石蠟組織切片實驗操作練習詳細指導

1、石蠟切片實驗操作練習詳細指導提供給實驗室的實驗用品及每個小組的用量：1、器材切片刀，切片機，恒溫箱，溫臺，熔蠟爐，蠟杯，酒精燈，蠟鏟，展片臺，解剖刀，解剖針， 解剖剪，解剖盤，培養(yǎng)皿，吸管，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，灑精燈，包埋紙盒，染色 缸，蓋玻片，載玻片，玻片盤，樹膠，樹膠瓶，顯微鏡，溫度計，臉盆，水浴鍋。2、試劑卡諾氏固定液、FAA固定液、各種濃度的酒精、二甲苯、石蠟、蜂蠟、埃利希木精染液，1%伊紅酒精溶液，1%鹽酸酒精溶液，甘油蛋白粘片劑，郝普特氏粘片劑，中性樹膠。1%番紅，1%固錄，1%±碘酸，Schiff試劑，0.5%偏重亞硫酸鈉溶液，醋酸酐 -吡啶混合液，0.5%1%

2、 淀粉糖化酶溶液。3、材料鼠肝、腎、心肌、骨骼肌或其他組織、大豆或小麥、綠豆、洋蔥、大蒜、蠶豆的根、莖、葉 等。4、每個實驗小組的用量（一）器材切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，熔蠟爐，水浴鍋等這類幾個小組用一臺就行；解剖刀，單 面刀片，小臺木，毛筆一只，蠟鏟一個，蓋玻片和載玻片30個，臉盆一個，酒精燈各一個，包埋紙盒23個，染色缸一個，瓷杯 3個，顯微鏡一臺。（二）試劑FAA固定液 50ml、1%番紅 100ml、1%固綠 100ml、1%過碘酸 100ml、Schiff 試劑 100ml、亞 硫酸鹽300ml、醋酸酐-吡啶混合液100ml、0.5%1%£粉糖化酶溶液 200ml，石蠟

3、半盒、蜂 蠟10塊、埃利希木精染液 100ml、1%尹紅酒精溶液100ml、1%鹽酸酒精溶液100ml、95%酉 精5瓶、二甲苯2瓶，甘油蛋白粘片劑數(shù)滴，中性樹膠數(shù)滴。（三）材料小白鼠一只、蠶豆種，小麥和大豆種1020粒，洋蔥和大蒜由實驗室統(tǒng)一種，然后取其所需部分。石蠟切片法實例（一）木精-伊紅對染法一、目的要求1、熟悉石蠟切片的制作過程。2、掌握HE染色的基本原理和染色方法。二、實驗原理石蠟切片是最基本的切片技術(shù)，冰凍切片和超薄切片等都是在石蠟切片基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。木素與伊紅對比染色法（簡稱H.E.對染法）是組織切片最常用的染色方法。這種方法適用圍廣泛，對組織細胞的各種成分都可著色，便于全面

4、觀察組織構(gòu)造， 而且適用于各種固定液固定的材料，染色后不易褪色可長期保存。經(jīng)過HE染色，細胞核被木素染成藍紫色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。三、實驗用品（一）器材切片機，切片刀，溫臺，恒溫箱，解剖刀，鑷子，剪刀，解剖針，單面刀片，小臺木，灑精燈，包埋紙盒，染色缸，燒杯，水盆，熔蠟爐，蠟杯。（二）試劑卡諾（Carnoy ）固定液，埃利希木精染液，1%尹紅酒精溶液，19鹽酸乙醇液，各級酒精（30%50% 70% 80% 90% 95% 100%），二甲苯，甘油蛋白粘片劑，中性樹膠。試劑配法：1、卡諾氏固定液：100%酒精 3 份冰醋酸1份或：100%酉精6份氯仿3份冰醋酸1份2、埃利希木精染液的配法

5、：木精1g純酒精50ml冰醋酸5 ml甘油50 ml鉀磯（硫酸鋁鉀）約 5g （飽和量）蒸餾水50 ml配法：i、將木精溶于約 15 ml的純酒精中，再加冰醋酸后攪拌。ii、當木精溶解后即將甘油倒入并搖動容器，同時加入其余的酒精。iii、將鉀磯在研缽中研碎并加熱，然后將它溶解于水中。iv、將溫熱的鉀磯溶液一滴一滴地加入上述染液中，并隨時攪動。V、此液混合完畢，將瓶口用一層紗布包著小塊棉花塞起來，放在暗處通風的地方，并經(jīng)常搖動以促進它的成熟。成熟時間約34周。若加入0.2g碘酸鈉，可立刻成熟。此液穩(wěn)定而染色均勻，染核效果良好，不會發(fā)生沉淀，長期貯備無妨。此液可分別與伊紅等進行二重染 色。3、1%

