第二章 蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)(2)

1、1一、一、 引言引言 蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是蛋白質(zhì)（酶）存在于一切生物體中，是非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物非常重要的生物大分子。蛋白質(zhì)是生物功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)功能的執(zhí)行者，擔(dān)負(fù)著生物催化、物質(zhì)運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別運(yùn)輸、運(yùn)動(dòng)、防御、調(diào)控及記憶、識(shí)別等多種生理功能。等多種生理功能。2（一）分離純化的意義（一）分離純化的意義從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功從生物材料中分離制備蛋白質(zhì)，研究其結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的能，對(duì)于了解生命活動(dòng)的規(guī)律，闡明生命現(xiàn)象的本質(zhì)有重大意義。本質(zhì)有重大意義。工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織

2、、制革等工工業(yè)生產(chǎn)的需要：食品、發(fā)酵、紡織、制革等工業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制業(yè)，需要大量的高活性的酶制劑。如用淀粉酶制造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。造葡萄糖、麥芽糖、糊精以及糖漿等。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。醫(yī)療的需要：如用豬胰島素治療糖尿病。基因工程的需要?；蚬こ痰男枰?（二）分離純化的要求（二）分離純化的要求1 1. .純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。純度：主要取決于研究的目的和應(yīng)用上的要求。如作為研究蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的如作為研究蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)、空間結(jié)構(gòu)，一級(jí)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系的蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶關(guān)系的

3、蛋白質(zhì)制劑、工具酶和標(biāo)準(zhǔn)蛋白、酶法分析的酶制劑，都要求均一；制劑，都要求均一；工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即工業(yè)、醫(yī)藥方面應(yīng)用的酶和蛋白質(zhì)制劑，達(dá)到一定純度即可，不要求均一?？桑灰缶?。2 2. .活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的活性：要求大分子保持天然構(gòu)象狀態(tài)，有高度的生物活性。生物活性。3 3. .收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中收率：希望收率越高越好，但在分離純化過程中總有不少損失。而且提純步驟越多，損失越大?？傆胁簧贀p失。而且提純步驟越多，損失越大。4（三）分離純化的一般程序（三）分離純化的一般程序生物大分子的分離純化一般生物大分子的分離純化

4、一般可分為以下幾個(gè)階段：可分為以下幾個(gè)階段： 材料的選擇和預(yù)處理材料的選擇和預(yù)處理 破碎細(xì)胞及提取（有時(shí)還破碎細(xì)胞及提?。ㄓ袝r(shí)還需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離）需要進(jìn)行細(xì)胞器的分離） 分離純化：包括粗分級(jí)分分離純化：包括粗分級(jí)分離和細(xì)分級(jí)分離離和細(xì)分級(jí)分離其中前兩個(gè)階段為生物大分其中前兩個(gè)階段為生物大分子分離純化的前處理。子分離純化的前處理。選擇材料選擇材料破碎細(xì)胞破碎細(xì)胞提取提取分離純化分離純化分析及鑒定分析及鑒定5二、二、 蛋白質(zhì)（酶蛋白質(zhì)（酶) )分離純化的前處理分離純化的前處理（一）材料的選擇與預(yù)處理（一）材料的選擇與預(yù)處理選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。選擇材料主要根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩?。工業(yè)生產(chǎn)工業(yè)

5、生產(chǎn)上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成上注意選擇含量高、來源豐富、易獲得、制備工藝簡(jiǎn)單、成本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料。本低的動(dòng)植物組織或微生物做原料?？蒲羞x材科研選材則無需考慮上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯?。則無需考慮上述問題，只要能達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康募纯伞?shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)材料選定后，常常需要進(jìn)行預(yù)處理。如如動(dòng)物材料動(dòng)物材料需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；需要除去一些與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的結(jié)締組織、脂肪組織；植物種子植物種子需要除殼；需要除殼；微生物微生物需要將菌體與發(fā)酵液分開。需要將菌體與發(fā)酵液分開。另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若

