重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化及陽性克隆的鑒定

1、1 材料E.coli JM109菌株2 儀器、用具超凈工作臺(tái)、離心機(jī)、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、培養(yǎng)皿、試管、1.5ml 離心管、電泳儀、電泳槽、凝膠樣品梳、移液器3 試劑(1 CaCl2、LB平板(見附錄;SOC培養(yǎng)基(見附錄;SOB培養(yǎng)基(2 RNase A1;Buffer S1;Buffer S2;Buffer S3;Buffer W1;無水乙醇的Buffer W2a(3 1×電泳緩沖液(TAE;溴化乙錠溶液(EB有毒,小心;瓊脂糖;6×加樣緩沖液(4 酚;氯仿;異戊醇(5 ddH2O;10×PCR Buffer (Mg2 plus;dNTP;M13 ;M13-

2、;TaKaRa rTaq酶4 方法1. 大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備(1 取大腸桿菌JM109保存液50l,接種于4ml LB(或SOB液體培養(yǎng)基中,37,300rpm 振蕩培養(yǎng)過夜,第二天取50l 轉(zhuǎn)接到新的4ml LB(或SOB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)3h至OD6 00=0.350.4,在無菌操作臺(tái)上取1ml菌液于1.5ml離心管中,冰浴10min。(2 4,5000rpm離心2min,去上清液。(3 加入750l預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸菌體,冰浴30min。(4 4,5000rpm離心2min,棄上清液。(5 加入100l 冰冷的0.1M CaCl2輕輕重懸菌體,冰浴2h后,4保存?zhèn)溆谩?

3、. 重組DNA的轉(zhuǎn)化(1 將含Amp、X-Gal、IPTG的LB平板37預(yù)熱。(2 于100l感受態(tài)細(xì)胞中加入10l連接產(chǎn)物,冰浴30min。(3 將離心管轉(zhuǎn)入42水浴,熱沖擊90秒,然后不要搖動(dòng)離心管,迅速將其放在冰上2min。(4 在離心管中加入SOC培養(yǎng)基300l,槍頭混勻,37、150rpm溫和搖振60min。(5 將200l 轉(zhuǎn)化菌液均勻地涂布于含50mg/ml Amp、20mg/ml X-gal、200mg/ml IPTG 的LB 平板上,37倒置培養(yǎng)過夜,挑選白色菌落進(jìn)行鑒定。注意事項(xiàng): 制備感受態(tài)細(xì)胞的全部操作均須于冰浴操作,同時(shí)注意近火無菌操作,防止感受態(tài)細(xì)胞受雜菌污染。 4

4、2熱處理時(shí)很關(guān)鍵,轉(zhuǎn)移速度要快,且溫度要準(zhǔn)確。 菌液涂皿操作時(shí),應(yīng)避免反復(fù)來回涂布,因?yàn)楦惺軕B(tài)細(xì)菌的細(xì)胞壁有了變化,過多的機(jī)械擠壓涂布會(huì)使細(xì)胞破裂,影響轉(zhuǎn)化率。3.重組質(zhì)粒的鑒定方案一菌落PCR(1 制備PCR混合液:(2 用經(jīng)滅菌的10l槍頭(不用牙簽挑去白色菌落,迅速地使挑取物溶在上述混合液中。(3 蓋上離心管得蓋子,在沸水上溫育10 min。(4 將步驟 的樣品冷卻至室溫,離心數(shù)秒,然后于管中加入TaKaRa rTaq酶0.25ul。(5 按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):94預(yù)變性3min;然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)反應(yīng),其溫度循環(huán)條件為:94變性1min,57退火1min,72 延伸1min;循環(huán)結(jié)

5、束后72再延伸5min。(6 取5l PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)。方案二質(zhì)粒PCR1. 堿裂解法少量制備質(zhì)粒DNA(1 用離心管收集4ml在LB培養(yǎng)基(含Amp中培養(yǎng)過夜的菌液,14000rpm離心30秒,棄盡上清。(2 用250l已加入RNase A1的Buffer S1充分懸浮細(xì)菌沉淀。(3 加入250l Buffer S2,溫和但充分地上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次,此步驟不宜超過5min。*Buffer S2使用后應(yīng)立即蓋緊瓶蓋,以免空氣中的CO2中和Buffer S2中的NaOH,降低溶菌效率。(4 加入400l Buffer S3,溫和地上下翻轉(zhuǎn)8-10次,室溫靜置2min,14000rpm離心10min。*若離心后凝結(jié)塊未沉淀到離心管底部,應(yīng)再上下翻轉(zhuǎn)數(shù)次,12000g離心3min。(5 將DNA-prep Tube置于2-ml Microfuge Tube中,將步中的混合液移入DNA-prep Tube 中,5500rpm離心1min。(6 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,加入500l Buffer W1, 5500rpm離心1min。(7 棄濾液,將DNA-prep Tube置回到原2-ml Microfuge Tube中,加入700l已加無水乙醇的Buffer W2,5500rpm離心1min