轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟大攻略

1、轉(zhuǎn)染詳細(xì)步驟大攻略范例-真核重組表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-N1-NS1在A549細(xì)胞中表達(dá)按上海索萊寶生物科技有限公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行質(zhì)粒抽提，測(cè)得質(zhì)粒濃度為410.32ng/履將培養(yǎng)的A549細(xì)胞鋪板，待細(xì)胞密度長(zhǎng)到90%左右時(shí)，按lipo2000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，36h后于熒光顯微鏡下觀察DsRed-NS1融合蛋白的表達(dá)情況。具體操作步驟如下：1)質(zhì)粒準(zhǔn)備按上海索萊寶生物科技有限公司去內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行質(zhì)粒抽提，具體步驟如下：(1)取1-5ml細(xì)菌培養(yǎng)物，12000rpm離心1min,盡量吸除上清(菌液較多時(shí)可以通過(guò)多次離心將菌體沉淀收集到一個(gè)離心管中

2、)。(2)向留有菌體沉淀的離心管中加入200g容液P1(請(qǐng)先檢查是否已加入RNaseA),使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀。(注：如果菌塊未徹底混勻，會(huì)影響裂解導(dǎo)致質(zhì)粒提取量和純度偏低)(3)向離心管中加入200M溶液P2,溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解。(注：混勻一定要溫和，以免污染基因組DNA,此時(shí)菌液應(yīng)變得清亮粘稠，所用時(shí)間不應(yīng)超過(guò)5min,以免質(zhì)粒受到破壞)(4)向離心管中加入250d溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，此時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12000rpm離心10min,用移液器小心地將上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)干凈的離心管中，盡量不要吸出沉淀。(注：溶液P3加入

3、后應(yīng)立即混合，避免產(chǎn)生局部沉淀。如果上清中還有微小白色沉淀，可再次離心后取上清)(5)加入1/5體積冰預(yù)冷的去內(nèi)毒素消除劑，振蕩混勻，溶液變渾濁，冰浴2min至溶液變清亮。(6)37C水浴5min,不時(shí)振蕩，溶液又變渾濁。12000rpm室溫離心5min,溶液應(yīng)分為兩相，上層水相含質(zhì)粒DNA,下層油狀相含內(nèi)毒素。(7)將質(zhì)粒DNA上層水相轉(zhuǎn)移至新管，棄下層油狀相，注意不要吸入油狀相，重復(fù)抽提三次，即重復(fù)步驟5-7三次。(8)加入600d結(jié)合液，充分混勻后加入吸附柱中，室溫放置2min,12000rpm離心1min,倒掉收集管中得廢液。(如果一次加不完可分兩次加)(9)向吸附柱中加入700U漂洗

4、液(使用前請(qǐng)先檢查是否已加入無(wú)水乙醇)，12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。(10)向吸附柱中加入500d漂洗液，12000rpm離心1min,棄廢液，將吸附柱放回收集管中。(11)12000rpm離心2min,將吸附柱敞口置于室溫或50c溫箱放置數(shù)分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除，否則漂洗液中得乙醇會(huì)影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)如酶切、PCR等。(12)將吸附柱放入一干凈的離心管中，向吸附膜中間部位懸空滴加504-200囪65c水浴預(yù)熱的無(wú)內(nèi)毒素洗脫液，室溫放置5min,12000rpm離心1min。(12)為了增加質(zhì)粒的回收效率，可將得到的洗脫液重新加入吸附柱中，室溫放置5m

5、in,12000rpm離心1min。將得到的去內(nèi)毒素的真核表達(dá)質(zhì)粒測(cè)定質(zhì)粒濃度，分裝標(biāo)記后，4C保存?zhèn)溆谩?)細(xì)胞培養(yǎng)與接種將A549細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清FBS、含雙抗(100U/ml青霉素和100ml鏈霉素)的1640(Solarbio)培養(yǎng)基中，于37C、5%CO3培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度大約70%-80%時(shí)，吸去培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的舊培養(yǎng)液。用無(wú)菌PBS緩沖液(0.4gKCl,0.4gKH2PO4,16gNaCl,3.12gNa2HPO4.7H2O,融解在2L雙蒸水中)漂洗細(xì)胞兩次，吸去漂洗液。將1mL胰酶(37C水浴)加入培養(yǎng)瓶中，消化2-5min于顯微鏡下觀察至細(xì)胞變圓后倒掉，吸去殘留胰