6、不立即進(jìn)行實(shí)另外，必須盡可能保持材料的新鮮，盡快加工處理。若不立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。驗(yàn)或加工，應(yīng)冷凍保存。6（二）細(xì)胞的破碎（二）細(xì)胞的破碎分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子分離提取某一生物大分子，首先要求生物大分子從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，從原來的組織或細(xì)胞中以溶解的狀態(tài)釋放出來，并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)并保持原來的天然狀態(tài)，不丟生物活性。因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是選擇適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。但若材料是體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則體液（如血）或生物體分泌到體外的分泌物，則不必進(jìn)行組織細(xì)胞的破碎。不必進(jìn)

7、行組織細(xì)胞的破碎。組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，不組織細(xì)胞的破碎方法很多，不同的實(shí)驗(yàn)規(guī)模，不同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法和條同的實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)要求，使用的破碎方法和條件也不同。件也不同。71. 機(jī)械法：機(jī)械法：1) 1) 研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。入少量石英砂研磨或勻漿。2) 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通?？上扔眉矣檬称芳庸C(jī)將組織打碎，然后再用通常可先用家用食品加工機(jī)將組織打碎，然后再用1000010000r/minr/

8、min20000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)( (即高速即高速分散器分散器) )將組織的細(xì)胞打碎。將組織的細(xì)胞打碎。82.物理法：物理法：1) 反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至反復(fù)凍融法：將待破碎的細(xì)胞冷至15到到20，然后放，然后放于室溫于室溫(或或40)迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形迅速融化，如此反復(fù)凍融多次，由于細(xì)胞內(nèi)形成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。成冰粒使剩余胞液的鹽濃度增高而引起細(xì)胞溶脹破碎。2) 超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)超聲波處理法：此法是借助超聲波的振動(dòng)力破碎細(xì)胞壁和細(xì)胞器。破碎微生物細(xì)菌

9、和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。胞器。破碎微生物細(xì)菌和酵母菌時(shí)，時(shí)間要長(zhǎng)一些。3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細(xì)胞的方法。在1000105Pa2000105Pa 的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔的高壓下使細(xì)胞懸液通過一個(gè)小孔突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。突然釋放至常壓，細(xì)胞將徹底破碎。4) 冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。冷熱交替法：從細(xì)菌或病毒中提取蛋白質(zhì)和核酸時(shí)可用此法。在在90左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復(fù)多次，絕大部分細(xì)胞可以被破碎。多次，絕大部分細(xì)胞可

10、以被破碎。93. 化學(xué)與生物化學(xué)方法：化學(xué)與生物化學(xué)方法：1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的自溶法：將新鮮的生物材料存放于一定的pH和適當(dāng)?shù)臏睾瓦m當(dāng)?shù)臏囟认拢?xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯度下，細(xì)胞結(jié)構(gòu)在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。酶等）的作用下發(fā)生溶解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。2) 溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的溶脹法：細(xì)胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，稀鹽溶液中，由于存在滲透壓差，溶劑分子大量進(jìn)入細(xì)胞，將細(xì)胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。將細(xì)

11、胞膜脹破釋放出細(xì)胞內(nèi)含物。 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，于酶和酯酶等，于37，pH8，處理處理15分鐘，可以專一性地將分鐘，可以專一性地將細(xì)胞壁分解。細(xì)胞壁分解。 4) 有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或有機(jī)溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細(xì)胞，可將細(xì)胞膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。膜溶解，從而使細(xì)胞破裂，此法也可以與研磨法聯(lián)合使用。10（三）細(xì)胞器的分離（三）細(xì)胞器的分離

12、細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞器包括細(xì)胞核、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，植物細(xì)胞還有葉綠體。植物細(xì)胞還有葉綠體。如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大如果要分離制備分布在這些細(xì)胞器中的生物大分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備分子，為了防止其他細(xì)胞組分中的物質(zhì)對(duì)制備物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來，物的干擾或污染，還需先將細(xì)胞器分離出來，然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。然后在某一細(xì)胞器中分離某一物質(zhì)。細(xì)胞器的分離一般采用細(xì)胞器的分離一般采用差速離心法差速離心法，即將破碎，即將破碎后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介后的細(xì)胞在適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)中進(jìn)行離心，常用的介質(zhì)有蔗糖、甘

