CCK8檢測細(xì)胞增殖毒性的原理、方法及注意事項

1、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理、方法及注意事項CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的原理CellCountingKit-8（簡稱CCK-8）試齊可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,4-二磺酸苯）-2H-四口坐單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪金翁硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。用途：藥物篩選、細(xì)胞增殖測定

2、、細(xì)胞毒性測定、月中瘤藥敏試驗CCK8的優(yōu)點：?使用方便，省去了洗滌細(xì)胞，不需要放射性同位素和有機(jī)溶劑;?CCK-8法能快速檢測；?CCK-8法的檢測靈敏度很高，甚至可以測定較低細(xì)胞密度；?CCK-8法的重復(fù)性優(yōu)于MTT法；?CCK-8法對細(xì)胞毒性小；?CCK-8細(xì)胞活性檢測試劑中為1瓶溶液，毋需預(yù)制，即開即用。CCK8的缺點：?與MTT法相比，CCK8和XTT的價格比較貴。?CCK8試劑的顏色為淡紅色，與含酚紅的培養(yǎng)基顏色接近，不注意的話容易產(chǎn)生漏加或多加。與以往的增殖/毒性測定試劑相比較:檢測方法MTTtXTT法WST-<CCK8法甲膻產(chǎn)物的水溶性差（需加有機(jī)溶劑溶解）好好產(chǎn)品性狀粉

3、末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用現(xiàn)配現(xiàn)用即開即用即開即用檢測靈敏度高很高很高高檢測時間較長較短較短取短檢測波長560-600nm420-480nm420-480nm430-490nm細(xì)胞毒性高，細(xì)胞形態(tài)完全消失很低，細(xì)胞形態(tài)不交很低，細(xì)胞形態(tài)不交很低，細(xì)胞形態(tài)不交試劑穩(wěn)定性較不很好批量樣品檢測可以非常適合非常適合非常適合便捷程度便捷便捷非常便捷二、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的方法實驗一：細(xì)胞增殖分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個重復(fù)。3、37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果

4、不需要貼壁，這步可以省去。4、加入10ulCCK8:由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基，以換液的形式加入。5、培養(yǎng)1-4小時：細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。6、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm,參比波長600-650nm。實驗二：細(xì)胞毒性分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計數(shù)2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞

5、數(shù)，每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做3個重復(fù)。3、37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。4、加入不同濃度的毒性物質(zhì)5、37c培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：加入毒性物質(zhì)的培養(yǎng)時間，要看毒性物質(zhì)的性質(zhì)和細(xì)胞的敏感性，一般要根據(jù)細(xì)胞周期來決定，起碼要一代以上的時6、加入10ulCCK8:由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻。7、培養(yǎng)1-4小時:細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)最佳條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的

6、顯色時間（5-6小時）。8、測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。注：?若暫時不測定OD值,可以向每孔中加入10仙L0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。?如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉藥物影響。當(dāng)然藥物影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入藥物后的空白吸收即可。三、CCK8檢測細(xì)胞增殖/毒性的注意事項?當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的

7、最小接種量至少為1,000個/孔（100膜培養(yǎng)基）。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔（100膜培養(yǎng)基）。?酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。?CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實驗每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。?CCK-8在0-5下能夠保存至少6個月，在-20下避光可以保存1年。?當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板最外一圈的孔最容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。?在培養(yǎng)基中加入CCK8,培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗時，還應(yīng)考慮藥物的吸收，可在加入藥物的培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450nm的吸光度作為空白對照。?金