干細胞研究進展講稿課件

1、干細胞研究進展講稿干細胞研究進展干細胞研究進展組胚：郭雨霽第一頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿1981年年Evans等成功地建立了小鼠的等成功地建立了小鼠的ESC系；系；1995年年Thompson等建立了第一株靈長類動物的等建立了第一株靈長類動物的ESC系；系；1998年年11月，美國威斯康星大學(xué)的科學(xué)家在美國月，美國威斯康星大學(xué)的科學(xué)家在美國科學(xué)科學(xué)雜志報告說，他們雜志報告說，他們已成功地使人類胚胎干細胞在體外生長和增殖已成功地使人類胚胎干細胞在體外生長和增殖(zngzh)；1999年年12月，干細胞研究進展被月，干細胞研究進展被科學(xué)科學(xué)雜志評選為該年度世界十大科雜志評選為該年度世界十大

2、科學(xué)進展之首學(xué)進展之首; 1999年年12月，美國科學(xué)家在月，美國科學(xué)家在美國科學(xué)院院刊美國科學(xué)院院刊報告說，小鼠肌肉組織的成體干細報告說，小鼠肌肉組織的成體干細胞可以胞可以“橫向分化橫向分化”為血液細胞。隨后，世界各國的科學(xué)家相繼證實，成體干細胞，為血液細胞。隨后，世界各國的科學(xué)家相繼證實，成體干細胞，包括人類的成體干細胞具有可塑性包括人類的成體干細胞具有可塑性;2001年末年末,干細胞研究又被其列為六大熱門科技領(lǐng)域之首干細胞研究又被其列為六大熱門科技領(lǐng)域之首;干細胞的話題沸沸揚揚地充斥干細胞的話題沸沸揚揚地充斥(chngch)(chngch)在全球各種新聞媒體在全球各種新聞媒體第二頁，共四

3、十五頁。干細胞研究進展講稿2001年年4月，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽取的脂肪中，含有月，美國科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，從病人臀部和大腿處抽取的脂肪中，含有(hn yu)大量類似干細胞的細大量類似干細胞的細胞，這些細胞可以發(fā)育成健康的軟骨和肌肉等。胞，這些細胞可以發(fā)育成健康的軟骨和肌肉等。 2006年兩項研究成果標(biāo)志著干細胞技術(shù)正從一種概念，轉(zhuǎn)變成能夠看得見的事實：年兩項研究成果標(biāo)志著干細胞技術(shù)正從一種概念，轉(zhuǎn)變成能夠看得見的事實： 美國科學(xué)家利用胚胎干細胞所衍生的運動神經(jīng)元讓癱瘓的老鼠恢復(fù)了行走能力；美國科學(xué)家利用胚胎干細胞所衍生的運動神經(jīng)元讓癱瘓的老鼠恢復(fù)了行走能力； 英國科學(xué)家從胚胎干細胞中

4、培育出來的精子，并使之與卵細胞結(jié)合，生育出幼鼠。英國科學(xué)家從胚胎干細胞中培育出來的精子，并使之與卵細胞結(jié)合，生育出幼鼠。2010年年1月韓國月韓國朝鮮日報朝鮮日報報道，韓國建國大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教授利用人類臍帶血干細胞成功治愈報道，韓國建國大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院教授利用人類臍帶血干細胞成功治愈了脊髓受傷導(dǎo)致兩條后腿癱瘓的狗。了脊髓受傷導(dǎo)致兩條后腿癱瘓的狗。 分離和體外培養(yǎng)各種來源的干細胞的技術(shù)不斷成熟分離和體外培養(yǎng)各種來源的干細胞的技術(shù)不斷成熟,更是引發(fā)了新一輪的干細胞研究熱潮。更是引發(fā)了新一輪的干細胞研究熱潮。 美國加州每年提供干細胞研究經(jīng)費達美國加州每年提供干細胞研究經(jīng)費達3億美元。我國的干細胞研究也很活

5、躍，億美元。我國的干細胞研究也很活躍，“863”計劃近期將為計劃近期將為干細胞研究提供干細胞研究提供2億元人民幣的經(jīng)費。億元人民幣的經(jīng)費。2000年日本啟動年日本啟動“千年世紀(jì)工程千年世紀(jì)工程”，干細胞工程為核心技，干細胞工程為核心技術(shù)的再生醫(yī)療成為這項工程的四大重點之一，第一年度投資金額達術(shù)的再生醫(yī)療成為這項工程的四大重點之一，第一年度投資金額達108億日元。億日元。 第三頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿到底干細胞是什么東西，為何會受到如此到底干細胞是什么東西，為何會受到如此(rc)的關(guān)注？的關(guān)注？干細胞是潛力無窮？還是被我們過度期待？干細胞是潛力無窮？還是被我們過度期待？干細胞干細胞（s

6、tem cells）是一類能夠進行自我更新是一類能夠進行自我更新（self-renew）和尚未分化和尚未分化 （un-differentiated具有分化潛能具有分化潛能(qin nn)）的細胞的細胞；可以分化為多種組成人體的組織或器官的細胞類型可以分化為多種組成人體的組織或器官的細胞類型。第四頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿自然存在自然存在(cnzi)的各種干細胞的各種干細胞多能多能(du nn)(pluripotent)干細干細胞胞( (胚胎干細胞、胚胎生殖細胞胚胎干細胞、胚胎生殖細胞) )單能單能(unipotent)干細胞干細胞( (成體干細胞成體干細胞) )造血造血(zo xu)干

