微生物的接種分離純化與培養(yǎng)方法

1、微生物的培養(yǎng)方法實(shí)驗(yàn)?zāi)康模簩W(xué)習(xí)掌握無菌操作技術(shù)；學(xué)習(xí)接種方法；學(xué)習(xí)常用的別離、純化菌 種的方法。一、接種將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內(nèi)的過程叫做 接種。1、接種工具和方法在實(shí)驗(yàn)室用得最多的接種工具是接種環(huán)、接種針。由于接種要求或方法的不 同，接種針的針尖部常做成不同的形狀，有刀形、耙形等之分。有時(shí)滴管、吸管 也可作為接種工具進(jìn)行液體接種。在固體培養(yǎng)基外表要將菌液均勻涂布時(shí)，需要 用到涂布棒。圖1圖1接種和別離工具1.接種針2.接種環(huán)3.接種鉤4.5.玻璃涂棒6.接種圈7.接種鋤8.小解剖刀常用的接種方法有以下幾種：1劃線接種這是最常用的接種方法。即在固體培養(yǎng)基外表作來回

2、直線形 的移動，就可到達(dá)接種的作用。常用的接種工具有接種環(huán)，接種針等。在斜面接 種和平板劃線中就常用此法。2三點(diǎn)接種在研究霉菌形態(tài)時(shí)常用此法。此法即把少量的微生物接種在 平板外表上，成等邊三角形的三點(diǎn)，讓它各自獨(dú)立形成菌落后，來觀察、研究它 們的形態(tài)。除三點(diǎn)外，也有一點(diǎn)或多點(diǎn)進(jìn)行接種的。3穿刺接種 在保藏厭氧菌種或研究微生物的動力時(shí)常采用此法。做穿刺接種時(shí)，用的接種工具是接種針。用的培養(yǎng)基一般是半固體培養(yǎng)基。它的做法是: 用接種針蘸取少量的菌種，沿半固體培養(yǎng)基中心向管底作直線穿刺， 如某細(xì)菌具 有鞭毛而能運(yùn)動，那么在穿刺線周圍能夠生長。4澆混接種該法是將待接的微生物先放入培養(yǎng)皿中，然后再倒入冷

3、卻至 45 C左右的固體培養(yǎng)基，迅速輕輕搖勻，這樣菌液就到達(dá)稀釋的目的。待平板 凝固之后，置適宜溫度下培養(yǎng)，就可長出單個(gè)的微生物菌落。5涂布接種與澆混接種略有不同，就是先倒好平板，讓其凝固，然后再 將菌液倒入平板上面， 迅速用涂布棒在外表作來回左右的涂布， 讓菌液均勻分布， 就可長出單個(gè)的微生物的菌落。6液體接種 從固體培養(yǎng)基中將菌洗下，倒入液體培養(yǎng)基中，或者從液體 培養(yǎng)物中， 用移液管將菌液接至液體培養(yǎng)基中， 或從液體培養(yǎng)物中將菌液移至固 體培養(yǎng)基中，都可稱為液體接種。7注射接種該法是用注射的方法將待接的微生物轉(zhuǎn)接至活的生物體內(nèi)， 如人或其它動物中，常見的疫苗預(yù)防接種，就是用注射接種，接入人

4、體，來預(yù)防 某些疾病。8活體接種 活體接種是專門用于培養(yǎng)病毒或其它病原微生物的一種方法， 因?yàn)椴《颈仨毥臃N于活的生物體內(nèi)才能生長繁殖。所用的活體可以是整個(gè)動物； 也可以是某個(gè)離體活組織， 例如猴腎等； 也可以是發(fā)育的雞胚。 接種的方式是注 射，也可以是拌料喂養(yǎng)。2、無菌操作培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后， 用經(jīng)過滅菌的工具 如接種針和吸管等 在無菌條件 下接種含菌材料如樣品、菌苔或菌懸液等于培養(yǎng)基上，這個(gè)過程叫做無菌接 種操作。在實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)中的各種接種必須是無菌操作。實(shí)驗(yàn)臺面不管是什么材料， 一律要求光滑、 水平。光滑是便于用消毒劑擦洗； 水平是倒瓊脂培養(yǎng)基時(shí)利于培養(yǎng)皿內(nèi)平板的厚度保持一致。 在實(shí)驗(yàn)臺上方