13、露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各質(zhì)有蔗糖、甘露醇、檸檬酸、聚乙二醇等。各種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度種細(xì)胞組分按質(zhì)量大小的不同，經(jīng)過不同速度的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次的離心后，沉降于離心管的不同部位，經(jīng)多次分步離心后，即可獲得所需組分。分步離心后，即可獲得所需組分。11（四）提?。ㄋ模┨崛〗M織細(xì)胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物組織細(xì)胞破碎過程中，大量的胞內(nèi)酶及細(xì)胞內(nèi)含物被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑被釋放出來，必須立即將其置于一定條件下和溶劑中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然中，讓制備物充分溶解，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成

14、制備物的分解破壞，這狀態(tài)，避免因長(zhǎng)久放置造成制備物的分解破壞，這就是提取。就是提取。121. 影響提取的因素影響提取的因素目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大??；目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大?。挥晒滔鄶U(kuò)散到液相的難易；由固相擴(kuò)散到液相的難易；溶劑的溶劑的pHpH值和提取時(shí)間等。值和提取時(shí)間等。通常：通常： 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；極性溶劑； 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；溶劑； 溫度升高，溶解度加大；溫度升高，溶解度加大； 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pHpH值，溶解度

15、增加。值，溶解度增加。提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。和保持其生物活性。132. 水溶液提取水溶液提取蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液蛋白質(zhì)和酶的提取一般以水溶液為主。用水溶液提取生物大為主。用水溶液提取生物大分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響因素是：分子應(yīng)注意的幾個(gè)主要影響因素是： 1) 鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：鹽濃度（即離子強(qiáng)度）：離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋離子強(qiáng)度對(duì)生物大分子的溶解度有極大的影響，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解度，如在白質(zhì)和酶，在低離子強(qiáng)度的溶液中都有較大的溶解

16、度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增純水中加入少量中性鹽，蛋白質(zhì)的溶解度比在純水時(shí)大大增加，稱為加，稱為“鹽溶鹽溶”現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的現(xiàn)象。鹽溶現(xiàn)象的產(chǎn)生主要是少量離子的活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了活動(dòng)，減少了偶極分子之間極性基團(tuán)的靜電吸引力，增加了溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。溶質(zhì)和溶劑分子間相互作用力的結(jié)果。為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水為了提高提取效率，有時(shí)需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強(qiáng)度（如加入加入

17、KCl、NaCl、NH4Cl或或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性可以增加溶液的極性。142) pH值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與值：蛋白質(zhì)、酶的溶解度和穩(wěn)定性與pH值有值有關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在關(guān)。過酸、過堿均應(yīng)盡量避免，一般控制在pH=68范圍內(nèi)，提取溶劑的范圍內(nèi)，提取溶劑的pH應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶應(yīng)在蛋白質(zhì)和酶的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。的穩(wěn)定范圍內(nèi)，通常選擇偏離等電點(diǎn)的兩側(cè)。 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在質(zhì)和酶，提取時(shí)一般在05的低溫操作。的低溫操作。 4) 防止蛋白酶的降解作

18、用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提防止蛋白酶的降解作用：加入抑制劑或調(diào)節(jié)提取液的取液的pH、離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解離子強(qiáng)度或極性等方法使相應(yīng)的水解酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降酶失去活性，防止它們對(duì)欲提純的蛋白質(zhì)、酶的降解作用。解作用。 155) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般采用一般采用溫和攪拌溫和攪拌為宜，速度太快容易產(chǎn)生大為宜，速度太快容易產(chǎn)生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會(huì)引起酶等物質(zhì)的變性失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)物質(zhì)的變性失活。因?yàn)橐话愕鞍踪|(zhì)都含有相當(dāng)數(shù)量的巰基，有些巰基常常

19、是活性部位的必需數(shù)量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣基團(tuán)，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的接觸過多都會(huì)使巰基氧化為分子內(nèi)或分子間的二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入二硫鍵，導(dǎo)致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。少量巰基乙醇或二硫蘇糖醇以防止巰基氧化。163. 有機(jī)溶劑提取有機(jī)溶劑提取一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多一些和脂類結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，的蛋白質(zhì)和酶難溶于水、稀鹽、稀酸、或稀堿中，常用不同比例的

