瘦肉精的檢測(cè)方法

1、瘦肉精的檢測(cè)方法1 測(cè)定原理“瘦肉精”克侖特羅競(jìng)爭(zhēng)酶標(biāo)免疫檢測(cè)方法快速測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。酶聯(lián)板的微孔包被有針對(duì)兔抗克侖特羅特異性抗體的羊抗體(第二抗體。加入兔抗克侖特羅特異性抗體(第一抗體與第二抗體結(jié)合而被固定,洗滌后加入標(biāo)準(zhǔn)液或樣品溶液與酶結(jié)合物(酶標(biāo)記抗原,標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中的游離抗原與酶標(biāo)抗原競(jìng)爭(zhēng)兔抗克侖特羅特異性抗體上有限的結(jié)合位點(diǎn)。通過(guò)洗滌除去沒(méi)有與特異性抗體結(jié)合的酶標(biāo)抗原,加入酶基質(zhì)(過(guò)氧化脲和發(fā)色劑(四甲基聯(lián)苯胺并孵育,結(jié)合到板上的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的底物。加酸終止反應(yīng)后,顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。在單波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度,吸收光強(qiáng)度與樣品中的克侖特羅濃度成反

2、比。2 試劑盒的組成每個(gè)盒中(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔材料如下:(11×96孔板(12排×8孔,包被有第二抗體(兔IgG抗體;(26個(gè)標(biāo)準(zhǔn)液(300ul/瓶為克侖特羅水溶液。濃度分別為0 ng/kg、100 ng/kg、300 ng/kg、900 ng/kg、2700 ng/kg、8100 ng/kg;(31個(gè)克侖特羅過(guò)氧物酶標(biāo)記物濃縮液12 ml(紅色帽;(41個(gè)克侖特羅抗體濃縮液12 ml(黑色帽;(51個(gè)酶基質(zhì)/發(fā)色劑11 ml(藍(lán)色帽;(61個(gè)反應(yīng)停止液,1 mol/L硫酸14 ml(黃色帽;(71個(gè)緩沖液25 ml,酶標(biāo)記物及抗體濃縮液稀釋用。3 試驗(yàn)材料3.1 設(shè)備微孔板

3、酶標(biāo)儀(450 nm、均質(zhì)器、冷凍離心機(jī)、離心管(50 ml、微量可調(diào)移液器(單道、八道、RIDAC18柱、濾紙(0.45m。3.2試劑甲醇(分析純、100%、50 mmol/LHCL、10 mmol/LHCL、50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0、500 mol/L 磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0、1 mol/LNaOH。4 儲(chǔ)存條件試劑盒保存于2-8,不要冷凍。不用的微孔板放進(jìn)原錫箔袋中并且與干燥劑一起重新密封。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無(wú)色的發(fā)色劑對(duì)光敏感,避免直接暴露在光線下。5 試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色劑有任何顏色表明已變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光值小于0.6時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。6 樣品處理

4、6.1尿樣尿樣一般不用處理,取20清亮尿樣直接測(cè)定。如果尿樣混濁要過(guò)濾或離心至得到清亮尿樣。6.2肝臟、肉樣粉碎的5 g樣品與25 ml 50 mmol/L HCL混合,振蕩1.5 h,以達(dá)到均質(zhì)的目的。稱6 g均質(zhì)物(相當(dāng)于1 g肝臟,加入離心管中。10-15條件下(非常重要4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。轉(zhuǎn)移上清液到另一個(gè)離心管中,加300l 1mol/L NaOH混合15 min。加入4 ml 500 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液(pH 3.0,簡(jiǎn)單混合并在4保存至少1.5 h或過(guò)夜(非常重要。10-15條件下(非常重要4000轉(zhuǎn)/min或更高的轉(zhuǎn)速離心15 min。分離