7、細胞干細胞其他組織特異性干細胞其他組織特異性干細胞（神經(jīng)、肺部干細胞等）（神經(jīng)、肺部干細胞等）特化細胞特化細胞紅細胞紅細胞 血小板血小板 白細胞白細胞全能全能(totipotent)干細胞干細胞 ( (受精卵受精卵) )第五頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿The fertilized ovum is the origin of the life.第六頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿滋養(yǎng)層滋養(yǎng)層胎盤及胎兒胎盤及胎兒的附屬結(jié)構(gòu)的附屬結(jié)構(gòu)第七頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿卵黃卵黃(lunhung)囊尾側(cè)壁上的內(nèi)胚層細胞是原始生殖細胞的發(fā)源地。囊尾側(cè)壁上的內(nèi)胚層細胞是原始生殖細胞的發(fā)源地。后經(jīng)

8、腸系膜遷移至生殖腺嵴。后經(jīng)腸系膜遷移至生殖腺嵴。第八頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 多能干細胞多能干細胞pluripotent stem cells： a、來源：胚胎干細胞來源：胚胎干細胞內(nèi)細胞群細胞內(nèi)細胞群細胞 胚胎生殖細胞胚胎生殖細胞原始生殖細胞原始生殖細胞 b、特點：可進行克隆性增殖而不發(fā)生分化，保持二特點：可進行克隆性增殖而不發(fā)生分化，保持二 倍體核型不變；倍體核型不變； 具有多向分化的潛能具有多向分化的潛能(qin nn)，在特定條件下可誘，在特定條件下可誘 導(dǎo)分化為三個導(dǎo)分化為三個 胚層來源的所有組織細胞；胚層來源的所有組織細胞； 失去了發(fā)育形成生物個體的能力。失去了發(fā)育形成生

9、物個體的能力。 c、多分化潛能性的實驗證據(jù)：嵌合體實驗多分化潛能性的實驗證據(jù)：嵌合體實驗 畸胎瘤實驗畸胎瘤實驗 類胚體實驗類胚體實驗第九頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 單能干細胞單能干細胞unipotent stem cells： 成體干細胞成體干細胞/組織特異性干細胞組織特異性干細胞 a、特征：能自我復(fù)制特征：能自我復(fù)制,有分化潛能有分化潛能,但只能分化為所在但只能分化為所在 組織的功能細胞。組織的功能細胞。 b、存在部位：骨髓存在部位：骨髓( su),周圍血液周圍血液,腦腦,脊髓脊髓,血管血管,骨骼肌骨骼肌,表皮表皮, 消化管消化管,角膜角膜,視網(wǎng)膜視網(wǎng)膜,肝肝,胰等胰等 c、可塑性：

10、橫向分化可塑性：橫向分化 特化細胞特化細胞specialized cells： 具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)、分子標(biāo)記和功能，不能進行分化。具有特定形態(tài)結(jié)構(gòu)、分子標(biāo)記和功能，不能進行分化。橫向分化橫向分化(fnhu)：通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。部通常情況下，供體的干細胞在受體中分化為與其組織來源一致的細胞。部分干細胞在特定條件下可以轉(zhuǎn)化為其它胚層來源的細胞，如肌肉干細胞在分干細胞在特定條件下可以轉(zhuǎn)化為其它胚層來源的細胞，如肌肉干細胞在特定條件下可以分化為各種血細胞等。特定條件下可以分化為各種血細胞等。1999年年Goodell等人分離出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)等人分離

11、出小鼠的肌肉干細胞，體外培養(yǎng)5天后，與天后，與少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植少量的骨髓間質(zhì)細胞一起移植(yzh)入接受致死量輻射的小鼠中，入接受致死量輻射的小鼠中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞。結(jié)果發(fā)現(xiàn)肌肉干細胞會分化為各種血細胞。第十頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿ESC和成體和成體(chn t)干細胞的異同干細胞的異同相同點：都具有干細胞的自我復(fù)制和分化相同點：都具有干細胞的自我復(fù)制和分化(fnhu)能力，都有能力，都有“歸巢歸巢”現(xiàn)象。現(xiàn)象。第十一頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿干細胞是一類能夠進行干細胞是一類能夠進行自我更新自我更新和和具有分化潛能具有分化潛能的細胞的細胞 （具

12、有分裂增殖能力，干細胞本身不是處于分化途徑的終（具有分裂增殖能力，干細胞本身不是處于分化途徑的終 端）。端）。干細胞通過兩種方式生長干細胞通過兩種方式生長 *對稱分裂對稱分裂-形成兩個相同的干細胞形成兩個相同的干細胞 *不對稱分裂不對稱分裂-由于細胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分由于細胞質(zhì)中的調(diào)節(jié)分化蛋白不均勻地分配，使得一個配，使得一個(y )子細胞不可逆的走向分化的終端成為子細胞不可逆的走向分化的終端成為功能專一的分化細胞；另一個保持親代的特征，仍功能專一的分化細胞；另一個保持親代的特征，仍作為干細胞保留下來。作為干細胞保留下來。干細胞的共同干細胞的共同(gngtng)特征特征干細胞增殖干細

13、胞增殖(zngzh)的緩慢性的緩慢性干細胞增殖的自穩(wěn)性干細胞增殖的自穩(wěn)性區(qū)別于腫瘤細胞的本質(zhì)性特征。區(qū)別于腫瘤細胞的本質(zhì)性特征。 有利于其對特定的外界信號有利于其對特定的外界信號做出反應(yīng)，以決定是進入增做出反應(yīng)，以決定是進入增殖還是進入分化程序，同時殖還是進入分化程序，同時有利于減少干細胞內(nèi)基因突有利于減少干細胞內(nèi)基因突變的危險。變的危險。 第十二頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 研究干細胞增殖和分化機制的最終目的是應(yīng)用干細胞治療研究干細胞增殖和分化機制的最終目的是應(yīng)用干細胞治療疾病。理論上講，干細胞可以用于許多疾病的治療，像帕金疾病。理論上講，干細胞可以用于許多疾病的治療，像帕金森氏病、糖

