UV三點(diǎn)校正法測(cè)定維生素A的含量

1、UV三點(diǎn)校正法測(cè)定維生素三點(diǎn)校正法測(cè)定維生素A的含量的含量王宇 石慧l維生素A的結(jié)構(gòu)為具有一個(gè)共軛多烯醇側(cè)鏈的環(huán)己烷，由于其中有多個(gè)不飽和鍵，性質(zhì)不穩(wěn)定，易被空氣中氧或氧化劑氧化，易被紫外光裂解，并且其對(duì)酸不穩(wěn)定。其醋酸酯比維生素A穩(wěn)定，臨床使用一般將本品或棕櫚酸酯溶于植物油中應(yīng)用。因此，維生素A及其制劑除需密封在涼暗處保存外，還需充氮或加入合適的抗氧劑。l維生素A與氯仿、乙醚、環(huán)己烷或石油醚能任意混合，在乙醇中微溶，在水中不溶一、目的掌握UV三點(diǎn)校正法的原理和維生素A含量測(cè)定的方法。二、主要儀器和試劑紫外分光光度儀（具掃描功能），100ml容量瓶，燒杯若干個(gè)，維生素A膠丸（規(guī)格2.5萬單位/

2、粒）環(huán)己烷，乙醚三、實(shí)驗(yàn)原理l本法是在三個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度，根據(jù)校正公式計(jì)算吸收度A校正值后，再計(jì)算含量，故本法稱為“三點(diǎn)校正法”。該原理主要基于（1）雜質(zhì)的無關(guān)吸收在310nm340nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增長(zhǎng)吸收度下降。（2）物質(zhì)對(duì)光吸收呈加和性的原理。即在某一樣品的吸收曲線上，各波長(zhǎng)處的吸收度是維生素A與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者的疊加。 四、實(shí)驗(yàn)過程l精密稱取20粒膠丸2.4641g，破殼取內(nèi)容物，乙醚洗凈膠丸殼并稱量得總殼重0.7213g。l精密稱取內(nèi)容物0.0048g（915單位/ml范圍內(nèi)）于小燒杯，用少量環(huán)己烷溶解后轉(zhuǎn)移入100ml容量瓶，再用環(huán)

3、己烷定容至100ml。l先在紫外分光光度計(jì)下掃描出樣品溶液在200400nm范圍內(nèi)的吸收度曲線，確定最大吸收波長(zhǎng)。然后分別在300nm,316nm,328nm,340nm,360nm五個(gè)波長(zhǎng)下測(cè)定吸收度。計(jì)算l 求 ：由 A= CL，l 求得 =A/（CL）。l 求效價(jià)（IU/g）：效價(jià)系指每克供試品中所含維生素A的國(guó)際單位數(shù)（IU/g）。 即IU/g= 1900。 l 求維生素A占標(biāo)示量的百分含量： 標(biāo)示量%=（AD1900W100%）/ （W100L標(biāo)示量）100%。A值的選擇l首先計(jì)算吸收度比值（即Ai/A328）l 如果最大吸收波長(zhǎng)在326nm329nm之間，并分別計(jì)算5個(gè)波長(zhǎng)下的差值

4、，均不得超過0.02時(shí)，則不用校正公式計(jì)算吸收度，而直接用328nm處測(cè)得的吸收度A328求得。l 如果最大吸收波長(zhǎng)在326nm329nm之間，并分別計(jì)算5個(gè)波長(zhǎng)下的差值，如有一個(gè)或幾個(gè)超過0.02，這時(shí)應(yīng)按以下方法判斷：l 若A328（校正）與A328的吸收度相差不超過3.0%，則不用校正吸收度，仍以未經(jīng)校正的A328求得 。l 若A328（校正）與A328的吸收度相差在 -15%-3%之間，則以A328（校正）得 。l 若A328（校正）與A328的吸收度相差小于-15%或大于+3%，則不能用本法測(cè)定，而應(yīng)用第二法（皂化法）測(cè)定含量。l 如果最大吸收波長(zhǎng)不在326nm329nm之間，也不能

5、用本法測(cè)定，而應(yīng)用第二法（皂化法）測(cè)定含量。l第一法校正公式：A328(校正)=3.52(2A328-A316-A340)維生素A吸收度差值l由掃描結(jié)果得最大吸收波長(zhǎng)為327.7nm（326329nm）l各個(gè)差值均不超過0.02，不需用校正公式。故直接用A328進(jìn)行計(jì)算。l （328）= A328 /（100ms/D） =0.746/(1000.0048/100)=155.42l效價(jià)= 1900=155.421900=295298l標(biāo)示量%=(AD1900W)/(W100L標(biāo)示量) 100%=(0.74610019000.08714)/(0.0048 100125000) 100%=102.9

