多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群

1、多管發(fā)酵法測定水中大腸菌群、目的要求1 .學習測定水中大腸菌群數(shù)量的多管發(fā)酵法2 ,了解大腸菌群的數(shù)量在飲水中的重要性。、基本原理多管發(fā)酵法包括初（步）發(fā)酵試驗、平板分離和復發(fā)酵試驗三個部分。1 .初（步）發(fā)酵試驗發(fā)酵管內裝有乳糖蛋白陳液體培養(yǎng)基，并倒置一德漢氏小套管。乳糖能起選擇作用，因為很多細菌不能發(fā)酵乳糖，而大腸菌群能發(fā)酵乳糖而產(chǎn)酸產(chǎn)氣。為便于觀察細菌的產(chǎn)酸情況，培養(yǎng)基內加有澳甲酚紫作為pH指示劑，細菌產(chǎn)酸后，培養(yǎng)基即由原來的紫色變?yōu)辄S色。澳甲酚紫還有抑制其他細菌如芽胞菌生長的作用。水樣接種于發(fā)酵管內，37c下培養(yǎng)，24小時內小套管中有氣體形成，并且培養(yǎng)基混濁，顏色改變，說明水中存在大腸

2、菌群，為陽性結果，但也有個別其他類型的細菌在此條件下也可能產(chǎn)氣；此外產(chǎn)酸不產(chǎn)氣的也不能完全說明是陰性結果。在量少的情況下，也可能延遲到48小時后才產(chǎn)氣，此時應視為可疑結果，因此，以上兩種結果均需繼續(xù)做下面兩部分實驗，才能確定是否是大腸菌群。48小時后仍不產(chǎn)氣的為陰性結果。2 .平板分離平板培養(yǎng)基一般使用復紅亞硫酸鈉瓊脂（遠藤氏培養(yǎng)基，EndJsmedium）或伊紅美藍瓊月旨（eosinmethyleneblueagar,EMBagar）,前者含有堿性復紅染料，在此作為指示劑，它可被培養(yǎng)基中的亞硫酸鈉脫色，使培養(yǎng)基呈淡粉紅色，大腸菌群發(fā)酵乳糖后產(chǎn)生的酸和乙醛即和復紅反應，形成深紅色復合物，使大腸

3、菌群菌落變?yōu)閹Ы饘俟鉂傻纳罴t色。亞硫酸鈉還可抑制其他雜菌的生長。伊紅美藍瓊脂平板含有伊紅與美藍染料，在此亦作為指示劑，大腸菌群發(fā)酵乳糖造成酸性環(huán)境時，該兩種染料即結合成復合物，使大腸菌群產(chǎn)生與遠藤氏培養(yǎng)基上相似的、帶核心的、有金屬光澤的深紫色（龍膽紫的紫色）菌落。初發(fā)酵管24小時內產(chǎn)酸產(chǎn)氣和48小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的均需在以上平板上劃線分離菌落。3 .復發(fā)酵試驗以上大腸菌群陽性菌落，經(jīng)涂片染色為革蘭氏陰性無芽胞桿菌者，通過此試驗再進一步證實。原理與初發(fā)酵試驗相同，經(jīng)24小時培養(yǎng)產(chǎn)酸又產(chǎn)氣的，最后確定為大腸菌群陽性結果。三、器材乳糖蛋白陳發(fā)酵管（內有倒置小套管），三倍濃縮乳糖蛋白陳發(fā)酵管（瓶）（內有倒置

4、小套管），伊紅美藍瓊脂平板，滅菌水；載玻片，滅菌帶玻璃塞空瓶，滅菌吸管，滅菌試管等。四、操作步驟1 .水樣的采取同實驗五十九。2 .自來水檢查（1）初（步）發(fā)酵試驗在2個含有50ml三倍濃縮的乳糖蛋白陳發(fā)酵燒瓶中，各加入100ml水樣。在10支含有5ml三倍濃縮乳糖蛋白陳發(fā)酵管中，各加入10ml水樣（如圖XIV-1）。混勻后，37c培養(yǎng)24小時，24小時未產(chǎn)氣的繼續(xù)培養(yǎng)至48小時。（2）平板分離經(jīng)24小時培養(yǎng)后，將產(chǎn)酸產(chǎn)氣及48小時產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管（瓶），分別劃線接種于伊紅美藍瓊脂平板上，再于37c下培養(yǎng)1824小時，將符合下列特征的菌落的一小部分，進行涂片，革蘭氏染色，鏡檢。（a）深紫黑色、

5、有金屬光澤。（b）紫黑色、不帶或略帶金屬光澤。（c）淡紫紅色、中心顏色較深。（3）復發(fā)酵試驗經(jīng)涂片、染色、鏡檢，如為革蘭氏陰性無芽抱桿菌，則挑取該菌落的另一部分，重新接種于普通濃度的乳糖蛋白陳發(fā)酵管中，每管可接種來自同一初發(fā)酵管的同類型菌落13個，37C培養(yǎng)24小時，結果若產(chǎn)酸又產(chǎn)氣，即證實有大腸菌群存在。證實有大腸菌群存在后，再根據(jù)初發(fā)酵試驗的陽性管（瓶）數(shù)查表XIV-2,即得大腸菌群數(shù)。表xivr大J&菌群檢數(shù)去接種水樣總量如小虱(1。01山柳，1口同10份)水量的陽性管致012每升水祥中每升水禪中短升水樣中10ml水星的陽性管大腸菌曾寓趣菌群數(shù)大腸菌群數(shù)0_<341113&

6、#163;1S2713273113341424立530加6.22369272T43120g31堂936602301041>2303 .池水、河水或湖水等的檢查(1)將水樣稀釋成10-1與10-2。(2)分別吸取1ml10-2、101的稀釋水樣和1ml原水樣，各入裝有10ml普通濃度乳糖蛋白陳發(fā)酵管中。另取10ml和100ml原水樣，分別注入裝有5ml和50ml三倍濃縮乳糖蛋白陳發(fā)酵液的試管(瓶)中。(3)以下步驟同上述自來水的平板分離和復發(fā)酵試驗。(4)將100、10、1、0.1(10-1)ml水樣的發(fā)酵管結果查表XIV-3,將10、1、0.1(10-1)、0.01(10-2)ml水樣的

7、發(fā)酵管結果查表XIV-4,即得每升水樣中的大腸菌群數(shù)。表XIY-3大跖菌群檢數(shù)表接種泳樣總量ULlml（100ml、10ml、0.1ml各1份）接種水樣量（ml）每升水樣中大腸菌辭數(shù)1001010.1<9一一+9一+9+MB95+18+19+22+23一+改十一+92十十94+180+230+一+960十+十2380十十十+>2380大腸菌常發(fā)酵陽性："一"大腸菌群發(fā)港陰性.表Xiv-4大幅營春檢翻表接種水樣總量1L11m1(10.L0,1>口J01血31怫接種水樣量(HL1)每升水樣中大腸菌辭教.10.10.10.01<90+90+宛4-95一+18C十一十19C*十2冢4一獨一中十*2EC十十920十十9404+1SOO4+230044+5600+十十238m寸十十十238C0_五、實驗報告1 .結果(1)自來水100ml水樣的陽性管數(shù)是多少？10ml水樣的陽性管數(shù)是多少？查表知V-2得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少？(2)池水、河水或湖水陽性結果記“+”；陰性結果記“-”。查表知V-3得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少?查表知V-4得每升水樣中大腸菌群數(shù)是多少?水祥首(