14、尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是森氏病、糖尿病、心肌梗死、肝功能衰竭等。就是(jish)干細干細胞的這種潛在的價值引起了各國學(xué)者的研究興趣。胞的這種潛在的價值引起了各國學(xué)者的研究興趣。干細胞的應(yīng)用干細胞的應(yīng)用(yngyng)第十三頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 胚胎干細胞胚胎干細胞embryonic stem cells 干細胞相關(guān)干細胞相關(guān)(xinggun)技術(shù)：克隆技術(shù)：克隆clone 轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)transgenic technology 成體干細胞：神經(jīng)干細胞成體干細胞：神經(jīng)干細胞neural stem cells 肺干細胞肺干細胞pulmonary stem cells

15、 誘導(dǎo)型多能干細胞誘導(dǎo)型多能干細胞induced pluripotent stem cell主主 要要 內(nèi)內(nèi) 容容第2周第3周第十四頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿胚胎干細胞（胚胎干細胞（embryonic stem cell, ESC）是從早期胚胎的）是從早期胚胎的 內(nèi)細內(nèi)細胞團中分離出來的一種高度未分化、具有多向分化潛能的細胞。胞團中分離出來的一種高度未分化、具有多向分化潛能的細胞。1981年年Evans等從囊胚的內(nèi)細胞群中成功分離、建立了小鼠的等從囊胚的內(nèi)細胞群中成功分離、建立了小鼠的ESC系系1998年年Thomson和和Gearhart分別用胚泡內(nèi)細胞團細胞和原始生殖細分別用胚泡內(nèi)

16、細胞團細胞和原始生殖細胞成功地建立了人的胞成功地建立了人的ESC系系 在全球范圍內(nèi)掀起在全球范圍內(nèi)掀起(xinq)了了ESC的研究熱潮。的研究熱潮。胚胎胚胎(piti)干細胞干細胞 ESC的體外培養(yǎng)建系的體外培養(yǎng)建系 定向定向(dn xin)誘導(dǎo)分化誘導(dǎo)分化 在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用在生物醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第十五頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 早期小鼠胚胎的獲得早期小鼠胚胎的獲得： 受精后第受精后第4天上午，取出孕子宮，將輸卵管端夾閉，由陰道端插入天上午，取出孕子宮，將輸卵管端夾閉，由陰道端插入5號針頭注入號針頭注入沖胚液，至宮腔達到一定壓力，突然松開輸卵管側(cè)，即可獲得發(fā)育至囊胚期的早期胚沖胚液，至宮

17、腔達到一定壓力，突然松開輸卵管側(cè)，即可獲得發(fā)育至囊胚期的早期胚胎。選取胎。選取(xunq)發(fā)育良好的囊胚接種在發(fā)育良好的囊胚接種在飼養(yǎng)層細胞飼養(yǎng)層細胞上。上。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離(fnl)培養(yǎng)培養(yǎng)ESC子宮子宮(zgng)第十六頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 小鼠早期胚胎的體外培養(yǎng)小鼠早期胚胎的體外培養(yǎng)-飼養(yǎng)層：飼養(yǎng)層： 飼養(yǎng)層細胞的作用飼養(yǎng)層細胞的作用(zuyng)： 培養(yǎng)的鼠胚成纖維細胞經(jīng)絲裂霉素培養(yǎng)的鼠胚成纖維細胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，可用作飼養(yǎng)層細胞。處理后，可用作飼養(yǎng)層細胞。 飼養(yǎng)層細胞經(jīng)絲裂霉素飼養(yǎng)層細胞經(jīng)絲裂霉素C處理后，雖然失去分裂能力，但仍然

18、保持生存活性，并為胚胎干細胞的存活、增殖和未處理后，雖然失去分裂能力，但仍然保持生存活性，并為胚胎干細胞的存活、增殖和未分化狀態(tài)的維持提供一些必需因子，還可去除培養(yǎng)環(huán)境中的毒素和代謝抑制因子。分化狀態(tài)的維持提供一些必需因子，還可去除培養(yǎng)環(huán)境中的毒素和代謝抑制因子。 飼養(yǎng)層細胞的處理方法如下：飼養(yǎng)層細胞的處理方法如下： 取取P12-16的孕鼠，剖腹取胚胎，去除頭、四肢、內(nèi)臟后，的孕鼠，剖腹取胚胎，去除頭、四肢、內(nèi)臟后，Hanks液反復(fù)沖洗，剪碎鼠液反復(fù)沖洗，剪碎鼠胚組織，胰酶消化成單細胞懸液，接種，即為原代培養(yǎng)鼠胚成纖維細胞。將原培養(yǎng)液棄去，加入胚組織，胰酶消化成單細胞懸液，接種，即為原代培養(yǎng)鼠

19、胚成纖維細胞。將原培養(yǎng)液棄去，加入含含10g/ml絲裂霉素絲裂霉素C的培養(yǎng)液作用的培養(yǎng)液作用2-4h，然后胰酶消化制成單細胞懸液，接種在四孔，然后胰酶消化制成單細胞懸液，接種在四孔板中備用。板中備用。 從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離(fnl)培養(yǎng)培養(yǎng)ESC第十七頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 小鼠早期胚胎小鼠早期胚胎(piti)的體外培養(yǎng)：的體外培養(yǎng)：從小鼠囊胚的內(nèi)細胞從小鼠囊胚的內(nèi)細胞(xbo)群中分離培養(yǎng)群中分離培養(yǎng)ESC第十八頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿ESC的分離培養(yǎng)的分離培養(yǎng)： 待小鼠囊胚貼壁，并從透明帶中孵出后，在顯微操作儀下分離內(nèi)細胞團，待小鼠囊胚

