western blot

1、Western Blot Western Blot中文稱為中文稱為蛋白質(zhì)印跡蛋白質(zhì)印跡，是一種是一種定性定性和和半定量半定量檢測微量蛋白質(zhì)的方檢測微量蛋白質(zhì)的方法，能檢測皮克（法，能檢測皮克（pg）級的蛋白質(zhì)。）級的蛋白質(zhì)。 第一次電泳第一次電泳( (SDS-PAGE) )：通過：通過凝膠凝膠介質(zhì)介質(zhì)將樣品中不同種類的蛋白質(zhì)分離；將樣品中不同種類的蛋白質(zhì)分離； 第二次電泳第二次電泳( (轉(zhuǎn)印電泳轉(zhuǎn)印電泳) )：將凝膠中分離的：將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相載體固相載體（例如（例如PVDF膜膜聚偏二氟聚偏二氟乙烯乙烯）上，固相載體以非共價）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，能保持

2、分離蛋白質(zhì)的鍵形式吸附蛋白質(zhì)，能保持分離蛋白質(zhì)的位置及其抗原活性不變。位置及其抗原活性不變。一、基本原理一、基本原理 檢測對象是檢測對象是蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)，“探針探針”是抗體，是抗體，“顯顯色色”用標記的二抗。用標記的二抗。 具體的技術(shù)流程：具體的技術(shù)流程： 免疫反應(yīng)：以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗免疫反應(yīng)：以固相載體上的蛋白質(zhì)作為抗原，與對應(yīng)的原，與對應(yīng)的第一抗體第一抗體特異性結(jié)合；再與特異性結(jié)合；再與酶酶( (或同位素或同位素) )標記標記的的第二抗體第二抗體( (抗第一抗抗第一抗體的抗體體的抗體) )特異性結(jié)合；特異性結(jié)合； 顯色反應(yīng)：顯色反應(yīng)：經(jīng)過經(jīng)過標記的酶標記的酶催化催化底物顯色底物顯色或

3、或放射自顯影，檢測電泳分離的特異性蛋白放射自顯影，檢測電泳分離的特異性蛋白質(zhì)成分。質(zhì)成分。 二、操作流程二、操作流程1、收集生物樣品的總蛋白；、收集生物樣品的總蛋白；2、每個樣品總、每個樣品總蛋白含量測定；蛋白含量測定； （目的：（目的：SDS-PAGE加樣時，要求加入的加樣時，要求加入的每個每個樣品的蛋白質(zhì)含量相等樣品的蛋白質(zhì)含量相等。）3、SDS-PAGE電泳，通過電泳，通過 凝膠介質(zhì)分離樣品中不凝膠介質(zhì)分離樣品中不 同種類的蛋白質(zhì)；同種類的蛋白質(zhì)；Marker: 蛋白質(zhì)分子量標準蛋白質(zhì)分子量標準4、轉(zhuǎn)印電泳、轉(zhuǎn)印電泳( (轉(zhuǎn)膜電泳轉(zhuǎn)膜電泳) ) 目的：目的：從凝膠中分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶轉(zhuǎn)移到

4、從凝膠中分離的蛋白質(zhì)區(qū)帶轉(zhuǎn)移到固相薄膜上，固相薄膜上，以便后繼的免疫反應(yīng)以便后繼的免疫反應(yīng)） 技術(shù)種類：技術(shù)種類： 濕式電轉(zhuǎn)印濕式電轉(zhuǎn)印 半干式電轉(zhuǎn)印半干式電轉(zhuǎn)印 優(yōu)點優(yōu)點：電泳緩沖液用量很少，：電泳緩沖液用量很少， 電泳時間縮短。電泳時間縮短。 濕濕式電轉(zhuǎn)印式電轉(zhuǎn)印 根據(jù)凝膠大小準備根據(jù)凝膠大小準備4張濾紙和張濾紙和1張張PVDF( (聚聚乙烯膜乙烯膜) ) （注意戴手套操作，以避免手上的（注意戴手套操作，以避免手上的蛋白污染膜）；將裁好的蛋白污染膜）；將裁好的PVDF膜和濾紙，膜和濾紙，以及以及2張海綿墊置于轉(zhuǎn)印電泳緩沖液張海綿墊置于轉(zhuǎn)印電泳緩沖液( (含甲醇含甲醇) )中浸中浸10min

5、。 用矩形托盤裝轉(zhuǎn)印緩沖液用矩形托盤裝轉(zhuǎn)印緩沖液( (或蒸餾水或蒸餾水) )，以下，以下操作都在操作都在托盤的托盤的液體里進行；液體里進行； 打開轉(zhuǎn)膜夾，先鋪打開轉(zhuǎn)膜夾，先鋪1層海綿墊，在其上再鋪層海綿墊，在其上再鋪2層濾紙，去氣泡；層濾紙，去氣泡； PVDF膜鋪于濾紙上，去氣泡；膜鋪于濾紙上，去氣泡； 凝膠蓋于凝膠蓋于PVDF膜上，去氣泡；膜上，去氣泡； 在凝膠上面再蓋上在凝膠上面再蓋上2層濾紙，最后蓋上層濾紙，最后蓋上1層海層海綿墊，去氣泡；綿墊，去氣泡； 電泳槽倒?jié)M轉(zhuǎn)印電泳緩沖液；電泳槽倒?jié)M轉(zhuǎn)印電泳緩沖液； 將轉(zhuǎn)膜夾蓋好并夾緊，迅速放入電泳槽中，將轉(zhuǎn)膜夾蓋好并夾緊，迅速放入電泳槽中，注意

