒和正鑒是以田間小區(qū)種植方式，從植株的典型特性判別、鑒定種子純度。南鑒具有鑒定相對準(zhǔn)確、時間

3、相對提前的優(yōu)點，但海南冬季屬短日低溫條件，感光類型及兩系不育系均表現(xiàn)為正常結(jié)實，對雜交稻尤其是兩系雜交稻種子純度的鑒定結(jié)果往往失真；正鑒具有鑒定準(zhǔn)確、鑒定結(jié)果與大田生產(chǎn)實際吻合度高的優(yōu)點，但時間明顯滯后。從歷年發(fā)生的重大種子純度事故來看，絕大多數(shù)是在得知種子純度不合格之前種子已經(jīng)銷售到千家萬戶無法召回，最終釀成無法挽回的損失。SSR分子標(biāo)記是從DNA水平上檢測生物個體差異，具有多態(tài)性高、譜帶擴增穩(wěn)定、技術(shù)成熟、檢測時間短、不受環(huán)境影響等特點，在雜交水稻種子純度鑒定研究中得到了越來越廣泛的應(yīng)用1。本文詳細(xì)介紹了SSR分子標(biāo)記在雜交稻種子純度及雜株類型定量鑒定中的應(yīng)用，為種子企業(yè)在雜交稻種子純度的

4、檢測上提供更精確的鑒定方法。1 SSR分子標(biāo)記的原理、特點及在雜交水稻純度鑒定中的應(yīng)用現(xiàn)狀1.1 SSR分子標(biāo)記的原理 SSR 也稱為微衛(wèi)星DNA (microsatellite DNA)、短串聯(lián)重復(fù)(tendom-repeats)或簡單序列長度多態(tài)性(simple sequence length porlymorphism)，它通常是指基因組中由16 個核苷酸組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA ,廣泛分布于基因組的不同位置,長度一般在200 bp 以下,相同座位上的重復(fù)序列由于重復(fù)次數(shù)不同而產(chǎn)生了等位基因的多態(tài)性，SSR引物就是根據(jù)這些區(qū)域串連數(shù)目的差異造成的多態(tài)性設(shè)計而成的2-5。1.

5、2 SSR分子標(biāo)記的特點SSR分子標(biāo)記廣泛、隨機、均勻分布于作物基因組，參與遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變、基因調(diào)控等過程，直接反映種子遺傳物質(zhì)在DNA水平上的差異。具有以下幾個特點：1、準(zhǔn)確性高、數(shù)量豐富，覆蓋整個基因組，提供的信息量高；2、多態(tài)性好，多數(shù)SSR序列無功能作用,增加或減少幾個重復(fù)序列的頻率高,因而在品種間具廣泛位點變異,多態(tài)性強；3、重復(fù)性好,使用簡單,結(jié)果穩(wěn)定；4、SSR 標(biāo)記兩側(cè)的序列具有高度的保守性,它使我們可以在一個物種的微衛(wèi)星研究中利用另一物種的研究結(jié)果,從而更快更準(zhǔn)確地找到該物種中更多的SSR 位點，每個位點由設(shè)計的引物順序決定，便于相互交流、合作開發(fā)引物；5、屬共顯性遺傳，

6、符合孟德爾式遺傳定律，不易被自然選擇和人工選擇所淘汰；6、易于利用PCR技術(shù)分析，分析簡便,所需DNA樣品量少，僅需微量組織就能進行有效地分析鑒定，經(jīng)濟簡便；7、不受季節(jié)、環(huán)境的影響，并且鑒定的時間快。1.3 SSR標(biāo)記在雜交稻純度鑒定上的應(yīng)用現(xiàn)狀 彭鎖堂等2選用分布于水稻12條染色體上的26對引物對9個雜交稻組合及其親本進行了SSR分析,能夠有效地區(qū)分所有的恢復(fù)系和大部分不育系,并對雜交稻組合汕優(yōu)63和兩優(yōu)培九進行了單粒種子SSR鑒定,所測純度與田間種植鑒定純度非常接近,認(rèn)為SSR標(biāo)記適合于雜交水稻種子純度鑒定；辛業(yè)蕓等3應(yīng)用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對5個超級雜交稻組合及其9個親本進行鑒定,找到在