20、貼壁，并從透明帶中孵出后，在顯微操作儀下分離內(nèi)細胞團，吸出內(nèi)細胞團，用胰酶消化，將其離散成小的細胞團塊，接種于新的吸出內(nèi)細胞團，用胰酶消化，將其離散成小的細胞團塊，接種于新的鋪有鋪有飼養(yǎng)層細胞飼養(yǎng)層細胞的四孔的四孔(s kn)板中。一周后即可出現(xiàn)板中。一周后即可出現(xiàn)ESC集落。集落。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞從小鼠囊胚的內(nèi)細胞(xbo)群中分離培養(yǎng)群中分離培養(yǎng)ESC第十九頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的分離培養(yǎng)的分離培養(yǎng)-飼養(yǎng)層飼養(yǎng)層： ESC體外培養(yǎng)的條件非常嚴(yán)格，為了維持體外培養(yǎng)的條件非常嚴(yán)格，為了維持ESC的未分化狀態(tài)的未分化狀態(tài)(zhungti)， 在在體外培養(yǎng)過程中，必須有飼養(yǎng)層

21、或其它分化抑制劑的支持，體外培養(yǎng)過程中，必須有飼養(yǎng)層或其它分化抑制劑的支持， 適宜的飼養(yǎng)層培養(yǎng)體適宜的飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系是系是ESC體外培養(yǎng)擴增的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。體外培養(yǎng)擴增的一個關(guān)鍵環(huán)節(jié)。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離(fnl)培養(yǎng)培養(yǎng)ESC原代鼠胚成纖維細胞原代鼠胚成纖維細胞（primary mouse embryonic fibroblast， PMEF）以其易于取材、分化抑制效果好等特點而被廣泛應(yīng)用。以其易于取材、分化抑制效果好等特點而被廣泛應(yīng)用。目前常用的飼養(yǎng)層有：目前常用的飼養(yǎng)層有：STO（SIM小鼠成纖維細胞株，并為抗硫小鼠成纖維細胞株，并為抗硫 代鳥嘌呤代鳥嘌呤

22、6-thioguanine和鳥本箭毒素甙鳥巴因和鳥本箭毒素甙鳥巴因oualiain選擇過的選擇過的 細胞細胞）、PMEF(原代培原代培養(yǎng)鼠胚成纖維細胞養(yǎng)鼠胚成纖維細胞)、SNL(G418R基因基因(jyn)和和 LIF基因轉(zhuǎn)染的基因轉(zhuǎn)染的STO）、HBC-5637等。等。隨著對人隨著對人ESC研究的深入，來源于人研究的深入，來源于人ESC的組織器官可望用于的組織器官可望用于 臨床。在體外臨床。在體外培養(yǎng)人培養(yǎng)人ESC時多使用時多使用PMEF作為飼養(yǎng)層，這樣在作為飼養(yǎng)層，這樣在 ESC用于臨床治療時，可用于臨床治療時，可能帶來鼠源性蛋白的污染而引起不良能帶來鼠源性蛋白的污染而引起不良 反應(yīng)，所以

23、有人嘗試?yán)梅磻?yīng)，所以有人嘗試?yán)萌伺咛コ扇伺咛コ衫w維細胞纖維細胞作飼養(yǎng)層進行人作飼養(yǎng)層進行人 ESC的培養(yǎng)，并已有成功的報道。的培養(yǎng)，并已有成功的報道。 飼養(yǎng)層細胞的抑分化功能來源于基質(zhì)中的白血病抑制因子飼養(yǎng)層細胞的抑分化功能來源于基質(zhì)中的白血病抑制因子（leukemia inhibiting factor, LIF），LIF最早于最早于1988年在小鼠年在小鼠Krebs腹水瘤細胞條件培腹水瘤細胞條件培養(yǎng)基中被純化的，是一種典型的多功能細胞因子。如：抑制骨髓白血病養(yǎng)基中被純化的，是一種典型的多功能細胞因子。如：抑制骨髓白血病 m1細胞細胞的增殖，誘導(dǎo)其向巨噬細胞方向分化；促進外周膽堿能神經(jīng)分

24、化和功能成熟；刺的增殖，誘導(dǎo)其向巨噬細胞方向分化；促進外周膽堿能神經(jīng)分化和功能成熟；刺激破骨細胞增殖；調(diào)節(jié)肝細胞急性期反應(yīng)蛋白的合成；激破骨細胞增殖；調(diào)節(jié)肝細胞急性期反應(yīng)蛋白的合成；抑制多能胚胎干細胞抑制多能胚胎干細胞的分化的分化等。等。 有學(xué)者向有學(xué)者向ESC培養(yǎng)基中加入培養(yǎng)基中加入LIF以取代飼養(yǎng)層細胞，輔以條件培養(yǎng)基以取代飼養(yǎng)層細胞，輔以條件培養(yǎng)基即可維持即可維持ESC的多能性，從而消除飼養(yǎng)層細胞的干擾。的多能性，從而消除飼養(yǎng)層細胞的干擾。 第二十頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的純化的純化： 待四孔板內(nèi)長滿待四孔板內(nèi)長滿ESC集落，未出現(xiàn)分化集落，未出現(xiàn)分化 征象之征象之前，