6、%二法：l方法：精密稱取一定量供試品，加氫氧化鉀乙醇溶液后煮沸回流，得到的皂化液再經(jīng)乙醚提取、洗滌、濾過、濃縮和干燥等處理，最后用異丙醇溶解殘?jiān)⑾♂尦擅?ml中含維生素A為915單位的溶液，在300、310、325、334波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，并確定最大吸收波長(zhǎng)。計(jì)算同第一法，換算因子為1830。l二法校正公式：A325（校正）=6.815A3252.5553104.260A334 實(shí)驗(yàn)報(bào)告實(shí)驗(yàn)報(bào)告 檢品名稱：維生素A膠丸 批號(hào) 050831 規(guī)格 2.5萬單位/粒l原理：本法是在三個(gè)波長(zhǎng)處測(cè)得吸收度， 根據(jù)校正公式計(jì)算吸收度A校正值后，再計(jì)算含量，故本法稱為“三點(diǎn)校正法”。雜質(zhì)的無關(guān)吸收在31

7、0nm340nm的波長(zhǎng)范圍內(nèi)幾乎呈一條直線，且隨波長(zhǎng)的增長(zhǎng)吸收度下降。物質(zhì)對(duì)光吸收呈加和性的原理。即在某一樣品的吸收曲線上，各波長(zhǎng)處的吸收度是維生素A與雜質(zhì)吸收度的代數(shù)和，因而吸收曲線也是二者的疊加。l結(jié)果：測(cè)得本品含量為標(biāo)示量的102.9%。l結(jié)論：符合規(guī)定（95.0%105.0%）。討論：l1、維生素A具有紫外吸收特征，在325nm328nm的范圍內(nèi)有最大吸收；并且，它能與三氯化銻試劑作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色。故可利用這些性質(zhì)對(duì)其進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定。l2、維生素A醋酸酯的吸收度校正公式是用直線方程式法（即代數(shù)法）推導(dǎo)而來；維生素A醇的吸收度校正公式是用相似三角形法（幾何法或稱6/7定位法）推

8、導(dǎo)而來。 l3、在應(yīng)用三點(diǎn)校正法時(shí)，除其中一點(diǎn)在最大吸收波長(zhǎng)處測(cè)定外，其余兩點(diǎn)均在最大吸收峰的兩側(cè)進(jìn)行測(cè)定。如果儀器波長(zhǎng)精度不準(zhǔn)確時(shí)，會(huì)產(chǎn)生較大誤差。因此，在測(cè)定前務(wù)必要校正波長(zhǎng)，并可用全反式維生素A進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定結(jié)果和比值是否與對(duì)照品相符合，以進(jìn)一步核對(duì)儀器波長(zhǎng)是否準(zhǔn)確。測(cè)定的樣品應(yīng)不得少于兩份。l4、本組在對(duì)維生素A含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)過一些問題。第一次用一法測(cè)定結(jié)果不符合規(guī)定，按照要求應(yīng)該用二法測(cè)定。但分析原因后，我們重新做了一遍，用一法測(cè)定取得了較好結(jié)果，所給維生素A含量符合規(guī)定。l我們發(fā)現(xiàn)第一次實(shí)驗(yàn)失敗的原因是：紫外分光光度計(jì)出現(xiàn)了問題，波長(zhǎng)不準(zhǔn)確，從而導(dǎo)致在相應(yīng)波長(zhǎng)下測(cè)得的吸收度

9、不準(zhǔn)確?？梢妰x器波長(zhǎng)的準(zhǔn)確與否在實(shí)驗(yàn)中是致關(guān)重要的。整個(gè)操作過程沒有進(jìn)行暗室操作，在光照下暴露了較長(zhǎng)時(shí)間，而維生素A不穩(wěn)定，見光易變質(zhì)，所以導(dǎo)致測(cè)定含量不準(zhǔn)。l另外，在操作中應(yīng)注意： 在含量測(cè)定時(shí)膠殼要盡量洗干凈，避免內(nèi)容物殘留，使粒重盡量準(zhǔn)確。 由于所取的樣品量非常小，所以用于收集樣品的小燒杯一定要用溶劑洗滌多次并合并入容量瓶中，容量瓶口也要沖洗使樣品全部轉(zhuǎn)入。 在測(cè)定不同波長(zhǎng)下的吸收度時(shí)每一次都要用空白液進(jìn)行調(diào)零。l5、其他維生素A含量測(cè)定方法：lA 三氯化銻比色法l（1）原理：維生素A與三氯化銻的無水氯仿溶液作用，產(chǎn)生不穩(wěn)定的藍(lán)色，在618nm620nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，符合Beer定律。l（2）方法：取維生素A對(duì)照品，制成系列濃度的氯仿溶液，加入一定量的三氯化銻氯仿溶液，在5s10s內(nèi)，于620nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。按同法測(cè)定供測(cè)品溶液的吸收度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量。lB 高效液相色譜法 采用RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定人血清中維生 素 A和維生素E的含量。 l維生素A的含量用生物效價(jià)即國(guó)際單位（IU/g）來表示。維生素A的國(guó)際單位規(guī)定如下：1IU=0.344ug維生素A醋酸酯；1IU=0.300ug維生素A醇。l每1g維生素A醋酸酯相當(dāng)?shù)膰?guó)際單位數(shù)為：1106/(