7、雜交稻組合及其親本間具有多態(tài)性的引物,篩選出5對引物分別作為鑒定這5個超級雜交稻組合的特異引物；詹慶才等4-5利用多態(tài)性好的兩對SSR標(biāo)記引物分別對參試的威優(yōu)46和金優(yōu)207進行了純度鑒定,能有效地將摻假的種子與真種子區(qū)分開；通過進一步研究，優(yōu)化了利用SSR分子標(biāo)記快速鑒定雜交水稻種子純度的技術(shù)體系,縮短了檢測時間，推進了該技術(shù)在雜交水稻種子純度鑒定中的應(yīng)用。當(dāng)前，SSR 分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于雜交水稻種子純度鑒定,種子企業(yè)利用該技術(shù)為雜交水稻種子的安全生產(chǎn)、安全推廣服務(wù)，各級種子管理部門利用該技術(shù)進行市場監(jiān)督和質(zhì)量監(jiān)控。2 SSR分子標(biāo)記在雜交水稻種子純度鑒定中存在的問題2.1 單個SSR

8、標(biāo)記難以準(zhǔn)確鑒定雜交水稻種子純度。 目前，一般利用單個SSR分子標(biāo)記檢測雜交水稻種子純度，由于單個標(biāo)記的局限性：能有效的將雜交種的父、母本鑒定出來，但不能將一些混雜的雜株以及一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開。郭承亮等6在利用SSR標(biāo)記RM21對兩優(yōu)287正季小區(qū)鑒定田間調(diào)查出的十種雜株類型的特異性進行了驗證，發(fā)現(xiàn)所選擇的SSR分子標(biāo)記只能區(qū)分其中6種雜株類型，對其它4種類型的雜株則不能區(qū)分。近幾年來，因推廣含有表現(xiàn)型明顯、比例較高的某一類型雜株（比如：青稞等）但事實上并未超標(biāo)的雜交稻種子，嚴(yán)重影響該種子企業(yè)的信譽，甚至引發(fā)群體性事件的案例時有發(fā)生。由于這種類型的雜株（如：青稞等）一般都是由串粉引

9、起的，單個標(biāo)記不能有效的將它鑒別出來，即使有時能夠鑒別，但不能精確鑒定其所占比例。2.2 單個SSR標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度的客觀誤差影響了對種子批真實質(zhì)量狀況的判定。 郭承亮等6在利用SSR標(biāo)記RM21和田間小區(qū)鑒定調(diào)查鑒定了30份兩優(yōu)287雜交稻材料的純度，研究發(fā)現(xiàn)：就每份樣品而言，SSR標(biāo)記鑒定的純度與田間種植鑒定的純度結(jié)果差異在1.5個百分點。我國的雜交稻種子純度（國標(biāo)二級）標(biāo)準(zhǔn)為96.0%，根據(jù)農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程(GB/T 3543·5 - 1995)中表16-2品種純度的容許差距規(guī)定：當(dāng)檢測的雜交水稻種子樣本數(shù)為200粒時，其允許誤差為2.3。而在種子執(zhí)法時，只要純度低于

