多聚賴氨酸的配置

1、多聚賴氨酸的配置、保存、使用一、常用的多聚賴氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS,濃度一般為用0.1mg/ml進行包被。二、其他常用包被方法比較（以各種免疫分析為例）:49456826.snap三、我配成1mg/ml的儲存液，用Mini-Q（超純水）配制，放在20c儲存，使用時稀釋10倍（也用超純水），即終濃度100ug/ml,過濾后使用。工作液過濾使用，如一次用不完，放在4c儲存。多聚賴氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。四、我現(xiàn)在要配多聚賴氨酸，書上寫的用PBS配，但沒寫PH,濃度，向各位請教。答：PH應該在7.07.4,PBS:取氯化鈉7.650g,無水磷酸氫二鈉0.724g,磷

2、酸二氫鉀0.210g溶于蒸儲水1000mL中，以1N氫氧化鈉溶液調(diào)pH值為7.07.4,經(jīng)121c滅菌15分鐘五、我準備用多聚賴氨酸涂片培養(yǎng)細胞，不知道多聚賴氨酸涂過的玻片如何滅菌？能否干烤滅菌？答：Sigma的產(chǎn)品說明書上寫的很明白的。另外，有本書上是這么寫的，供參考：Poly-lysine-coatedtissueculturesurfacesTocoatcoverslips:Prepareastocksolutionbydissolving25mg/mlpolylysinein4.73mlwater（bothpoly-L-lysineandpoly-D-lysineareusedtoco

3、attissueculturesurfaces;checkspecificprotocolforchoiceofisomer）andfiltersterilizethrougha0.22-filter.Storein100-科aliquotsat?20C.Whenreadytouse,diluteonealiquotin40mlwatertoprepare13科g/mWorkingsolution.Sterilizecoverslipsbyautoclavingpriortocoating.Dipcoverslipsintheworkingsolution,thenincubate15mint

4、oseveralhoursinahumidified37C,5%CO2incubator.Allowsurfacetodry.Tocoatculturedishesor8-wellchamberslides:Prepareastocksolutionbydissolving100mgpoly-lysinein100mlwater（bothpoly-L-lysineandpoly-D-lysineareusedtocoattissueculturesurfaces;checkspecificprotocolforchoiceofisomer）andfiltersterilizethrougha0

5、.22-科mfilter.Storein5-mlaliquotsat?20C.Whenreadytouse,dilute1partstocksolutionwith9partswatertoprepare100科g/mworkingsolution.Filltissueculturedishesorslidewellswiththeworkingsolutionandincubate1hrinahumidified37C,5%CO2incubator,thenremovesolutionbyvacuumaspirationandallowsurfacetodry.Storecoatedtiss

6、ueculturewareupto3monthsat4C.UsedilutedsoIUtionsonlyonce,butunuseddilutedaliquotscanbestoredupto3monthsat4C.°你可以配置好PLL后單獨將其過濾除菌，分裝，待用。玻片也是事先泡洗潔精，泡酸，雙蒸水洗，烘干后高壓滅菌，待用。培養(yǎng)的前一天包被培養(yǎng)板時先把玻片放入培養(yǎng)孔然后把PLL加到玻片上，靜置15分鐘，洗出多余的PLL,然后用高壓過的雙蒸水洗板，培養(yǎng)板放入37度烘箱里過夜就可以用了。六、多聚賴氨酸消毒該怎么辦？答：紫外照射消毒我沒試過，但用0.22um的濾器消毒是沒問題的（小的一次

7、性濾器可以過濾200ml）。在液體消毒時，如果所含成份經(jīng)過高溫，鉆60照射發(fā)生變性者，建議用濾器（0.22）,多聚賴氨酸為氨基酸類，建議用濾器，如果要求程度高，可以兩個濾器過濾兩次。七、資料：多聚賴氨酸溶液（Poly-L-LysineSolution）Conc.:0.1%w/v,inwaterStorage:18-26CThimerosal,0.01%,addedaspreservative多聚賴氨酸溶液是廣泛應用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強的黏合力。適用組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過

8、程中組織掉片。也可用于細胞培養(yǎng)，增加細胞貼壁能力。八、使用說明操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 .滅菌的ddH2O1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。2 .用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-26C3 .將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。4 .在60c烘箱1小時干燥，或室溫18-26C過夜干燥待用。九、注意事項1 .每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張，超過90張片子將影響其黏合力。2 .用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1%HCl的70%乙醇溶液來清洗。3 .不要在用過的稀釋液中加新的溶液。4 .釋過的多聚賴氨酸溶液要