25、用玻璃針挑取前，用玻璃針挑取ESC集落，用集落，用 胰酶消化，胰酶消化，反復(fù)吹打離散反復(fù)吹打離散(lsn)后重新接種。后重新接種。 集落呈克隆狀生長，與飼養(yǎng)層細胞之間集落呈克隆狀生長，與飼養(yǎng)層細胞之間 有有明顯的界限，細胞排列緊密，界限不明顯的界限，細胞排列緊密，界限不 清，可清，可見折光性比較強的分裂相。見折光性比較強的分裂相。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞從小鼠囊胚的內(nèi)細胞(xbo)群中分離培養(yǎng)群中分離培養(yǎng)ESC第二十一頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿ESC特異性表面特異性表面(biomin)標(biāo)記標(biāo)記從小鼠囊胚的內(nèi)細胞從小鼠囊胚的內(nèi)細胞(xbo)群中分離培養(yǎng)群中分離培養(yǎng)ESC第二十二頁，共四十五頁。

26、干細胞研究進展講稿 ESC的鑒定的鑒定-嵌合體制備技術(shù)：嵌合體制備技術(shù)： 嵌合體嵌合體（chimera）是指由兩種或兩種以上不同遺傳構(gòu)成的細胞是指由兩種或兩種以上不同遺傳構(gòu)成的細胞(xbo) 構(gòu)成構(gòu)成的個體，這種個體的組織器官由基因型不同的細胞的個體，這種個體的組織器官由基因型不同的細胞(xbo)群組成。群組成。ESC能廣能廣泛參與宿主各組織的形成，尤其是生殖系的形成，成泛參與宿主各組織的形成，尤其是生殖系的形成，成 為嵌合體制備的最佳實為嵌合體制備的最佳實驗材料。驗材料。 嵌合體的成功制備也是證明嵌合體的成功制備也是證明ESC具有發(fā)育全能性的一個金指標(biāo)。具有發(fā)育全能性的一個金指標(biāo)。從小鼠囊胚

27、的內(nèi)細胞群中分離從小鼠囊胚的內(nèi)細胞群中分離(fnl)培養(yǎng)培養(yǎng)ESC嵌合體動物的制備方法主要有三種嵌合體動物的制備方法主要有三種(sn zhn)：融合法、顯微注射法和：融合法、顯微注射法和共培養(yǎng)法。共培養(yǎng)法。 融合法融合法是指將來源于不同品系動物的早胚消化去透明帶后，在融合劑（多用植物血球是指將來源于不同品系動物的早胚消化去透明帶后，在融合劑（多用植物血球凝集素）的作用下，形成融合胚。實驗過程中，由于消化劑、融合劑的使用，凝集素）的作用下，形成融合胚。實驗過程中，由于消化劑、融合劑的使用，會對胚胎造成不同程度的損傷，所以融合法制備嵌合胚的成功率較低。會對胚胎造成不同程度的損傷，所以融合法制備嵌合

28、胚的成功率較低。 共培養(yǎng)法共培養(yǎng)法是將著床前的早期胚胎與是將著床前的早期胚胎與ESC進行共培養(yǎng)而獲得嵌合胚的一種方法。進行共培養(yǎng)而獲得嵌合胚的一種方法。雖然有資料表明，粘附在早期胚胎滋養(yǎng)層外面的雖然有資料表明，粘附在早期胚胎滋養(yǎng)層外面的ESC，經(jīng)過過夜培養(yǎng)，經(jīng)過過夜培養(yǎng)，能有效的與宿主能有效的與宿主ICM細胞整合，但是在共培養(yǎng)過程中，很難控制發(fā)生整合的細胞整合，但是在共培養(yǎng)過程中，很難控制發(fā)生整合的ESC的數(shù)目，因此也限制了其使用。的數(shù)目，因此也限制了其使用。 顯微注射法顯微注射法應(yīng)用最為廣泛。通過顯微注射法構(gòu)建嵌合體是一項復(fù)雜的技術(shù)，應(yīng)用最為廣泛。通過顯微注射法構(gòu)建嵌合體是一項復(fù)雜的技術(shù)，E

29、SC本身的特性、本身的特性、受體胚胎的品系來源以及顯微注射的熟練程度等都會直接影響嵌合體的獲得。受體胚胎的品系來源以及顯微注射的熟練程度等都會直接影響嵌合體的獲得。第二十三頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿第一(dy)部分 C57BL/6J inbred mice KMoutbred miceES cell cultureSinglecell suspension5-10 ESCmicromanipulatorreimplantation chimeraspseudopregnant foster mother(KM) 第二十四頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的鑒定的鑒定-嵌合體制備

30、技術(shù)的應(yīng)用：嵌合體制備技術(shù)的應(yīng)用： 目前，嵌合體制備技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)目前，嵌合體制備技術(shù)已廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)、神經(jīng)(shnjng)生物學(xué)、生物學(xué)、 遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、毒理學(xué)等眾多研究領(lǐng)域，在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研遺傳學(xué)、腫瘤學(xué)、毒理學(xué)等眾多研究領(lǐng)域，在當(dāng)今生物醫(yī)學(xué)研 究中發(fā)揮究中發(fā)揮著愈來愈重要的作用。著愈來愈重要的作用。 在制備嵌合體之前，可以在制備嵌合體之前，可以對對ESC進行基因操作進行基因操作，獲取一些優(yōu)良，獲取一些優(yōu)良 性狀，利用性狀，利用基因操作成功的基因操作成功的ESC進行嵌合體的制備，如果出現(xiàn)進行嵌合體的制備，如果出現(xiàn) 生殖系嵌合，就可以把生殖系嵌合，就可以把優(yōu)良性狀遺