10、96.0%就屬于劣種，執(zhí)法部門就可以對其予以重罰，這為種子企業(yè)在參考SSR標(biāo)記檢測的純度結(jié)果，做出具體的經(jīng)營決策帶來了很大困難，甚至可能會給該企業(yè)造成本可規(guī)避的巨大損失。2.3 單個SSR標(biāo)記鑒定雜交水稻種子純度不能對種子批大田種植的純度表現(xiàn)作出科學(xué)預(yù)判。 在研究中，還發(fā)現(xiàn)兩優(yōu)287品種中的父本雜株R287在正季種植鑒定中田間表現(xiàn)不明顯。通過單個標(biāo)記鑒定的結(jié)果，不能準(zhǔn)確地預(yù)判其正季種植的大田表現(xiàn)。因此，通過單個標(biāo)記鑒定種子純度，只能大致了解種子純度狀況，不能全面準(zhǔn)確判斷種子的質(zhì)量信息，給種子企業(yè)的生產(chǎn)、經(jīng)營帶來一定的風(fēng)險。3 SSR標(biāo)記在雜交稻種子純度及雜株類型定量鑒定中的技術(shù)要點及應(yīng)用實例3

11、.1 技術(shù)要點DNA提取參照傳統(tǒng)的CTAB法或簡化的DNA提取法4-5，PCR反應(yīng)程序參照行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1433-2007水稻品種鑒定 DNA指紋方法，PCR反應(yīng)產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。正季種植鑒定雜株類型調(diào)查、選取取葉片、提DNA多對SSR標(biāo)記檢測雜株類型定性分析、根據(jù)需要選取SSR標(biāo)記組合樣品登記SSR檢測、雜株定量分析正季種植鑒定統(tǒng)計結(jié)果統(tǒng)計結(jié)果差異性分析、統(tǒng)計差異結(jié)果、歸檔3.2 技術(shù)路線3.3 應(yīng)用實例湖北省種子集團有限公司郭承亮等7利用24對SSR標(biāo)記對兩優(yōu)287田間正季鑒定中的9種主要雜株類型的部分植株進行特異性分析，最終篩選出可將雜株類型相對區(qū)分開的3對SSR標(biāo)記

12、RM71、RM19、RM224，利用這3對SSR標(biāo)記對正季鑒定中的同一份樣本1920粒種子進行分析，鑒定出的種子純度及所含雜株類型比例與大田正季鑒定中的結(jié)果基本吻合，各種雜株類型的分布基本一致。并利用這3對SSR標(biāo)記對所有的正季種植鑒定中的雜株進行了差異性分析，研究發(fā)現(xiàn)：1、通過這3對標(biāo)記可以有效鑒定出所有表現(xiàn)型的雜株；2、在利用SSR標(biāo)記定量鑒定中，歸為其它類型雜株的，都能在雜株差異性分析中找出其基因型原型；3、在利用SSR標(biāo)記定量鑒定中歸為其他類型雜株的，各個基地都有其規(guī)律，并與種子生產(chǎn)基地的實際相符：如湖南基地多為遲熟株（串粉所致）、公安基地多為早熟株（落地谷）。同時，還將該技術(shù)推廣應(yīng)用

13、到廣兩優(yōu)558的雜株類型定量鑒定中，由于廣兩優(yōu)558的江蘇制種基地隔離條件很好，所以其所含的雜株僅為親本中的雜株及串粉的雜交種，經(jīng)過篩選，僅選取2對SSR標(biāo)記RM224、RM85就能有效的鑒別出早熟型雜株和父本、遲熟類型雜株、不育系這三類雜株，其結(jié)果與正季種植鑒定的結(jié)果基本一致。根據(jù)實踐證明，采用經(jīng)過篩選的多對SSR分子標(biāo)記，可以有效的鑒別各種雜株類型所占的比例，特別是能精確鑒定種子批中固定類型雜株（如父、母本）所占的比例。經(jīng)過三年的實驗，系統(tǒng)比較了兩種方法的鑒定結(jié)果，分析了檢測結(jié)果的差異性，建立了各個生產(chǎn)基地的SSR分子標(biāo)記鑒定種子純度及雜株類型定量鑒定的檔案。通過對比分析，準(zhǔn)確掌握了各制種