9、放在2-8C,至少在3個月內(nèi)是穩(wěn)定的。5 .用過的稀釋液要過濾，若出現(xiàn)渾濁或長菌要丟棄。十、將0.5%多聚賴氨酸溶液加入細胞培養(yǎng)皿中，浸泡5-10分鐘并自然晾干待用即可。H一、多聚賴氨酸（poly-l-lysine）:常用包被培養(yǎng)皿的基質(zhì)之一.。1.配制硼酸緩沖液（PH8.4）A液：硼砂溶液1.907g溶于100ml三蒸水（0.05M）B液：硼酸溶液1.237g溶于100ml三蒸水（0.2M）4.5mlA液+5.5mlB液=硼酸緩沖液（PH8.4）2 .多聚賴氨酸5mg溶于50ml硼酸緩沖液中，配成100科g/m的多聚賴氨酸溶液。過濾除菌，-20度保存。3 .使用時4倍稀釋，可以重復使用3次！

10、十二、聽說一般買來的多聚賴氨酸都是用了做免疫組化時用的，一般都加了防腐劑，不利于細胞培養(yǎng)。所以我以前都是自制鼠尾膠原。請教midas主任，不知道這種說法是否正確？答:我不知道別的地方PLL的來源，不過我們這里是sigma的粉劑，而且注明是forcellculture。如果多聚賴氨酸中有防腐劑那么肯定不適合細胞培養(yǎng)！十三、一些參考書上有的用三蒸水，有的用PBS配置，這與你說的很有出入，是不是三種配法都可以？不知道那一種更合理些？答：其實都可以，不過這是推薦的方法?。ㄓ门鹚峋彌_液）十四、主任，按照您的配方，多聚賴氨酸的使用濃度應該是0.025mg/ml,目前我們實驗室的使用濃度是0.1mg/ml,

11、這個濃度來源于上海腦所.我想請問一下，我們用的濃度是否偏高，我培養(yǎng)的是大鼠星形膠質(zhì)細胞，如果用您推薦的濃度，細胞是否容易貼壁.謝謝！答：有些文獻上也是用的0.1mg/ml,但是我們在實際工作中用0.025mg/ml是完全可以的。方法是至少包被4h以上，過夜也可以（可重復用3次）！之后無菌水清洗，晾干后即可使用。用于配養(yǎng)細胞的多聚賴氨酸分子量要求>70,000,一般常見的分子量有70,000150,000,150,000300,000和>300,000,分子量越大，黏附力越強，但相對完全溶解較困難，所以我推薦使用150,000300,000比較好。多聚賴氨酸的工作濃度各家文獻報道相差

12、很大，從0.25mg/ml到0.01mg/ml者B有，因為多聚賴氨酸對細胞有毒性，所以在保證貼附的前提下，濃度越低越好，還省錢。我現(xiàn)在用的是0.01mg/ml。多聚賴氨酸的配制濃度在各個書上不一，我也在做原位雜交，濃度是0.01mg/ml比較好吧十五、請問多聚賴氨酸（150000300000）如何配置？保存？工作濃度？答：多聚賴氨酸應該是避光保存的.我們實驗室使用的方法如下，希望對你有用：多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL）試劑：多聚賴氧酸5g蒸儲水1000ml配制方法：稱取PLL,溶于H2O,充分混合即可，此液濃度為0.5%,可適當稀釋配成0.010.5%濃度。4c保存，也可-2

13、0C備用。PLL可反復冰凍，效果無明顯影響，工作液常再稀釋1050倍。我的使用方法如下：先配制成10mg/ml的濃縮液，使用前按照1:80稀釋，制成工彳液，濃度25ug/ml,可用于包被培養(yǎng)皿。十六、各位老師，有幾個關(guān)于多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板的問題請教1、pll到底溶于硼酸緩沖液還是溶于三蒸水或雙蒸水2、使用前是用滅菌的去離子水稀釋嗎，可不可以用雙蒸水或別的答：多聚賴氨酸溶于硼酸緩沖液或者無菌培養(yǎng)用水；多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板使用前是用滅菌的去離子水稀釋，最好不要用雙蒸水或別的，因為多聚賴氨酸包被的原理是通過改變器皿表面的電荷而促進細胞的黏附。十七、請問：多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶時，該注意什么問

14、題？答：我的方法是：濃度為50ng/1ml的多聚賴氨酸，加入培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶能均勻覆蓋底部就可，放置在無菌操作臺中過夜。第二天早上用時先用雙蒸水沖洗三遍再用。十八、我的問題是多聚賴氨酸可以在培養(yǎng)瓶中放多長時間，太長了會有影響嗎？答：我曾用過多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶，但濃度是0.1mg/ml,我都是放一夜，第二天吸掉晾干就用，當然要紫外消一下.我覺得時間長點沒什么大礙。我們這里的老師說，多聚賴氨酸不能用紫外線照射。1 .用賴氨酸包被培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶時，應該選用多聚左旋賴氨酸（分子量為15-30萬）；2 .感覺你濃度為50ng/1ml宥些低，我一般最后多聚賴氨酸使用濃度達到2030ug/ml;3 .包被時