6、尹紅酒精溶液：伊紅1g溶于100 ml95%酒精溶液。4、1%酸乙醇液鹽酸1份70%酉精100份5、甘油蛋白貼片劑：蛋白50 ml甘油50 ml水酸鈉(防腐劑)1g配制時將雞蛋一個打破入碗或杯中，去蛋黃留下蛋白，用玻棒調(diào)打成雪花狀泡沫，然后用粗紙或雙層紗布過濾到量筒中，經(jīng)數(shù)小時或一夜，即可濾出透明蛋白液。 此時在其中再加等量的甘油，稍稍振搖使兩者混合。最后加入防腐劑(水酸鈉)作防腐用?？杀４鎺讉€月。(三) 材料鼠肝三、實驗程序1、取材頸椎脫臼法處死小鼠，打開腹腔，剪取肝組織(或小腸)。切取的組織塊不宜太大，以便固定劑穿透，通常以 5mrh( 5mM 2mm或10 mnK 10 mnK 2 mm

7、為宜。取下所需要的肝組織，切 成一小塊23mml厚。取材的注意事項：(1 )取材動作要迅速，不宜作太久的拖延以免組織細胞的成分、結(jié)構(gòu)等發(fā)生變化。(2) 切片材料應(yīng)根據(jù)需要觀察的部位進行選擇，盡可能不要損傷所需要的部分。2、固定將切好的肝組織用生理鹽水組織洗一下，立即投入卡諾固定液中固定，固定3050min。固定的注意事項：(1) 一般固定液，都以新配為好，配好后應(yīng)貯存在陰涼處，不宜放在日光下，以免引起化 學變化，失去固定作用。(2) 有些混合固定液的成份之間會發(fā)生氧化還原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早，固定時就沒有作用了。（3）固定材料時，固定液必須充足，一般為材料塊的2030倍，有

8、些水分多的材料，中間應(yīng)更換12次新液。（4 ）材料固定完畢后，保存于嚴密緊塞或加蓋的容器里，同時在容器外上標簽，并隨同材 料在溶液中投入相應(yīng)的標簽，以免相互混淆。標簽上注明固定液、材料來源、日期等。標簽 上的文字，應(yīng)用黑色鉛筆或繪圖黑墨水書寫。1、洗滌材料經(jīng)固定后，除乙醇外，組織中的固定液必須沖洗干凈，尤其是含有重金屬的固定液。因 為殘留在組織中的固定液，有的不利于染色，有的產(chǎn)生沉淀或結(jié)晶影響觀察。沖洗方法根據(jù) 固定液的性質(zhì)而定，固定液為水溶液的常用水洗滌，固定液含有乙醇的則用50%70（乙醇沖洗。2、脫水30% 50% 70% 80% 90%各級乙醇溶液脫水各 40min，放入95% 100

9、%各兩面三刀次，每次20min。各種材料經(jīng)固定與洗滌后，組織中含有大量水分，由于水與石蠟不能互溶，所以必 須將組織中的水分除去。脫水注意事項（1）脫水必須在有蓋的玻璃品中進行，防止吸收空氣中的水分。（2）在更換高一級的脫水劑時，最好不要移動材料以免損壞，可用吸管吸出器皿中的脫水劑，再用吸水吸盡器皿剩余液，然后于皿中加入高一級脫水劑。（3）在低濃度或純酒精中，每級停留不宜太長，否則易使組織變軟，助長材料的解體。（4）在高濃度或純酒精中，每級停留的時間也不宜太長，否則會使組織變脆，影響切片。（5 ）如需過夜，應(yīng)停留在 70%酒精中。（6）脫水必須徹底，否則不易透明，甚至使透明劑出現(xiàn)白色混濁現(xiàn)象5、