20、有機(jī)溶劑提取。常用不同比例的有機(jī)溶劑提取。 常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮常用的有機(jī)溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時(shí)具有親水性和親脂性。親水性和親脂性。 有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有些蛋白質(zhì)和酶既溶于稀酸、稀堿，又能溶于含有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，有一定比例的有機(jī)溶劑的水溶液中，在這種情況下，采用稀的有機(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐模捎孟〉挠袡C(jī)溶液提取常?？梢苑乐顾饷傅钠茐模⒓嬗谐ルs質(zhì)提高純化效果的作用。并兼有除去雜質(zhì)提高純化效果的作用。 例如，胰島素

21、例如，胰島素。 174. 膜蛋白的提取膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但膜蛋白的種類繁多，多數(shù)膜蛋白分子數(shù)目較少，但卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。卻賦予細(xì)胞膜非常重要的生物學(xué)功能。 根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，根據(jù)膜蛋白分離的難易及其與脂分子的結(jié)合方式，膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。膜蛋白可分為兩大類型：外在膜蛋白、內(nèi)在膜蛋白。(1) 外在膜蛋白為水溶性蛋白外在膜蛋白為水溶性蛋白，靠離子鍵或其它較，靠離子鍵或其它較弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此弱的鍵與膜表面的蛋白質(zhì)分子或脂分子結(jié)合，因此只要改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜只要

22、改變?nèi)芤旱碾x子強(qiáng)度甚至提高溫度就可以從膜上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。上分離下來，膜結(jié)構(gòu)并不被破壞。(2) 內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用內(nèi)在膜蛋白與膜結(jié)合非常緊密，一般講只有用去垢劑去垢劑(detergent)使膜解后才可分離出來。使膜解后才可分離出來。 18膜蛋白膜蛋白 即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的即內(nèi)在蛋白溶解性不好，提取膜蛋白的基基本方法就是用本方法就是用不同的離心速度不同的離心速度去掉胞質(zhì)蛋白等，最去掉胞質(zhì)蛋白等，最后用后用去污劑去污劑把蛋白從膜中釋放出來。把蛋白從膜中釋放出來。膜蛋白分離純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砟さ鞍追蛛x純化的重要步驟是選擇適當(dāng)?shù)脑鋈苡帽砻?/p>

23、活性劑，一般常用的有膽酸鹽，面活性劑，一般常用的有膽酸鹽，Triton-100，Tween-80, SDS等表面活性劑。等表面活性劑。 19分離膜蛋白的方法（原則性） 1） 先分離膜，然后提??；如選用冷熱交替法、反復(fù)先分離膜，然后提取；如選用冷熱交替法、反復(fù)凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理凍融法、超聲破碎法、玻璃勻漿法、自溶法和酶處理法使得細(xì)胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白法使得細(xì)胞破碎，然后通過剃度離心得到含有膜蛋白的粗組分。的粗組分。 2 ）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，）用特殊的去污劑選擇性的分離。在多數(shù)情況下，都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來

24、。都是采用去垢劑將疏水蛋白從其膜結(jié)構(gòu)中溶解下來。20三、分離與純化三、分離與純化從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈從細(xì)胞中提取得到的生物大分子往往是不純凈的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這的，含有大量雜質(zhì)，必須進(jìn)一步分離純化，這一階段可分為一階段可分為粗分級(jí)粗分級(jí)分離和分離和細(xì)分級(jí)細(xì)分級(jí)分離兩步進(jìn)分離兩步進(jìn)行。行。蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白蛋白質(zhì)分離純化的方法很多，主要是根據(jù)蛋白分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，分子之間特異性的差異，如分子大小，溶解度，電荷等建立起來的。電荷等建立起來的。21常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)常用的蛋白質(zhì)分離純化技術(shù)溶解度溶解度鹽析、等

25、電點(diǎn)沉淀、鹽析、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀有機(jī)溶劑沉淀分子大小分子大小透析、超過濾透析、超過濾密度梯度離心、凝密度梯度離心、凝膠過濾膠過濾帶電特性帶電特性電泳、離子交換色譜電泳、離子交換色譜吸附特性吸附特性吸附吸附色譜色譜對(duì)配體分子對(duì)配體分子的親和性的親和性依據(jù)性質(zhì)依據(jù)性質(zhì)方方 法法用于粗分用于粗分用于細(xì)分用于細(xì)分親和色譜親和色譜、金屬、金屬螯合螯合色譜色譜22（一）粗分級(jí)分離（一）粗分級(jí)分離主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀主要是利用鹽析法、等電點(diǎn)沉淀、有機(jī)溶劑沉淀等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。等方法，使目的蛋白與其它較大量的雜蛋白分開。優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量

