兩種不同離心方法對臍血單個核細(xì)胞回收率的影響

1、兩種不同離心方法對臍血單個核細(xì)胞回收率的影響作者：羅偉瓊李沈容鄒翠賢羅小珍朱美玲【關(guān)鍵詞】臍血【摘要】目的探討不同離心條件下對臍血造血細(xì)胞回收率的影響。方法運(yùn)用6婿乙基淀粉（HES沉降，二次離心法可離心臍血濃縮單個核細(xì)胞（MNC），此法具有不受標(biāo)本體積大小的影響、無細(xì)菌污染的優(yōu)點(diǎn)。結(jié)果通過分析兩種離心方法發(fā)現(xiàn)制備MNC寸，離心力與MNC0收率有密切關(guān)系。結(jié)論加大離心力可增加MNC勺回收率?！娟P(guān)鍵詞】臍血;造血細(xì)胞/單個核細(xì)胞;離心法;回收率【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheeffectofdifferentcentrifugalmethodsonreturn

2、s-ratioofMononuclearcell（MNC）inumbilicalcordblood.MethodsAftersedimentatedwith6%hydroxyethylstarch（HES）,twocentrifugatingprocesseswasemployedtoseparateandconcentrateMNC,whichwasnotaffectedbyspecimenvolumeandnotpollutedbybacterium.ResultsTherewassignificantrelationshipbetweendifferentcentrifugalforce

3、andrecoveryrateofMNC.ConclusionRecoveryrateofMNCwillincreasebyincreasingcentrifugalforce.【Keywords】fetalblood;mononuclearcell;centrifugation;retrievingrate造血干細(xì)胞移植（HSCT已經(jīng)成為迄今為止醫(yī)治各種惡性血液病、腫瘤、遺傳性疾病、重度放射病及重癥聯(lián)合免疫缺陷等頑癥的最有效方法之一1,2,而采用臍血替代骨髓及外周血進(jìn)行HSCTE成為近10年來HSC擷域的最重大進(jìn)展之一2,3。最初的臍血HSCT使用的均為未經(jīng)分離的全血，這種全臍血移植雖然能減

4、少造血干/祖細(xì)胞的損耗，但因含有大量的紅細(xì)胞等成熟血細(xì)胞，不但給冷凍保存帶來困難，同時還可能會給移植病人造成嚴(yán)重的不良后果。因此，對臍血庫來講，高效快速分離臍血造血細(xì)胞，對單個核細(xì)胞（MNC進(jìn)行分離濃縮,最大限度地降低其終體積顯得尤為重要。這不僅涉及到盡量減低造血細(xì)胞的丟失問題，而且還牽涉到降低臍血庫庫容的成本問題。所以，探索出一種行之有效理想的分離方法就成了該領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。為此，筆者做了一些探索，現(xiàn)報告如下。1 材料與方法1.1 材料與儀器6%羥乙基淀粉（HES）購自美國Dupontpharma公司；無菌、無熱源，含有ACD呆養(yǎng)液三聯(lián)采血袋（長春泰爾茂醫(yī)用器具公司）;落地式低溫離心機(jī)（SO

5、RVALL-PC3pClus）;血細(xì)胞計數(shù)儀：2%冰醋酸結(jié)晶紫染色，計數(shù)有核細(xì)胞數(shù)。1.2 MNC的制備方法1.2.1 臍血來源40份臍血均無菌，采自深圳市寶安區(qū)西鄉(xiāng)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，均為足月產(chǎn)，胎兒無窒息。供者均為身體健康、發(fā)育良好的非高齡產(chǎn)婦。1.2.2 分離提取將采集的臍血留樣1ml用計數(shù)儀將MNCT數(shù)。參照紐約臍血庫操作規(guī)程4按6%HES臍血=1：5的比例加入，并充分混勻10min,兩次離心法。第一種方法以10430r/min離心6min做第一次離心；第二種方法以10c460r/min離心6min做第一次離心；利用三聯(lián)袋將上層富含MNC勺血漿及少許RB*入轉(zhuǎn)移袋內(nèi)，去除剩余的RBC再次以

6、10c1300r/min離心12min。去除上層血漿獲得臍血有核細(xì)胞懸液1822ml,留樣1ml計數(shù)MNC2 結(jié)果3 種離心轉(zhuǎn)速與離心時間見表1;兩種離心方法制備MNO得率的比較見表2。4 1表2(略)5 討論臍血與骨髓及外周血相比有諸多優(yōu)點(diǎn)57：富含更原始的造血細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)；可進(jìn)行HLA13個抗原不合的同胞或無關(guān)者的移植；單份臍血中的造血細(xì)胞量可滿足65%的兒童(<35kg)、25%體重較輕(<50kg)成人患者的移植需要；來源豐富，采集過程簡單，新生兒及產(chǎn)婦均無任何痛苦及不良反應(yīng)。從臍血中分離造血細(xì)胞是臍血庫進(jìn)行庫存臍血干細(xì)胞的必備程序，鑒于每份臍血采集的容

7、量有限，它所含的MNC勺數(shù)量也是有限的，況且新的資料研究顯示臍血移植的成功率與TNCMNC勺數(shù)量呈正相關(guān)8，因此臍血細(xì)胞分離的方法是建立高品質(zhì)臍血庫的關(guān)鍵技術(shù)之一；目前主要采用6%HE航降離心法分離。根據(jù)臍血中各種成分密度不同，經(jīng)不同離心力作用后可將血漿成分和血細(xì)胞成分中的紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及血小板分層、分離，提取所需要的成分9。MNC的密度為1.060,小于紅細(xì)胞的密度，臍血在HESM降后通過輕離心，使紅細(xì)胞團(tuán)向下沉降而推動白細(xì)胞向上運(yùn)動，達(dá)到分離的目的。本試驗(yàn)利用白細(xì)胞和紅細(xì)胞在沉降過程中的速度差異來實(shí)現(xiàn)分離。在離心時間不變的情況下加大離心力，紅細(xì)胞因快速沉降而導(dǎo)致周圍液體的向上運(yùn)動

8、，帶動白細(xì)胞的向上運(yùn)動，產(chǎn)生對流現(xiàn)象10，更有利于提高白細(xì)胞的回收率，增加MNC勺獲得率?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1 奚永志，唐佩弦.深入展開臍血干細(xì)胞的基礎(chǔ)與臨床研究.中華血液學(xué)雜志，1999，20（8）：397.2 RubinsteinP,CarrierC,ScaradavouA,etal.Outcomesamong562recipientsofplacental-bloodtransplantsfromunrelateddonors.NewEnglJMed,1998,339（22）:1565.3 奚永志，吳祖澤.積極穩(wěn)妥地建立和健全我國的臍血造血干細(xì)胞庫.中華醫(yī)學(xué)雜志，1999，79（11）：885

9、.4 RubinsteinP,DobrilaL,RosenfieldRE,etal.Processingandcryopreservationofplacental/umbilicalbordbloodforunrelatedbonemarrowreconstitution.ProcNatlAcadSciUSA,1995,92（22）:10119.5 SusanFL,EhzabethJR.Hematopoieticprogenitorcells.SeminarinHematology,1996,33:341-358.6 KoglerG,CallejasJ,SorgRV,etal.Theeffectofdifferentthawingmethods,growthfactorcombinationsandmediaontheexvivoexpansionofumbilicalcordbloodprimitiveandcommittedprogenitors.BoneMarrowTransplantation,1998,21:233-241.7 劉爽，奚永志.端粒/端粒酶系統(tǒng)與人類造血細(xì)胞.中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，1999，7：171-174.8 朱美玲，