5、， 空氣 流動應(yīng)緩慢， 雜菌應(yīng)盡量減少， 其周圍雜菌也應(yīng)越少越好。 為此，必須清掃室內(nèi)， 關(guān)閉實(shí)驗(yàn)室的門窗，并用消毒劑進(jìn)行空氣消毒處理，盡可能地減少雜菌的數(shù)量?？諝庵械碾s菌在氣流小的情況下， 隨著灰塵落下， 所以接種時(shí)， 翻開培養(yǎng)皿 的時(shí)間應(yīng)盡量短。 用于接種的器具必須經(jīng)干熱或火焰等滅菌。 接種環(huán)的火焰滅菌 方法：通常接種環(huán)在火焰上充分燒紅 接種柄， 一邊轉(zhuǎn)動一邊慢慢地來回通過火 焰三次，冷卻，先接觸一下培養(yǎng)基，待接種環(huán)冷卻到室溫后，方可用它來挑取 含菌材料或菌體，迅速地接種到新的培養(yǎng)基上。圖 2然后，將接種環(huán)從柄部 至環(huán)端逐漸通過火焰滅菌， 復(fù)原。 不要直接燒環(huán)， 以免殘留在接種環(huán)上的菌體爆

6、 濺而污染空間。 平板接種時(shí)， 通常把平板的面傾斜， 把培養(yǎng)皿的蓋翻開一小局部 進(jìn)行接種。在向培養(yǎng)皿內(nèi)倒培養(yǎng)基或接種時(shí)， 試管口或瓶壁外面不要接觸底皿邊， 試管或瓶口應(yīng)傾斜一下在火焰上通過。圖2斜面接種時(shí)的無菌操作1接種滅菌2開啟棉塞管口滅菌4挑起菌苔5接種塞好棉塞二、別離純化含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物Mixed culture。如果在一 個(gè)菌落中所有細(xì)胞均來自于一個(gè)親代細(xì)胞，那么這個(gè)菌落稱為純培養(yǎng)Pureculture。在進(jìn)行菌種鑒定時(shí)，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純 培養(yǎng)的過程稱為別離純化，方法有許多種。1、傾注平板法首先把微生物懸液通過一系列稀釋，取一定量的稀釋

7、液與熔化好的保持在 4050左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基充分混合，然后把這混合液傾注到無菌的培養(yǎng)皿 中，待凝固之后，把這平板倒置在恒箱中培養(yǎng)。單一細(xì)胞經(jīng)過屢次增殖后形成一 個(gè)菌落，取單個(gè)菌落制成懸液，重復(fù)上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。圖3, a圖3 傾注平板法a涂布平板法b圖解1.菌懸液2.熔化的培養(yǎng)基3.培養(yǎng)物4.無菌水2、涂布平板法首先把微生物懸液通過適當(dāng)?shù)南♂?，取一定量的稀釋液放在無菌的已經(jīng)凝固 的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用無菌的玻璃刮刀把稀釋液均勻地涂布在培養(yǎng)基外表 上，經(jīng)恒溫培養(yǎng)便可以得到單個(gè)菌落。圖3 5,b3、平板劃線法最簡單的別離微生物的方法是平板劃線法。用無菌的接種環(huán)取培養(yǎng)物少許在 平

8、板上進(jìn)行劃線。劃線的方法很多，常見的比擬容易出現(xiàn)單個(gè)菌落的劃線方法有 斜線法、曲線法、方格法、放射法、四格法等。圖4當(dāng)接種環(huán)在培養(yǎng)基外表上往后移動時(shí)，接種環(huán)上的菌液逐漸稀釋，最后在所劃的線上分散著單個(gè)細(xì)胞， 經(jīng)培養(yǎng)，每一個(gè)細(xì)胞長成一個(gè)菌落。圖44、富集培養(yǎng)法富集培養(yǎng)法的方法和原理非常簡單。我們可以創(chuàng)造一些條件只讓所需的微生 物生長，在這些條件下，所需要的微生物能有效地與其他微生物進(jìn)行競爭，在生長能力方面遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他微生物。 所創(chuàng)造的條件包括選擇最適的碳源、 能源、溫 度、光、pH、滲透壓和氫受體等。在相同的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件下，經(jīng)過屢次重 復(fù)移種，最后富集的菌株很容易在固體培養(yǎng)基上長出單菌落。如