26、雜質(zhì)，又優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、處理量大、既能除去大量雜質(zhì)，又能濃縮蛋白質(zhì)能濃縮蛋白質(zhì)。缺點(diǎn)：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。缺點(diǎn)：分辨率低，產(chǎn)品雜質(zhì)多。231. 1. 鹽析（鹽析（中性鹽沉淀中性鹽沉淀）在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉淀析出的過程稱為為“鹽析鹽析”。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核。除了蛋白質(zhì)和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。酸等都可以用鹽析法進(jìn)行沉淀分離。 鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多鹽析法應(yīng)用最廣的還是在蛋白質(zhì)領(lǐng)域，已有八十多年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是：年的歷史，其突出的優(yōu)點(diǎn)是： 成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。

27、成本低，不需要特別昂貴的設(shè)備。 操作簡(jiǎn)單、安全。操作簡(jiǎn)單、安全。 對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有穩(wěn)定作用。24 鹽析的基本原理鹽析的基本原理蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水化膜蛋白質(zhì)溶液為親水溶膠體系，其穩(wěn)定因素：水化膜和電荷。和電荷。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。中性鹽的親水性大于蛋白質(zhì)分子的親水性。加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，加入大量中性鹽后，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水暴露出疏水區(qū)域，同時(shí)又中和了電荷，破壞了親水溶膠，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。溶膠，蛋白質(zhì)分子即形成沉淀。25溶解度溶解度鹽濃度鹽

28、濃度Salting-outSalting-in26脫水脫水脫水脫水脫水脫水帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）陰離子陰離子陽離子陽離子堿堿酸酸酸酸蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)聚集聚集沉淀沉淀堿堿水化膜水化膜帶正電荷蛋白質(zhì)帶正電荷蛋白質(zhì)（疏水膠體）（疏水膠體）27 中性鹽的選擇中性鹽的選擇常用的中性鹽中最重要的是常用的中性鹽中最重要的是(NH4)2SO4，因?yàn)樗c其因?yàn)樗c其他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)：他常用鹽類相比有十分突出的優(yōu)點(diǎn)： 1) 溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，溶解度大：尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通這是其他鹽類所不具備

29、的。由于酶和各種蛋白質(zhì)通常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下常是在低溫下穩(wěn)定，因而鹽析操作也要求在低溫下（04）進(jìn)行。由下表可以看到，）進(jìn)行。由下表可以看到， 硫酸銨在硫酸銨在0時(shí)時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類：28幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）毫升水） 溫度溫度 0 20 80 100（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 1）硫酸銨在）硫酸銨在0 0時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它鹽類時(shí)的溶解度，遠(yuǎn)遠(yuǎn)

30、高于其它鹽類292) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨鹽析，一步就可以除去75的雜蛋白，純度提高了四倍。3) 不易引起變性，有穩(wěn)定酶與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。有的酶或蛋白質(zhì)用23mol/L濃度的(NH4)2SO4保存可達(dá)數(shù)年之久。 4) 價(jià)格便宜，廢液不污染環(huán)境。30（3 3）分段鹽析）分段鹽析不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的不同的蛋白質(zhì)分子，由于其分子表面的極性基團(tuán)的種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，種類、數(shù)目以及排布的不同，其水化層厚度不同，故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)故鹽析所需要的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的中性鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。