6、酶，加入3ml完全培養(yǎng)基，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞(盡量避免大量氣泡產(chǎn)生)，使之從瓶壁脫離形成細(xì)胞懸液。用移液槍吸取100ul吹打后的細(xì)胞懸液于EPt中，加入900ul培養(yǎng)基與之混合，混合均勻后取10u沿蓋玻片的邊緣滴加到細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，置于顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞接種密度。鋪板后置于顯微鏡下觀察，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)板使之細(xì)胞分散均勻，室溫放置片刻放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染以下轉(zhuǎn)染操作以12孔板為例。轉(zhuǎn)染全過(guò)程于細(xì)胞間嚴(yán)格無(wú)菌操作。(1)轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)(使其在大約24小時(shí)后轉(zhuǎn)染前密度達(dá)到90%左右為官)，將細(xì)胞鋪板在1ml含血清，不含抗生素的正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。(2)對(duì)于每孔細(xì)胞，使用100

7、仙比血清培養(yǎng)基(1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基)稀釋1.6仙鼓粒，輕輕混勻后于室溫放置5min。（3）對(duì)于每孔細(xì)胞，使用100口無(wú)血清培養(yǎng)基（1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基）稀釋4屋Lipofectamine2000試劑。輕輕混勻后于室溫放置5min。將步驟2和步驟3的溶液混合，輕輕混勻后于室溫靜置20min。（5）同時(shí)，將12孔板中的細(xì)胞用PBS沖洗細(xì)胞一遍后，再用無(wú)血清培養(yǎng)基（1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基）沖洗一遍后，加入1ml無(wú)血清培養(yǎng)基。（6）將步驟4的復(fù)合物加入到每孔中，搖動(dòng)培養(yǎng)板，輕輕混勻。置于37C,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h0（7）6h后，將無(wú)血清培養(yǎng)基更換為含有血清的培養(yǎng)基（即10%胎牛血清+90%1640基

8、礎(chǔ)培養(yǎng)基），繼續(xù)孵育24-96小時(shí)于熒光顯微鏡下檢測(cè)結(jié)果。他山之石：昨天做了一次轉(zhuǎn)染，用的是英俊的脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑（剛買(mǎi)不到3個(gè)月），轉(zhuǎn)染成纖維細(xì)胞（通過(guò)原代分離培養(yǎng)的，但是不是很純有其他細(xì)胞），6孔板細(xì)胞量，轉(zhuǎn)EGFP質(zhì)粒（質(zhì)粒沒(méi)有問(wèn)題，因?yàn)樵趧e的細(xì)胞轉(zhuǎn)染試過(guò)好用），按照說(shuō)明書(shū)的比例質(zhì)粒加4微克，轉(zhuǎn)染試劑加10微升，轉(zhuǎn)染復(fù)合物共500微升，孵育20分鐘后，加到用PBS清洗兩遍的6孔板中，補(bǔ)加500微升無(wú)血清和雙抗的DMEM培養(yǎng)基，37二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)，5小時(shí)換液時(shí)發(fā)現(xiàn)：許多細(xì)胞出現(xiàn)嚴(yán)重的凋亡現(xiàn)象，細(xì)胞呈扁平放射狀，放射的突出有分叉，像樹(shù)枝一樣，看樣子像是死了！不知道細(xì)胞還能不能活過(guò)來(lái)

9、，所以5小時(shí)換液換成含血清不含雙抗的DMEM培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，結(jié)果今天早上發(fā)現(xiàn)細(xì)胞全死了！太傷心了！以前也做過(guò)這種轉(zhuǎn)染，有時(shí)也會(huì)出現(xiàn)細(xì)胞死的很?chē)?yán)重的現(xiàn)象，有時(shí)就很好，曾經(jīng)嘗試在4-6小時(shí)轉(zhuǎn)染的過(guò)程中加少量的血清，但作用好像不大！是不是我的細(xì)胞有問(wèn)題呢？請(qǐng)各位高手幫我分析一下原因唄謝謝了！可能細(xì)胞有差異吧，我也用lip2000轉(zhuǎn)染白15小時(shí)以后換不含抗生素的DMEM,細(xì)胞狀態(tài)很好，元代細(xì)胞比較嬌嫩謝明kiss9499的回答！你用的也是lip2000的比例轉(zhuǎn)染的嗎？我想問(wèn)下轉(zhuǎn)染細(xì)胞效率怎么樣呢？我以前轉(zhuǎn)染成功過(guò)，但是效率不是很高！謝謝！好像lipo的說(shuō)明書(shū)中不建議使用含抗生素的培養(yǎng)液。專(zhuān)門(mén)找了一下，

10、是不能用含抗生素的培養(yǎng)液，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。我現(xiàn)在是連正常培養(yǎng)的細(xì)胞都沒(méi)有加，注意無(wú)菌操作就行了。要求轉(zhuǎn)染過(guò)程中無(wú)血清、無(wú)抗生素。ImportantGuidelinesforTransfection U5尸divpriKvdur?onpjge2totransfectcell,withrhortinterferingRNA(siRNA)orStealthRNAL Uretheprocedureonpage3to門(mén)口7怙ltcelkwithplasmidDNA. WerecommendOpti-MEM11ReducedSerumMedium(CatNd3185-062)kdiluteLipofecM