9、果要別離一些專 性寄生菌，就必須把樣品接種到相應(yīng)敏感宿主細(xì)胞群體中，使其大量生長。通過屢次重復(fù)移種便可以得到純的寄生菌。圖4平板劃線別離法1.斜線法2.曲線法3.方格法4.放射法5.四格法5、厭氧法在實(shí)驗(yàn)室中，為了別離某些厭氧菌，可以利用裝有原培養(yǎng)基的試管作為培養(yǎng) 容器，把這支試管放在沸水0浴中加熱數(shù)分鐘，以便逐出培養(yǎng)基中的溶解氧。然 后快速冷卻，并進(jìn)行接種。接種后，參加無菌的石蠟于培養(yǎng)基外表，使培養(yǎng)基與 空氣隔絕。另一種方法是，在接種后，利用 N2 或 CO2 取代培養(yǎng)基中的氣體， 然后在火焰上把試管口密封。 有時(shí)為了更有效地別離某些厭氧菌， 可以把所別離 的樣品接種于培養(yǎng)基上，然后再把培養(yǎng)

10、皿放在完全密封的厭氧培養(yǎng)裝置中。.r 、# .三、培養(yǎng)微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外， 還受到許多外界因素的影響， 如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、PH等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和 條件也不盡相同。1、影響微生物生長的因素微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外， 還受到外界許多因素的影響。 影響微生物生長的因素很多，簡要介紹如下。1) 營養(yǎng)物濃度細(xì)菌的生長率與營養(yǎng)物的濃度有關(guān)：卩=卩max*C/(K+C)，營養(yǎng)物濃度與生 長率的關(guān)系曲線是典型的雙曲線。K 值是細(xì)菌生長的很根本的特性常數(shù)。 它的數(shù)值很小， 說明細(xì)菌所需要的營 養(yǎng)濃度非常之低，所以在自然界中，它們到處生長。然而營

11、養(yǎng)太低時(shí)，細(xì)菌生長 就會遇到困難， 甚至還會死亡。 這是因?yàn)槌松L需要能量以外， 細(xì)菌還需要能 量來維持它的生存。這種能量稱為維持能。另一方面，隨著營養(yǎng)物濃度的增加， 生長率愈接近最大值。2) 溫度在一定的溫度范圍內(nèi)， 每種微生物都有自已的生長溫度三基點(diǎn)： 最低生長溫 度、最適生長溫度和最高生長溫度。在生長溫度三基點(diǎn)內(nèi)，微生物都能生長，但 生長速率不一樣。 微生物只有處于最適生長溫度時(shí)， 生長速度才最快， 代時(shí)最短。 超過最低生長溫度，微生物不會生長，溫度太低，甚至?xí)劳?。超過最高生長溫 度，微生物也要停止生長，溫度過高。也會死亡。一般情況下，每種微生物的生 長溫度三基點(diǎn)是恒定的。但也常受其

12、它環(huán)境條件的影響而發(fā)生變化。根據(jù)微生物最適生長溫度的不同，可將它們分為三個(gè)類型：a. 嗜冷微生物：其是適生長溫度多數(shù)在-10 C 20C之間b. 中溫微生物：其最適生長溫度一般在 20 C 45C之間c. 嗜熱微生物：生長溫度在45C以上。3) 水分 水分是微生物進(jìn)行生長的必要條件。芽孢、孢子萌發(fā)，首先需要水分。微生物是不能脫離水而生存的。 但是微生物只能在水溶液中生長， 而不能生活在純水 中。各種微生物在不能生長發(fā)育的水分活性范圍內(nèi)， 均具有狹小的適當(dāng)?shù)乃只?性區(qū)域。4) 氧氣按照微生物對氧氣的需要情況，可將它們分為以下五個(gè)類型。a. 需氧微生物：這類微生物需要氧氣供呼吸之用。沒有氧氣，便