31、的中性鹽濃度，可以使不同的蛋白質(zhì)分別沉淀。血清血清球蛋白球蛋白清蛋白清蛋白( (NHNH4 4) )2 2SOSO4 450%50%飽和度飽和度飽和飽和析出析出析出析出飽和度飽和度：在給定條件下以可能達(dá)到的最大濃度的百在給定條件下以可能達(dá)到的最大濃度的百分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。分?jǐn)?shù)表示的鹽濃度。31（4 4）鹽析的影響因素鹽析的影響因素1) 蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉蛋白質(zhì)的濃度：高濃度的蛋白質(zhì)用稍低的硫酸銨飽和度沉淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。淀，若蛋白質(zhì)濃度過高，易產(chǎn)生各種蛋白質(zhì)的共沉淀作用。低濃度的蛋白質(zhì)，共沉淀作用小，但回收率降低。低濃度的蛋白質(zhì)

32、，共沉淀作用小，但回收率降低。較適中的較適中的蛋白質(zhì)濃度是蛋白質(zhì)濃度是2.53.0，相當(dāng)于，相當(dāng)于25 mg/mL30mg/mL。2) pH值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，值對(duì)鹽析的影響：在等電點(diǎn)處溶解度小，pH值常選在值常選在該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近。3) 溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高溫度的影響：對(duì)于蛋白質(zhì)、酶和多肽等生物大分子，在高離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升離子強(qiáng)度溶液或純水中蛋白質(zhì)的溶解度大多數(shù)還是隨溫度升高而增加的

33、。一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)高而增加的。一般情況下，可在室溫下進(jìn)行。但對(duì)于某些對(duì)溫度敏感的酶，要求在溫度敏感的酶，要求在04下操作，以避免活力喪失。下操作，以避免活力喪失。 322.有機(jī)溶劑沉淀法有機(jī)溶劑沉淀法基本原理基本原理 有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和有機(jī)溶劑對(duì)于許多蛋白質(zhì)（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的小分子生化物質(zhì)都能發(fā)生沉淀作用，是較早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：沉淀方法之一。其原理主要是： 降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶降低水溶液的介電常數(shù)，向溶液中加入有機(jī)溶劑能降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而劑能

34、降低溶液的介電常數(shù)，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)削弱了溶劑分子與蛋白質(zhì)分子間的相互作用力，導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。致蛋白質(zhì)溶解度降低而沉淀。 由于使用的有機(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谟捎谑褂玫挠袡C(jī)溶劑與水互溶，它們?cè)谌芙庥谒耐瑫r(shí)，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水水的同時(shí)，從蛋白質(zhì)分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作分子，破壞了蛋白質(zhì)分子的水膜，因而發(fā)生沉淀作用。用。33（2）有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)）有機(jī)溶劑沉淀法的優(yōu)點(diǎn)分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質(zhì)或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有

35、機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉淀。沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用沉淀不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的透析袋脫有機(jī)溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應(yīng)用。應(yīng)用。其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變其缺點(diǎn)是對(duì)某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。34（3）有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算）有機(jī)溶劑的選擇和濃度的計(jì)算 用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。用于生化制備的有機(jī)溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉淀蛋白質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀蛋白

36、質(zhì)和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。 為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積為了獲得沉淀而不著重于進(jìn)行分離，可用溶液體積的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)的倍數(shù)：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機(jī)溶劑，來進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。溶劑，來進(jìn)行有機(jī)溶劑沉淀。35（4）有機(jī)溶劑沉淀的影響因素）有機(jī)溶劑沉淀的影響因素 1) 溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在溫度：多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此必須預(yù)冷，操作要

37、在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)須預(yù)冷，操作要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑時(shí)必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。 一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。一般規(guī)律是溫度越低，得到的蛋白質(zhì)活性越高。 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省更大的有機(jī)溶劑進(jìn)行沉淀。高濃度樣品，可以節(jié)省有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作有機(jī)溶劑，減少變性的危險(xiǎn)，但雜蛋白的共沉淀作用大。用大。 通常使用通常使用5mg/mL20mg/mL的蛋白質(zhì)初濃度為的蛋白質(zhì)初濃度為宜。宜。 363) pH

38、值：選擇在樣品穩(wěn)定的值：選擇在樣品穩(wěn)定的pH值范圍內(nèi)，通常值范圍內(nèi)，通常是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能是選在等電點(diǎn)附近，從而提高此沉淀法的分辨能力。力。4) 離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，離子強(qiáng)度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以通常鹽濃度以不超過不超過5為宜，使用乙醇的量也以為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質(zhì)水溶液的不超過原蛋白質(zhì)水溶液的倍倍體積為宜，少量的體積為宜，少量的中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)變性有良好的保護(hù)作用，但鹽濃度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉度過高會(huì)增加蛋白質(zhì)在水中的溶解度，降低了沉淀效果，通常是在低濃