11、miner2000nndnutleicacidsbeforecomplexing, Donotaddantibioticstomediaduringtransfectionasthiscausescelldeath. Maintaintliesameseedingconditionsbphveenexpein】pnts.不知道轉(zhuǎn)入的基因是否會(huì)引起細(xì)胞調(diào)亡。另外建議降低lipfectamin的濃度試試看，我們研究室很多人都不用說(shuō)明書(shū)推薦的用量的，經(jīng)常是推薦用量的1/4。用量高，細(xì)胞毒性也高，細(xì)胞容易死。我也遇到過(guò)此類(lèi)情況，用量改為1/4就ok啦?？股匚覀兊故遣惶谝?，轉(zhuǎn)染的時(shí)候不加，但是5個(gè)小

12、時(shí)換液后培養(yǎng)一直都加的，沒(méi)啥關(guān)系。我轉(zhuǎn)過(guò)的成纖維細(xì)胞是3T3,不知道是不是我的目的基因問(wèn)題，用說(shuō)明書(shū)用量細(xì)胞會(huì)死，但是用1/4的話(huà)完全順利進(jìn)行。還有轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度不要太低，否則會(huì)引起細(xì)胞死亡。兄弟，在轉(zhuǎn)染之前最好是用無(wú)抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)12小時(shí)，然后再進(jìn)行轉(zhuǎn)染。謝謝大家的回答，在此十分感謝！我看到有的帖子說(shuō)原代的細(xì)胞對(duì)血清很敏感，是不是轉(zhuǎn)染過(guò)程中（尤其是4-6小時(shí)）會(huì)造成細(xì)胞死亡呢！我以前用過(guò)PK15細(xì)胞做轉(zhuǎn)染對(duì)照試驗(yàn)，一個(gè)在4-6小時(shí)轉(zhuǎn)染過(guò)程中加血清，一個(gè)不加，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞都很好，而且轉(zhuǎn)染效率也沒(méi)有差別，至少證明在這種細(xì)胞中加不加血清不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率，但對(duì)于原代的成纖維細(xì)胞，我就不知道應(yīng)不

13、應(yīng)該在轉(zhuǎn)染過(guò)程中加血清了！好像在園子里看到過(guò)，一位老兄的原代細(xì)胞轉(zhuǎn)染，他是給的5%的血清，細(xì)胞狀態(tài)還好?？梢栽囋嚢?！按照l(shuí)ipo的說(shuō)明書(shū)，血清的影響應(yīng)該不是很大。但是轉(zhuǎn)染過(guò)程中抗生素是必須去除的。Lipo2000,6孔板推薦使用量是10ul。但不同細(xì)胞對(duì)lipo和質(zhì)粒的耐受不同，我們一般減半使用兩者，即使這樣腫瘤細(xì)胞還是死亡不少，更何況你的細(xì)胞是正常細(xì)胞株，耐受力肯定沒(méi)有腫瘤細(xì)胞大。建議使用不同的lipo濃度，如推薦量的1/2或1/4等，觀察轉(zhuǎn)染效率，選擇效率好，細(xì)胞死亡少的量。血清對(duì)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒影響不大，如果不用，可能會(huì)提高轉(zhuǎn)染效率。同意樓上：轉(zhuǎn)染過(guò)程中抗生素是必須去除的。如果質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率還行

14、，可以減少lipo的加入量，另外，先在孔板中加入培養(yǎng)液，再一滴滴緩慢分散加入lipo可以減少細(xì)胞的死亡。問(wèn)題一：已經(jīng)討論過(guò)了，轉(zhuǎn)染前48小時(shí)一定不可用抗生素。問(wèn)題二：轉(zhuǎn)染時(shí)要求細(xì)胞狀態(tài)非常好，細(xì)胞要經(jīng)受lipo2000的毒性和外源基因?qū)腚p重打擊。問(wèn)題三：稀釋質(zhì)粒和lipo2000需要OPTIMEM,同時(shí)還要用1mlOPTIMEM去鋪底盡量不要用DMEM。問(wèn)題四：轉(zhuǎn)染過(guò)程必須無(wú)血清，4-6小時(shí)候方可換全培另外轉(zhuǎn)染混合物要充分混勻。我最近也在做雞胚成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)染，也遇到這樣的問(wèn)題，我用的是24空板，細(xì)胞傳到第三代時(shí)轉(zhuǎn)染，但一加脂質(zhì)體細(xì)胞就明顯出現(xiàn)死亡，到48小時(shí)時(shí)測(cè)熒光，結(jié)果轉(zhuǎn)染效率很低，只有幾個(gè)光點(diǎn)，請(qǐng)問(wèn)各位該怎么解決呢？也查了資料，說(shuō)原代細(xì)胞對(duì)