13、不能生長， 但是高濃度的氧氣對需氧微生物也是有毒的。 很多需氧微生物不能在氧氣濃度大 于大氣中氧氣濃度的條件下生長。絕大多數(shù)微生物都屬于這個(gè)類型。b. 兼性需氧微生物：這類微生物在有氧氣存在或無氧氣存在情況下，都能生 長，只不過所進(jìn)行的代謝途徑不同罷了。 在無氧氣存在的條件下， 它進(jìn)行發(fā)酵作 用，例如酵母菌的無氧乙醇發(fā)酵。c. 微量需氧微生物：這類菌是需要氧氣的，但只在 0.2大氣壓下生長最好。這可能是由一它們含有在強(qiáng)氧化條件下失活的酶，因而只有在低壓下作用。d. 耐氧微生物：這類微生物在生長過程中，不需要氧氣，但也不怕氧氣存在， 不會被氧氣所殺死。e. .厭氧微生物 :這類微生物在生長過程中

14、，不需要分子氧。分子氧存在對它 們生長產(chǎn)生毒害，不是被抑制，就是被殺死。2、培養(yǎng)方法1根據(jù)培養(yǎng)時(shí)是否需要氧氣，可分為好氧培養(yǎng)和厭氧培養(yǎng)兩大類。 好氧培養(yǎng)：也稱“好氣培養(yǎng)。就是說這種微生物在培養(yǎng)時(shí)，需要有氧氣加入，否那么就不能生長良好。 在實(shí)驗(yàn)室中， 斜面培養(yǎng)是通過棉花塞從外界獲得無菌 的空氣。三角燒瓶液體培養(yǎng)多數(shù)是通過搖床振蕩， 使外界的空氣源源不斷地進(jìn)入 瓶中。厭氧培養(yǎng)：也稱“厭氣培養(yǎng)。這類微生物在培養(yǎng)時(shí)，不需要氧氣參加。在 厭氧微生物的培養(yǎng)過程中， 最重要的一點(diǎn)就是要除去培養(yǎng)基中的氧氣。 一般可采 用以下幾種方法：a降低培養(yǎng)基中的氧化復(fù)原電位：常將復(fù)原劑如谷胱甘肽、硫基醋酸鹽 等，參加到培

15、養(yǎng)基中， 便可到達(dá)目的。 有的將一些動物的死的或活的組織如牛心、 羊腦參加到培養(yǎng)基中，也可適合厭氧菌的生長。b. 化合去氧：這也有很多方法，主要有：用焦性沒食子酸吸收氧氣；用 磷吸收氧氣； 用好氧菌與厭氧混合培養(yǎng)吸收氧氣； 用植物組織如發(fā)芽的種子吸收 氧氣；用產(chǎn)生氫氣與氧化合的方法除氧。c. 隔絕阻氧：深層液體培養(yǎng)；用石蠟油封存；半固體穿刺培養(yǎng)。d. 替代驅(qū)氧 用二氧氣碳驅(qū)代氧氣；用氮?dú)怛?qū)代氧氣；用真空驅(qū)代氧氣； 用氫氣驅(qū)代氧氣；用混和氣體驅(qū)代氧氣。2根據(jù)培養(yǎng)基的物理狀態(tài)，可分為固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)兩大類。固質(zhì)培養(yǎng)：是將菌種接至疏松而富有營養(yǎng)的固體培養(yǎng)基中， 在適宜的條件下 進(jìn)行微生物培養(yǎng)的方法

16、。液體培養(yǎng)： 在實(shí)驗(yàn)中， 通過液體培養(yǎng)可以使微生物迅速繁殖， 獲得大量的培 養(yǎng)物，在一定條件下，還是微生物選擇增菌的有效方法。四、常用菌種保藏法菌種的保藏常采用枯燥、 低溫和隔絕空氣等措施， 將其新陳代謝限制在最低 范圍內(nèi)，使其生命活動處于半永久性的休眠狀態(tài)， 使菌種能夠存活、 不污染雜菌、 不發(fā)生或較少發(fā)生變異，保存菌種原有的各種生物學(xué)性狀。較常用的菌種保藏法有斜面或半固體傳代保藏法， 以及冷凍真空枯燥法和液 氮超低溫保藏法等。其它尚有載體保藏法和懸液保藏法等。1斜面或半固體傳代保藏法 此法保藏菌種常用的培養(yǎng)基有普通肉湯瓊脂斜面、 血清斜面、 血瓊脂斜面、 雞蛋斜面和血清肉湯半固體培養(yǎng)基等等。 在斜面或半固體培養(yǎng)基外表， 往往參加 滅菌液體石蠟，用以隔絕空氣。此外，厭氧