39、度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。淀效果，通常是在低濃度緩沖液中沉淀蛋白質(zhì)。 沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行沉淀所得的固體樣品，如果不是立即溶解進(jìn)行下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中下一步的分離，則應(yīng)盡可能抽干沉淀，減少其中有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。有機(jī)溶劑，以免影響樣品的生物活性。373.等電點(diǎn)沉淀法等電點(diǎn)沉淀法利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電利用具有不同等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，在達(dá)到電中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分中性時(shí)溶解度最低，易發(fā)生沉淀，從而實(shí)現(xiàn)分離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、

40、酶和核酸都是兩離的方法。氨基酸、蛋白質(zhì)、酶和核酸都是兩性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。性電解質(zhì)，可以利用此法進(jìn)行初步的沉淀分離。由于許多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в杏捎谠S多蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)十分接近，而且?guī)в兴さ牡鞍踪|(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，水膜的蛋白質(zhì)等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨不能完全沉淀析出，因此，單獨(dú)使用此法分辨率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀率較低，因而此法常與鹽析法、有機(jī)溶劑沉淀法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能法或其他沉淀劑一起配合使用，以提高沉淀能力和分離效果。力和分離效果。 此法主要用于在分離純化流程中

41、去除雜蛋白，此法主要用于在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用于沉淀目的物。而不用于沉淀目的物。38pH和離子強(qiáng)度對(duì)和離子強(qiáng)度對(duì)-乳球蛋白溶解度的影響乳球蛋白溶解度的影響394. 選擇性變性沉淀法選擇性變性沉淀法這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學(xué)性質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉質(zhì)等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉淀而得到分離提純。淀而得到分離提純。 熱變性熱變性 利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的利用生物大分子對(duì)熱的穩(wěn)定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉淀而

42、保留目的物在溶液中。生物大分子變性沉淀而保留目的物在溶液中。 表面活性劑和有機(jī)溶劑變性表面活性劑和有機(jī)溶劑變性使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。使那些對(duì)表面活性劑和有機(jī)溶劑敏感性強(qiáng)的雜蛋白變性沉淀。通常在冰浴或冷室中進(jìn)行。通常在冰浴或冷室中進(jìn)行。 選擇性酸堿變性選擇性酸堿變性 利用對(duì)利用對(duì)pH值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在值的穩(wěn)定性不同而使雜蛋白變性沉淀。通常是在分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟分離純化流程中附帶進(jìn)行的分離純化步驟。405. 有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物沉淀法有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類重要的沉淀劑，最早有機(jī)聚合物是六十年代發(fā)展起來的一類

43、重要的沉淀劑，最早應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛應(yīng)用于提純免疫球蛋白和沉淀一些細(xì)菌和病毒。近年來廣泛用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是用于核酸和酶的純化。其中應(yīng)用最多的是 “聚乙二醇聚乙二醇”【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n 4)】( Polyethylene Glycol 簡(jiǎn)寫為簡(jiǎn)寫為 PEG )，它的親水性強(qiáng)，溶干它的親水性強(qiáng)，溶干水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物水和許多有機(jī)溶劑，對(duì)熱穩(wěn)定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為大分子制備中，用的較多的是分子量為600020000的的 PEG。 本方法的優(yōu)點(diǎn)是：本方法的優(yōu)點(diǎn)是： 操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。 沉淀效能高，使用很少量的沉淀效能高，使用很少量的PEG即可以沉淀相當(dāng)多的生物即可以沉淀相當(dāng)多的生物大分子。大分子。 沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。沉淀后有機(jī)聚合物容易去除。416. 透析透析自自Thomas Graham 1861年發(fā)明透析方法至今已有年發(fā)明透析方法至今已有一百多年。一百多年。透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最透析已成為生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)室最簡(jiǎn)便最常用的分離純化技術(shù)之一常用的分離純化技術(shù)之一。在生物大分子的制備。在生物大分子的制備過程中，除鹽