15、間一般為67h,或者過夜也可；4 .使用時應該先用滅菌水洗三次+PBS（起平衡鹽作用）洗一次，洗液的量應該大于包被液的量；5 .多聚賴氨酸可以在培養(yǎng)瓶中放多長時間，太長了會有影響嗎？"，我包被時間最長的經(jīng)歷有過48h,最后只是多聚賴氨酸隨著時間延長蒸發(fā)一些而量變少了，但是對細胞生長并無大礙，這是我曾經(jīng)有過的經(jīng)歷，所以我會負責地告訴你；6 .多聚賴氨酸能在4度冰箱里放多久？”，最好置于-20度保存，放置數(shù)月乃至半年都可以。我問過博士德公司，他們分裝的多聚賴氨酸是用來作免疫組化的，沒有做過細胞培養(yǎng)實驗，他們不保證能否用在細胞培養(yǎng)中，建議你買其他公司的吧，有固體的，分子量為15-30萬，我

16、們實驗室用濃度0.01%的來促進神經(jīng)細胞貼壁。我們用的多聚賴氨酸濃度為100ug/ml,一般包被3-4小時即可用.我們包被完后一般放在培養(yǎng)箱里，臨用時拿出來洗三次，吹干即可.如果不急著用，放在培養(yǎng)箱里較長時間也沒關(guān)系，把瓶蓋擰緊即可，我最長放了2星期也沒有問題。左旋和右旋的多聚賴氨酸都可以用于包被細胞培養(yǎng)器具，主要看你的細胞貼壁能力如何，左旋的更利于細胞貼壁.我們一般使用0.01%濃度的，包被過夜，第二天用雙蒸水洗兩三次，超凈臺紫外照射，風干?？梢灾苯淤Isigma的原裝粉劑自己配。還有，配好的多聚賴氨酸在4度時間不能放置太久，大概就一兩周吧。存放于-20度中的一般為0.1%的，而且不能反復凍融

17、，只能融化一次。最好是配好后分裝。十九、多聚賴氨酸可用蒸儲水或PBS配制嗎？答：可以的，我們這兒基本上都是用去離子水配制的，這幾種方法效果差不多。不知道你是用來做什么的，免疫組化還是養(yǎng)細胞？ihc沒什么特別說明，如果是包被瓶皿，那就要注意無菌操作，還有有些普通的多聚賴氨酸加有防腐劑，對細胞有影響的！(注：sigma公司的產(chǎn)品有注明：usedtocoattissueculturesurfaceso購買時要注意)如果是浸泡材料后直接接種細胞的話(多聚賴氨酸有利于細胞帖壁)，我建議你用PBS,因為PBS平衡鹽，對細胞損傷小。如果配制后是用來加入培養(yǎng)基的(只是作為其中的一種成份)，可以用三蒸水。說明書

18、上要求配制及存放要在塑料制品中，忌玻璃制品，用PBS稀釋。二十、是否需要一次性濾器濾過一下，用前照一小時？答：我覺得要是用一次性濾器濾過的東西，就不用再照了。沒必要。二十一、用多聚賴氨酸包被可以減少細胞脫片，根據(jù)細胞類型而定，最好用之。以下是我作細胞爬片時步驟：(1)多聚賴氨酸(PLL)：武漢博士德分裝Sigma產(chǎn)品，10ml/瓶。4度存放，有效期1年。博士德說明書明確指出：多聚賴氨酸一般用干凈的塑料器皿，如塑料切片盒，塑料杯等稀釋，而不能用玻璃器皿稀釋，以免影響效果；在1:10稀釋液可以保存在4度里，三個月內(nèi)仍然可以使用。因為多聚賴氨酸對細胞有一定毒性，所以在保證貼附的前提下，盡量使用低點兒的濃度。(2)無菌處理：PLL不可以高溫消毒，故應過濾除均，分裝于無菌處理的細胞凍存管內(nèi)，1ml/管，封口模密圭4度保存。另外，準備無菌去離子水50ml。(3)配置工作液：用移液槍吸取0.3mlPLL+3ml無菌去離子水，混勻放于10ml無菌塑料離心管中。封口模密圭后4度存放。(4)玻片處理：常規(guī)處理的蓋玻片，紗布夾心餅式”消毒、保存。鋪片于培養(yǎng)皿中，移液槍將PLL工作液滴加于”玻片上，室溫10分鐘后，用消毒好的紗布條吸取玻片上的PLL液。在超靜臺內(nèi)風干后使用，或者超靜臺內(nèi)過夜晾干，次日使用。(5)常規(guī)細胞消化，離心后爬片。如果既然細胞生長狀態(tài)良好，染色時不