31、傳下去。在家畜品種改良方優(yōu)良性狀遺傳下去。在家畜品種改良方 面有廣泛的應(yīng)用。面有廣泛的應(yīng)用。從小鼠囊胚的內(nèi)細胞從小鼠囊胚的內(nèi)細胞(xbo)群中分離培養(yǎng)群中分離培養(yǎng)ESC第二十五頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 人胚胎著床人胚胎著床(zhe chun)前的發(fā)育過程前的發(fā)育過程：從人從人(cn rn)囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)囊胚的內(nèi)細胞群中分離培養(yǎng)ESCtotipotencypluripotency第二十六頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的誘導(dǎo)分化的誘導(dǎo)分化： 細胞分化細胞分化cell differentiation：在個體發(fā)育中，由一種相同的細胞：在個體發(fā)育中，由一種相同的細胞 類型

32、經(jīng)細胞類型經(jīng)細胞分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異，分裂后逐漸在形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能上形成穩(wěn)定性差異， 產(chǎn)生各不相同的細胞產(chǎn)生各不相同的細胞類群的過程。類群的過程。 誘導(dǎo)誘導(dǎo)induction：胚胎中的一個區(qū)域影響另一個區(qū)域，使其沿一條胚胎中的一個區(qū)域影響另一個區(qū)域，使其沿一條 新途徑進行分化；新途徑進行分化；某些環(huán)境因子的刺激使基因進入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。某些環(huán)境因子的刺激使基因進入轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。 ESC的誘導(dǎo)分化：的誘導(dǎo)分化：胚胎干細胞在外界因素的刺激下逐漸發(fā)育胚胎干細胞在外界因素的刺激下逐漸發(fā)育(fy)為具為具 有特殊形態(tài)和有特殊形態(tài)和功能的專一細胞的過程。功能的專一細胞的過程。ESC的誘導(dǎo)分化

33、第二十七頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿干細胞移植治療干細胞移植治療ESC分化形成的功能分化形成的功能細胞就可以用于替代細胞就可以用于替代病變的功能細胞來行病變的功能細胞來行使功能。使功能。目前，在體外通過加入一些誘導(dǎo)劑或目前，在體外通過加入一些誘導(dǎo)劑或細胞因子進行誘導(dǎo)分化實驗，還很難細胞因子進行誘導(dǎo)分化實驗，還很難模擬體內(nèi)的正常分化過程，任何一個模擬體內(nèi)的正常分化過程，任何一個誘導(dǎo)體系都不能保證誘導(dǎo)誘導(dǎo)體系都不能保證誘導(dǎo)ESC定向定向分化為某一類型細胞分化為某一類型細胞(xbo)，只能使某種類型的細胞只能使某種類型的細胞(xbo)趨于優(yōu)勢。趨于優(yōu)勢。ESC的誘導(dǎo)分化第二十八頁，共四十五頁。

34、干細胞研究進展講稿胚胚胎胎干干細細胞胞的的誘誘導(dǎo)導(dǎo)分分化化： 胎胎牛牛血血清清，骨骨髓髓基基質(zhì)質(zhì)細細胞胞共共培培養(yǎng)養(yǎng) 胚胚胎胎干干細細胞胞-造造血血細細胞胞 RA 胚胚胎胎干干細細胞胞-神神經(jīng)經(jīng)細細胞胞 DMSO 胚胚胎胎干干細細胞胞-肌肌肉肉細細胞胞 TGF-B1, VEGF, bFGF 胚胚胎胎干干細細胞胞-血血管管和和內(nèi)內(nèi)皮皮細細胞胞 RA+胰胰島島素素+T3 胚胚胎胎干干細細胞胞-脂脂肪肪細細胞胞 BMP-2, BMP-4 胚胚胎胎干干細細胞胞-軟軟骨骨細細胞胞 地地塞塞米米松松，磷磷酸酸甘甘油油 胚胚胎胎干干細細胞胞-骨骨細細胞胞 基基因因轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)染染 胚胚胎胎干干細細胞胞-胰胰島島素素

35、分分泌泌細細胞胞 ESC的誘導(dǎo)分化第二十九頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC誘導(dǎo)誘導(dǎo)(yudo)分化的常用方法分化的常用方法: 1. 加入誘導(dǎo)細胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)，如加入誘導(dǎo)細胞分化的因子或化學(xué)物質(zhì)，如VGEF、 bFGF 、DMSO和和RA等等 2. 將將ESC與特定的細胞共培養(yǎng)與特定的細胞共培養(yǎng) 3. 將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入將某種分化誘導(dǎo)因子的基因轉(zhuǎn)入ESC內(nèi)內(nèi) ESC的誘導(dǎo)分化第三十頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的神經(jīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)誘導(dǎo)： 1. 維甲酸維甲酸（retinoic acid，RA）誘導(dǎo)誘導(dǎo)： 維甲酸是維生素在體內(nèi)的活性衍生物,是一種很強的分化誘導(dǎo)劑,

36、 它可誘導(dǎo)類胚體分化成多種細胞類型, 其分化方向取決于維甲酸的作用階段及劑量。 RA進入靶細胞后，由CRABP運送至細胞核，與核受體（RAR和 RXR）結(jié)合。RXR自身(zshn)或者與其他受體結(jié)合成同 二聚體或異二聚體,識別DNA上維甲酸反應(yīng)元件(RARE或RXRE),調(diào)控靶基因的表達，發(fā)揮重要的生物學(xué)效應(yīng)，如調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖和程序化死亡等。ESC的誘導(dǎo)分化1982年Jones-Willeneuve首次(shu c)報道將RA運用于胚胎癌細胞（P19）向神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞的誘導(dǎo), 在24-48h內(nèi)有神經(jīng)樣細胞移出。 Jones-Villeneuve EM, McBurney MW,