10、透明純酒精、二甲苯等量混合液15min，二甲苯0.5h （或至透明為止），須換一次二甲苯。由于乙醇與石蠟不相溶，而二甲苯既能溶于乙醇又能溶于石蠟，所以脫水后還要經(jīng)過二甲苯以過渡。當組織中全部被二甲苯占有時，光線可以透過，組織呈現(xiàn)出不同程度的透明狀態(tài)。透明注意事項（1）使用透明劑時，要隨時蓋緊蓋子，以免空氣中的水分進入。（2 ）更換每級透明劑，動作要迅速，一方面為了不使材料塊干涸，另一方面能避免吸收濕 氣。（3）在透明過程中，如果材料周圍出現(xiàn)白色霧狀，說明材料中的水未被脫凈，應(yīng)退回純酒精中重新脫水，然后再透明。6、透蠟放入二甲苯和石蠟各半的混合液15min，再放入石蠟I、石蠟n透蠟各 2030分

11、鐘。透蠟的目的是除去組織中的透明劑（如二甲苯等），使石蠟滲透到組織部達到飽和程度以便包埋。透蠟時間根據(jù)組織的透蠟時間較長，約需12d。透蠟應(yīng)在恒溫箱進行，并保持箱溫度在5560C左右，注意溫度不要過高，以免組織發(fā)脆。置于恒溫箱0.5h。透蠟注意事項（1）盡量保持在較低溫度中進行，以石蠟不凝固為度；（2 ）透蠟溫度要恒定，不可忽高忽低；（3）操作要迅速，力求在最短的時間完成石蠟透入過程，以免引起組織變硬、變脆、收縮1、包埋將經(jīng)過透蠟的組織連同熔化的石蠟，一起倒入容器，然后立即投入冷水中，使其立刻凝固成蠟塊。用于包埋的石蠟的熔點在 5060C之間，包埋時應(yīng)根據(jù)組織材料、切片厚度、氣候條件等因 素，

12、選擇不同熔點的石蠟。一般動物材料常用的石蠟熔點為5256 C,植物材料用的石蠟熔點為 5458C。包埋的操作過程包埋時，將紙盒放在已經(jīng)加熱的溫臺上，從溫箱中取出盛放純石蠟的蠟杯，倒入包埋用的紙盒中，取出存放材料的蠟杯 3，迅速輕輕地用鑷子夾取材料平放于紙盒底部（注意切面朝下 放置），再用溫鑷子輕輕撥動材料，使之排列整齊。輕輕將紙盒兩側(cè)的把手提起，慢慢地平 放在面盆，并立即使它沉入水中，使盒中包埋塊迅速凝固。待石蠟完全凝固（約30min ）后即可取出備用。2、切片 將已固定和修好的石蠟塊臺木裝在切片機的夾物臺上。 將切片刀固定在刀夾上，刀口向上。 搖動推動螺旋，使石蠟塊與刀口貼近，但不可超過刀口

13、。 調(diào)整石蠟塊與刀口之間的角度與位置，刀片與石蠟切片約成15度左右。 調(diào)整厚度調(diào)節(jié)器到所需的切片厚度，一般為 410微米。 一切調(diào)整好后主可以開始切片。此時右手搖動轉(zhuǎn)輪，讓蠟塊切成蠟帶，左手持毛筆將蠟帶提起，搖轉(zhuǎn)速度不可太急，通常以4050r/min。 切成的蠟帶到2030cm長時，右手用另一支毛筆輕輕將蠟帶挑起，以免卷曲，并牽引成帶，平放在蠟帶盒上，靠刀面的一面較光滑，朝下，較皺的一面朝上。 用單面刀片切取蠟片一小段，放在載玻上加水一滴， 置于放大鏡或顯微鏡下觀察切片是否良好。 切片工作結(jié)束后，應(yīng)將切片刀取下用氯仿擦去刀上沾著的石蠟，把切片機擦拭干凈妥為保存。3、貼片 、取一片清潔的載玻片，

14、滴一滴粘片劑于玻片中央，然后用洗凈的手指加以涂抹，便成均 勻薄層。 、滴12滴的蒸餾水已涂粘片劑的載玻片上。 、用小鑷子夾取預先用刀片割開的蠟帶，放在水面上，注意蠟片光亮平整的一面貼于玻片上，并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。 、把玻片擺好片位置，在酒精燈火焰上方適度加熱至蠟片舒展?；蚍胖弥糜陬A先加熱的展片臺上（溫度保持在 4045C）。此時蠟片因受熱而伸展攤平。并使之處于稍偏玻片的一端，另一端便于粘貼標簽。 、展片后把載玻片放在平盤上編好記號置于37C溫箱烘干，一晝夜干燥后即可取出存放于切片盒待染。10、脫蠟復水石蠟切片經(jīng)二甲苯I、n脫蠟各510min，然后放入100% 95%

