ELISA步驟、試劑及注意事項

1、ELISA步驟、試劑及注意事項操作步驟方法一用于檢測未知抗原的雙抗體夾心法：1 .包被：用o.05MPH9.油碳酸鹽包被緩沖液將抗體稀釋至蛋白質(zhì)含量為1-10以g/ml。在每個聚苯乙烯板的反應(yīng)孔中加0.1ml,4c過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。2 .加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37c孵育1小時。然后洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。3 .加酶標(biāo)抗體：于各反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)抗體（經(jīng)滴定后的稀釋度）0.1mL37c孵育0.57小時，洗滌。4 .加底物液顯色：于各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物

2、溶液0.1ml,37c底溶分鐘。5 .終止反應(yīng)：于各反應(yīng)孔中加入2M硫酸0.05mlo6 .結(jié)果判定：可于白色背景上，直接用肉眼觀察結(jié)果：反應(yīng)孔內(nèi)顏色越深，陽性程度越強(qiáng)，陰性反應(yīng)為無色或極淺，依據(jù)所呈顏色的深淺，以“ +”號表示。也可測0 D值：在ELISA檢測儀上，于450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調(diào)零后測各孔0D值，若大于規(guī)定的陰性對照0D值的2.1倍,即為陽性。方法二用于檢測未知抗體的間接法：用包被緩沖液將已知抗原稀釋至1-10四/ml,每孔加0.1ml,4c過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml于上述已包被之反應(yīng)孔中，置37c孵育1小

3、時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)于反應(yīng)孔中，加入新鮮稀釋的酶標(biāo)第二抗體(抗抗體)0.1ml,37c孵育30-60分鐘，洗滌，最后一遍用DDW洗滌。其余步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、60試劑器材1 .試齊1J(1) 包被緩沖液(PH9.60.05M碳酸鹽緩沖液):NaC03?1.59克NaHC032.93克加蒸儲水至1000ml(2) 洗滌緩沖液(PH7.4PBS):0.15MKH2P040.2克Na2HP0412H202.9克NaCI8.0克KCI0.2克Tween-200.05%0.5ml加蒸儲水至1000mI(3)稀釋液：牛血清白蛋白(BSA)0.1克加洗滌緩沖液至100ml或

4、以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5s10%使用。(4)終止液(2MH2S04):蒸播水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml(5) 底物緩沖液(PH5.0磷酸JK檸檬酸):0.2MNa2HP04(28.4克/L)25.7ml0.1M檸檬酸(19.2克/L)24.3mI加蒸儲水50ml。(6) TMB(四甲基聯(lián)苯胺)使用液：TMB(10mg/5ml無水乙醇)0.5ml底物緩沖液(PH5.5)10ml0.75%H20232出(7) ABTS使用液:ABTS0.5mg底物緩沖液(PH5.5)1ml3%H2022以I(8)抗原、抗體和酶標(biāo)記抗體。(9)正常人血清和陽性對照血清。2 .器

5、材：(1)聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標(biāo)板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50出及100以I加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。(2)小燒杯、玻璃棒'試管、吸管和量筒等。3 3)4c冰箱，37c孵育箱。注意事項1 .正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉2 .在ELISA中，進(jìn)行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括：（1）固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。具形式可以是凹孔平板'試管、珠粒等。目前常用的是40

6、孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進(jìn)行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進(jìn)行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.09.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多采用4c18s24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進(jìn)行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度（0.1、1.0和10的/ml等）進(jìn)行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標(biāo)本的0D值。選擇0D值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為10四/ml。（3）酶標(biāo)記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進(jìn)行初步效價的滴定（見酶標(biāo)記抗體部份）。然后再固定其它條件或采取“方陣法"（包被物'待檢樣品的參考品及酶標(biāo)記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統(tǒng)里準(zhǔn)確地滴定其工作濃度。（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護(hù)。有條件者應(yīng)使用