5、全部上清液(應(yīng)是清亮的,非常重要,使其升至室溫(20-24,然后用RIDAC18柱純化。RIDAC18柱純化樣品必須在室溫條件下(20-24,并嚴(yán)格控制過(guò)柱時(shí)流速。用3 ml甲醇洗滌柱子,控制流速為1滴/s。用2ml洗滌液(50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0,洗滌柱子。肝臟、肉樣的全部上清液進(jìn)柱,控制流速為1滴/4s。用2 ml洗滌液(50 mmol/L磷酸二氫鉀緩沖液pH 3.0,洗滌柱子,流速為1滴/s。用正壓除去殘留的流體并用空氣或氮?dú)獯? min,干燥柱子。用1 ml甲醇洗脫樣品,控制流速1滴/4s。在50-60并在弱空氣或氮?dú)饬飨峦耆舭l(fā)甲醇溶劑。用1 ml蒸餾水溶解干燥

6、的殘留物,取20l進(jìn)行分析。6.3飼料取10g飼料樣品,用10 mmol/LHCL溶解,連續(xù)震蕩10 min,用濾紙過(guò)濾,在濾液中加入120l 1mol/L NaOH 進(jìn)行中和,檢查pH,用NaOH控制PH值在6.5-7.5之間,取上清液20l進(jìn)行分析。稀釋倍數(shù)為25(即含有0.04 g飼料樣品/ml。7 測(cè)定步驟第一步:所有試劑及樣品在開始檢測(cè)前必須回升至室溫(20-24,測(cè)定操作在20-24下進(jìn)行。第二步:用盒中緩沖液以體積110的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅抗體濃縮液(黑色蓋,稀釋前輕輕混均抗體,不要猛烈振蕩。第三步:取出實(shí)驗(yàn)需要數(shù)量的微孔板條,足夠標(biāo)準(zhǔn)和樣品所用的數(shù)量,標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平

7、行試驗(yàn),記錄標(biāo)準(zhǔn)和樣品的位置。剩余的微孔板條放進(jìn)原錫箔袋中并且與提供的干燥劑一起重新密封,置于2-8冷藏。第四步:每個(gè)微孔中底部加100l稀釋后的抗體溶液,室溫(20-24孵育微孔板15 min,避免光線照射。第五步:孵育的同時(shí)進(jìn)行酶標(biāo)記物的稀釋,用盒中緩沖液以體積110的比例稀釋實(shí)際用量的克侖特羅酶標(biāo)記物濃縮液(紅色蓋,稀釋前輕輕混均抗體,不要猛烈振蕩,避光放置。第六步:洗板,甩出孔中液體,將微孔架倒置在吸水紙上拍打,直到紙上無(wú)明顯水跡(拍打3次,以保證完全除去孔中的液體。用250l蒸餾水充入孔中,再次甩掉微孔中液體,并在吸水紙上拍打,重復(fù)操作兩次。加洗滌水的移液器管尖必須置于微孔上方約0.

8、5 cm處打出洗滌水,避免將板孔中的游離抗體帶入洗滌水中。洗板后立即進(jìn)行下一步操作,不要讓板孔干燥。第七步:加入20l標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔底部,標(biāo)準(zhǔn)和樣品做兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。第八步:加入100l稀釋了的酶標(biāo)記物至微孔底部,輕輕震蕩微孔析并在桌面上作圓周運(yùn)動(dòng)以混勻。移液器管尖不要接觸到孔中的混合物,避免交叉污染。第九步:室溫孵育微孔板30 min,避免放置,盡可能每隔10 min輕輕振蕩1次,準(zhǔn)備好酶基質(zhì)/發(fā)色劑,并注意避光放置。第十步:洗板,同第六步。在洗板過(guò)程中加洗滌水的移液器置于微孔板上方0.5 cm處打出洗滌水,避免將板孔中的游離酶標(biāo)記物帶入洗滌水中。第十一步:不要讓板孔干燥,迅速加入100l酶基質(zhì)/發(fā)色劑到每個(gè)孔中,步驟操作要迅速,避免頭尾反應(yīng)時(shí)間相差過(guò)長(zhǎng),輕輕振蕩板并在桌面上作圓周運(yùn)動(dòng)以混勻。移液器管尖不要接觸微孔中的混合物,避免交叉污染。第十二步:室溫暗處孵育微孔板15 min,暗處避光放置,同時(shí)準(zhǔn)備好反應(yīng)停止液。第十三步:每孔加入100l反應(yīng)停止液,混勻,60 min內(nèi)用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm處波長(zhǎng)吸光度值。8 結(jié)果所獲得的標(biāo)準(zhǔn)和樣品吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度