37、 Rogers KA, Kalnins VI. Retinoic acid induces embryonal carcinoma cells to differentiate into neurons and glial cells. J Cell Biol. 1982 Aug;94(2):253-62.1995年Bain等人提出的“八日誘導(dǎo)程序”，即 “4-/4+法”，是最經(jīng)典的RA誘導(dǎo)法。他們(t men)將未分化的小鼠ES吹散，懸浮培養(yǎng)4天形成類胚體，再向培養(yǎng)液中加入0.5M RA，培養(yǎng)4天，發(fā)現(xiàn)有38%的神經(jīng)元樣細胞。 Bain G, Kitchens D, Yao M, Huett

38、ner JE, Gottlieb DI. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 1995 Apr;168(2):342-57.在胚胎細胞的正常分化過程中，誘導(dǎo)過程的實現(xiàn)不僅依賴于誘導(dǎo)物的誘導(dǎo)作用，同時也依賴于被誘導(dǎo)細胞的反應(yīng)性，還有賴于兩者之間在時間上和空間上的協(xié)調(diào)同步，這樣才能保證被誘導(dǎo)細胞定向地分化為某種類型的細胞。2. 序貫誘導(dǎo)法序貫誘導(dǎo)法：2000年Lee等使用“五步法”序貫誘導(dǎo)小鼠ESC向神經(jīng)細胞分化。擴增未分化的ESC；去除促有絲分裂素或分化抑制劑，懸浮培養(yǎng)，形成類胚體;去除生長因子

39、，促分化，篩選nestin陽性細胞；擴增神經(jīng)前體細胞；利用神經(jīng)元促存活因子誘導(dǎo)并維持特定譜系神經(jīng)元成熟。3. 神經(jīng)分化的內(nèi)定模式神經(jīng)分化的內(nèi)定模式（default model）： 在對脊椎動物神經(jīng)發(fā)育的研究中，有人發(fā)現(xiàn)外胚層細胞在無 外界誘導(dǎo)信號下自發(fā)分化為神經(jīng)細胞。 經(jīng)典的例子：Tropepe等人的實驗發(fā)現(xiàn)，低密度、無血清、無 飼養(yǎng)層的小鼠ESC培養(yǎng)7天后有0.2%左右的細胞可聚集形成神 經(jīng)球，其中82%的細胞呈nestin陽性著色。 證明ESC能夠自發(fā)分化為神經(jīng)元。神經(jīng)分化的內(nèi)定模式認(rèn)為在胚體原基中，神經(jīng)譜系的分化受著某種抑制信號的控制，神經(jīng)分化是抑制信號撤除后自發(fā)獲得的一種狀態(tài)。有資料表

40、明：BMP4與這種抑制信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，使用BMP4的拮抗劑Noggin、Chordin可抑制這種抑制信號的傳導(dǎo)，從而促進ESC的神經(jīng)分化。4. 基因修飾基因修飾： 將神經(jīng)特異性基因轉(zhuǎn)染入ESC，篩選即可得到高純度的神經(jīng)細胞。 將Nestin（神經(jīng)前體細胞標(biāo)志物）與報告基因增強性綠色熒光蛋白共 同轉(zhuǎn)染入ESC，篩選可得到高純度的神經(jīng)前體細胞。 將促多巴胺能神經(jīng)元生成的轉(zhuǎn)錄因子Nurr1轉(zhuǎn)染入ESC，即可得到 Nurr1 ESC系，再通過五步序貫誘導(dǎo)法，即可得到50%多巴胺能神經(jīng) 元，成為帕金森氏病細胞移植治療的一個新的細胞來源。隨著對神經(jīng)發(fā)育分子機制的逐步了解，越來越多的與神經(jīng)發(fā)生相關(guān)的基因

41、被定位，這將為轉(zhuǎn)染干細胞的研究提供更準(zhǔn)確、有效的靶基因信息，前景非常誘人。但是由于基因修飾導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)入基因可能引起的異?；虻谋磉_，都需要學(xué)者進行進一步研究。第三十一頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 哺乳動物的發(fā)育均需由1個全能細胞(受精卵)分化形成200多種不同類型的細胞。從囊胚期內(nèi)細胞群分離得到的ESC在體外也具有無限或較長期的自我更新能力，并能在特定的誘導(dǎo)(yudo)條件下分化為各種組織特異性細胞。 第三十二頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 干細胞的調(diào)控是指給予適當(dāng)?shù)囊蜃訔l件(tiojin)，對干細胞的增殖和分化進行調(diào)控，使之向指定的方向發(fā)展。 內(nèi)源性調(diào)控 外源性調(diào)控基因

42、調(diào)控基因調(diào)控-干細胞應(yīng)用干細胞應(yīng)用(yngyng)(yngyng)的的基礎(chǔ)基礎(chǔ)第三十三頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿哺乳動物的發(fā)育均需由1個全能細胞(受精卵)分化形 成200多種不同類型的細胞。從囊胚期內(nèi)細胞群分離得到的ESC在體外也具有無限或較長期的自我更新能力，以及強大的分化潛能，能在特定的誘導(dǎo)條件下分化為各種組織特異性細胞。而且干細胞的增殖分化是干細胞的增殖分化是可可以以受基因以及細胞外基質(zhì)受基因以及細胞外基質(zhì)調(diào)控調(diào)控的。的。干細胞增殖分化的可調(diào)控性為干細胞帶來了廣闊的應(yīng)用前景。干細胞增殖分化的可調(diào)控性為干細胞帶來了廣闊的應(yīng)用前景。 理論上講，干細胞可以用于許多疾病的治療，像帕金森氏