6、注意： PVDF膜面向正極，凝膠面向負極；膜面向正極，凝膠面向負極； 將電泳槽放置將電泳槽放置-4環(huán)境，電泳：環(huán)境，電泳：200V，2h。 根據(jù)凝膠大小準備根據(jù)凝膠大小準備6張濾紙和張濾紙和1張張PVDF( (聚聚乙烯膜乙烯膜) ) （注意戴手套操作注意戴手套操作，以避免手上的，以避免手上的蛋白污染膜）；將裁好的蛋白污染膜）；將裁好的PVDF膜和濾紙置膜和濾紙置于轉(zhuǎn)印緩沖液于轉(zhuǎn)印緩沖液( (含甲醇含甲醇) )中浸中浸10min。 轉(zhuǎn)膜電泳盒底部的平面電極板轉(zhuǎn)膜電泳盒底部的平面電極板( (正極正極) )上墊三上墊三層濾紙，去氣泡；層濾紙，去氣泡； PVDF膜鋪于濾紙上，去氣泡；膜鋪于濾紙上，去氣

7、泡； 凝膠蓋于凝膠蓋于PVDF膜上，去氣泡；膜上，去氣泡； 在凝膠上面再鋪上三層濾紙，去氣泡在凝膠上面再鋪上三層濾紙，去氣泡( (膜兩膜兩側(cè)的濾紙不能接觸，否則電泳時會短路側(cè)的濾紙不能接觸，否則電泳時會短路) )； 最后將裝有平面電極板最后將裝有平面電極板( (負極負極) )的的轉(zhuǎn)膜電泳盒轉(zhuǎn)膜電泳盒蓋子蓋上，通電，蓋子蓋上，通電，60V，60min。 半干式電轉(zhuǎn)印半干式電轉(zhuǎn)印4、染色：、染色：（此步可省略）（此步可省略） 用考馬斯亮藍或麗春紅染用考馬斯亮藍或麗春紅染 PVDF膜，膜，觀察電泳分離蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)膜的效果。觀察電泳分離蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)膜的效果。5、免疫反應(yīng)、免疫反應(yīng) 將將PVDF膜用膜用TB

8、S( (Tris-HClNaCl緩沖液緩沖液) )浸濕后，放入浸濕后，放入5%脫脂奶粉封閉液中脫脂奶粉封閉液中( (TBS配制配制) )，在，在室溫下、搖床上搖動封閉室溫下、搖床上搖動封閉1h。（封閉非特異性抗原位點封閉非特異性抗原位點） 將一抗用將一抗用TBST( ( 含含tween 20的的TBS) )稀釋稀釋至適當濃度；將抗體溶液加到保鮮膜上；至適當濃度；將抗體溶液加到保鮮膜上；從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液從封閉液中取出膜，用濾紙吸去殘留液后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，后，將膜蛋白面朝下放于抗體液面上，趕出氣泡；室溫下孵育趕出氣泡；室溫下孵育12h后，用后，用TBST在搖床上洗

9、兩次，每次在搖床上洗兩次，每次10min；再；再用用TBS洗一次，洗一次，10min。 同上，準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫同上，準備二抗稀釋液并與膜接觸，室溫下孵育下孵育12h后，用后，用TBST在搖床上洗兩在搖床上洗兩次，每次次，每次10min；再用；再用TBS洗一次，洗一次，10min。6、化學發(fā)光和凝膠成象系統(tǒng)拍照、化學發(fā)光和凝膠成象系統(tǒng)拍照 臨用時，臨用時，將將ECL試劑盒的試劑盒的A液液( (含發(fā)光劑和含發(fā)光劑和增強劑增強劑) )和和B液液( (含含H2O2) )按要求按要求混合，滴到混合，滴到保鮮膜上，將保鮮膜上，將PVDF膜蛋白面朝下與此混膜蛋白面朝下與此混合液充分接觸；合液充分接觸；1min后，將膜迅速移至凝后，將膜迅速移至凝膠成像系統(tǒng)分析儀中檢測膠成像系統(tǒng)分析儀中檢測( (ECL液可去除，液可去除，也可保留也可保留) )。 將膜放置凝膠成像系統(tǒng)分析儀的暗室中，將膜放置凝膠成像系統(tǒng)分析儀的暗室中，關(guān)好暗室門；調(diào)節(jié)攝像頭的焦距關(guān)好暗室門；調(diào)節(jié)攝像頭的焦距( (系統(tǒng)系統(tǒng)的的計算機視屏觀察計算機視屏觀察) )；通過計算機設(shè)置曝光通過計算機設(shè)置曝光時間，并拍攝圖像，圖像會自動存儲。時間，并拍攝圖像，圖像會自動存儲。 注意注意：化學發(fā)光時間一般持續(xù)：化學發(fā)光時間一般持續(xù)510min，7、判斷結(jié)果、判斷