14、基地的雜交水稻種子純度信息，為公司雜交水稻種子的生產(chǎn)、加工、混樣、推廣提供準(zhǔn)確的質(zhì)量信息。4 SSR分子標(biāo)記在雜交稻種子純度及雜株類型定量鑒定中需要注意的幾個問題4.1 鑒定所需樣本大小 雜交水稻種子純度鑒定樣本的大小,直接關(guān)系到SSR分子標(biāo)記技術(shù)的檢測成本和檢測效率，樣本越大，結(jié)果越精確。根據(jù)近年來筆者大量檢測實踐,在雜株類型定量的研究中，由于種子樣本所代表的種子批數(shù)量一般較大，一般選取1000粒種子檢測，效果較好；對于特殊情況的或是種子批數(shù)量特別大的選取2000粒種子檢測，可保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。對于條件不足的企業(yè)，選取一個正季小區(qū)種植鑒定的種子數(shù)500粒也可以。4.2 鑒定時雜株的選取及

15、所需標(biāo)記的選取 在小區(qū)種植鑒定田，通過對主要雜株類型的田間觀察，每種雜株類型選取5-10株作為代表，有條件的可以選取所有雜株。雜株取樣完成后，先利用農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品種鑒定推薦的24對SSR引物對這些雜株進行檢測，通過對比、歸類、統(tǒng)計分析，如這24對引物滿足不了需求，可再選擇其他常用的純度檢測的引物進行檢測，最終選取3-5對能將各雜株類型相對區(qū)分開的SSR標(biāo)記組合進行種子純度及雜株類型定量鑒定。4.3 鑒定需與種子生產(chǎn)相結(jié)合盡管雜交水稻種子基地生產(chǎn)模式多樣化，甚至涉及到千家萬戶，但就雜交稻種子純度這一質(zhì)量指標(biāo)而言，各制種基地都有明顯的特點各基地的雜交稻種子所含雜株的類型及比例都不同，但也具有規(guī)律性

16、。因此，利用SSR標(biāo)記在雜交稻種子純度及雜株類型定量鑒定中，需與種子生產(chǎn)實際相結(jié)合。各企業(yè)需結(jié)合自己公司的實際情況，尤其是具體的品種和基地情況來進行分類，通過SSR鑒定與正季種植鑒定的對比分析，分析并找出差異性的原因，并歸類建檔，通過2-3年的研究，找出各基地的規(guī)律。5 小結(jié)傳統(tǒng)的種植鑒定方法雖具有鑒定準(zhǔn)確的優(yōu)點，但時間明顯滯后，不能滿足種子企業(yè)生產(chǎn)經(jīng)營的需求?，F(xiàn)有的利用SSR標(biāo)記檢測雜交水稻種子純度的辦法，雖然可以大致預(yù)測雜交水稻種子的純度，但面對復(fù)雜的生產(chǎn)環(huán)節(jié)，不能精確全面的反映種子質(zhì)量信息，仍不能滿足生產(chǎn)經(jīng)營的需求。而通過篩選后的SSR分子標(biāo)記組合不僅能精確的檢測雜交水稻種子純度，還能將種子所含的雜株類型和所占的比例鑒定出來，能夠為種子企業(yè)提供更準(zhǔn)確的種子質(zhì)量信息和更細(xì)致的、可操作性強的加工、混樣辦法，為種子企業(yè)的生產(chǎn)經(jīng)營“保駕護航”。本方法廣泛適用于各種子企業(yè)對主營骨干水稻品種的質(zhì)量監(jiān)控和生產(chǎn)經(jīng)營決策。參考文獻：1 李穩(wěn)香,詹慶才.雜交水稻種子純度SSR指紋圖譜標(biāo)記鑒定技術(shù)研究J.中國種業(yè).2006,3:21-22.2 彭鎖堂,莊杰云,顏啟佳,等.我國主要雜交水稻組合及其親本SSR 標(biāo)記和純度鑒定J.中國水稻科學(xué),2003,17(1):1-5.3 辛業(yè)蕓,張展,熊易平,等.應(yīng)用SSR分子標(biāo)記鑒定超級雜交水稻組合及其純度J