43、 病、糖尿病、心肌梗死(xn j n s)、肝功能衰竭、血液系統(tǒng)疾病等。就是干細胞的這種潛在的價值引起了各國學(xué)者的研究興趣。細胞替代治療細胞替代治療(zhlio)制備轉(zhuǎn)基因動物制備轉(zhuǎn)基因動物第三十四頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 ESC的應(yīng)用的應(yīng)用-細胞替代治療細胞替代治療： 最適合的疾病主要是組織最適合的疾病主要是組織(zzh)壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病壞死性疾病如缺血引起的心肌壞死，退行性病 變?nèi)缗两鹕C合變?nèi)缗两鹕C合征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病、白血病等。征，自體免疫性疾病如胰島素依賴型糖尿病、白血病等。 ESC的應(yīng)用ESC移植移植(yzh)治療的模式圖治療

44、的模式圖 ESC技術(shù)技術(shù)(jsh)+轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)基因技術(shù)(jsh)隨著對個體發(fā)育分子機制的逐步了解，越來越多隨著對個體發(fā)育分子機制的逐步了解，越來越多的與的與組織發(fā)生相關(guān)的基因組織發(fā)生相關(guān)的基因被定位，這將為被定位，這將為轉(zhuǎn)染干細胞的研究提供更準(zhǔn)確、有效轉(zhuǎn)染干細胞的研究提供更準(zhǔn)確、有效的靶基因信息，實現(xiàn)相對定向誘導(dǎo)分的靶基因信息，實現(xiàn)相對定向誘導(dǎo)分化，前景非常誘人?；?，前景非常誘人。 但是由于但是由于基因修飾導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定基因修飾導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定，導(dǎo)入導(dǎo)入基因可能引起的異?；虻谋磉_基因可能引起的異?；虻谋磉_，都，都需要學(xué)者進行進一步研究。需要學(xué)者進行進一步研究。第三十五頁，共四十五頁

45、。干細胞研究進展講稿源于胚胎干細胞源于胚胎干細胞(xbo)的細胞的細胞(xbo)已能或可能治療許多疾病：已能或可能治療許多疾?。荷窠?jīng)細胞神經(jīng)細胞心肌細胞心肌細胞B B型胰島細胞型胰島細胞軟骨細胞軟骨細胞白細胞白細胞皮膚細胞皮膚細胞肝細胞肝細胞骨細胞骨細胞視細胞視細胞骨骼肌細胞骨骼肌細胞帕金森病帕金森病心肌梗死心肌梗死糖尿病糖尿病骨關(guān)節(jié)炎骨關(guān)節(jié)炎白血病白血病燒傷和創(chuàng)傷燒傷和創(chuàng)傷肝炎肝炎骨質(zhì)疏松癥骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)膜退化視網(wǎng)膜退化肌營養(yǎng)不良肌營養(yǎng)不良治療(zhlio)ESC的應(yīng)用第三十六頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿利用利用ESC移植治療疾病確實具有廣泛的應(yīng)用前景，但是胚胎干細胞通移植治療疾病確實

46、具有廣泛的應(yīng)用前景，但是胚胎干細胞通常取自常取自4-54-5天的早期胚胎，在分離過程中不可避免天的早期胚胎，在分離過程中不可避免(b k b min)(b k b min)會損毀所使用早期胚胎，因此該項研究在歐美會損毀所使用早期胚胎，因此該項研究在歐美受到了社會倫理學(xué)的制約受到了社會倫理學(xué)的制約，并且在實際應(yīng)用中還并且在實際應(yīng)用中還不能避免免疫排斥不能避免免疫排斥。核移植技術(shù)逐漸引起各國學(xué)者的關(guān)注。人們可望核移植技術(shù)逐漸引起各國學(xué)者的關(guān)注。人們可望通過核移植技術(shù)獲得雜通過核移植技術(shù)獲得雜合細胞發(fā)育成的囊胚，獲得多能干細胞合細胞發(fā)育成的囊胚，獲得多能干細胞，然后將這些細胞回輸入體內(nèi)，從，然后將這

47、些細胞回輸入體內(nèi)，從而達到治療的目的。而達到治療的目的。 核移植技術(shù)核移植技術(shù)第三十七頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 核移植技術(shù)核移植技術(shù) 1938年, Speman H在Embryonic Development and Induction一書中提出了將分化了的細胞核移入去核卵細胞中看其是否能指導(dǎo)胚胎發(fā)育的異想天開的設(shè)想。 1952年, Briggs R和King T通過移植蛙的胚胎細胞核到去核的卵子中得到發(fā)育正常的蝌蚪。 1981年, Illmensee K和Hoppe PC聲稱通過核移植技術(shù)獲得(hud)成活的小鼠。 1997年, Wilmut I用成體乳腺細胞核移植克隆羊成功， “

48、多莉”羊的出現(xiàn)震驚了世界,也使克隆clone一詞成為家喻戶曉的詞匯。第三十八頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿 核移植技術(shù)核移植技術(shù)(jsh)(jsh)困難重重困難重重克隆羊多莉克隆羊多莉Dolly的誕生的誕生 個體個體(gt)第三十九頁，共四十五頁。干細胞研究進展講稿克隆羊多莉克隆羊多莉Dolly： 1997年2月22日，英國生物遺傳學(xué)家維爾穆特成功 地克隆出了一只羊?？寺⊙颉岸嗬颉钡恼Q生震驚了世界。 “多莉”是世界上第一例用體細胞- 乳腺上皮細胞，通 過細胞核移植技術(shù)，得到的一只小綿羊。 多莉羊的誕生揭示一個全新概念：由成年機體的一個體細胞核，可以復(fù)制一個基因完全相同由成年機體的一個體細胞核，可以復(fù)制一個基因完全相同的新生命個體的新生命個體?？寺『镒涌寺『镒覶etra： 2000年，美國俄勒岡地