15、90% 80% 70%等各級酒精溶液中各35min，再放入蒸餾水中 3min。染色液多數(shù)為水溶液，因此，染色前必須將蠟脫去，使切片中的材料由有機相進入到水相。一般采用二甲苯脫蠟，逐級復水與脫水浸蠟過程正好相反，但是，由于蠟片較薄，所需時間比脫水浸蠟要短的多。11、染色切片放入木精中染色約1030min。染色時間應(yīng)根據(jù)染色劑的成熟程度及室溫高低，適當縮短或延長。室溫高時促進染色， 染色時間可短些， 否則可適當延長時間，冬季室溫低時可放 入恒溫箱中染色。12、水洗用自來水流水沖洗約 15min。沖洗過程中使切片顏色發(fā)藍（或放入堿性水中也可，但用促藍劑對伊紅可能拒染，如果時間來得及，應(yīng)以流水沖洗使切

16、片顯示藍色為宜），但要注意流水不能過大，以防切片脫落，并隨時用顯微鏡檢查見顏色變藍為止。13、分化就是將細胞質(zhì)著的色褪去，使細胞核著色更加鮮明，也稱分色。將切片放入1%鹽酸乙醇液（鹽酸1份+70%乙醇100份）中褪色，見切片變紅，顏色較淺即可，約數(shù)秒至數(shù)十秒鐘。這一步驟是H.E.染色成敗的關(guān)鍵，如分化不當會導致染色不勻，或深或淺，得到的切片染色 效果差。如果染色適中，可取消此步驟。14、漂洗切片再放入自來水流水中使其恢復藍色。低倍鏡檢查見細胞核呈藍色、結(jié)構(gòu)清楚；細胞質(zhì)或結(jié)締組織纖維成分無色為標準。然后放入蒸餾水中漂洗一次。15、脫水I切片入50%乙醇t 70%醇t 80聽醇中各 35min。1

17、6、復染用0.5%伊紅乙醇液對比染色 25min。伊紅主要染細胞質(zhì)，著色濃淡應(yīng)與木精染細胞核的濃 淡相配合，如果細胞核染色較濃，細胞質(zhì)也應(yīng)濃染，以獲得鮮明的對比。反之，如果細胞核 染色較淺，細胞質(zhì)也應(yīng)淡染。可在伊紅乙醇液中滴加數(shù)滴冰醋酸助染，促使細胞質(zhì)容易著色，并且經(jīng)乙醇脫水時不易褪色。17、脫水n放入95%乙醇中洗去多余的紅色，然后放入無水乙醇中 35min。最后用吸水紙吸干多余的乙 醇。1&透明切片放入二甲苯-乙醇等量混合液中約 5min，然后放入純二甲苯I、 n中各35min。二甲苯 應(yīng)盡量保持無水，應(yīng)經(jīng)常更換，或用紗布包無水硫酸銅放入染色缸吸收水分。切片如在二甲苯中出現(xiàn)白霧現(xiàn)象

18、，說明脫水未盡，應(yīng)退回乙醇中重新脫水，否則切片難以鏡檢。19、封藏：中性樹膠封存切片經(jīng)染色、脫水、透明后，即可用封藏劑將其封藏起來，目的是永久保存切片，便于鏡檢。常用的封藏劑一類為干性封藏劑如中性樹膠、加拿大樹膠等，另一類為濕性封藏劑如甘油明膠等。如果切片是經(jīng)二甲苯透明，則用樹膠作為封藏劑， 樹膠可以用二甲苯稀釋至合適的稠度。如果切片是直接從水中或水溶液中取出，則常用甘油明膠作為封藏劑，可用于短期保存標本。封藏的方法：封片前應(yīng)根據(jù)材料的大小，選用不同規(guī)格的蓋玻片。材料透明后，按照下列方法進行封藏。在桌上放一潔凈的吸水紙，將含材料的載玻片從二甲苯中取出放在紙上（切片的一面向上），迅速地在切片的中

19、央滴一滴樹膠（千萬不能待二甲苯干燥后再進行），用右手持小鑷子輕輕地夾住蓋玻片的右側(cè)，稍為傾斜使其左側(cè)與封藏劑接角，然后再緩慢地將蓋玻片放下，這樣就可以減少或避免產(chǎn)生氣泡。如膠液不足，可以用玻棒再滴一滴樹膠從蓋玻片邊緣補足。如膠液過多，可在干燥以后用刀刮去，并用紗布蘸二甲苯拭去殘留的樹膠。染色結(jié)果：細胞核被木素染成藍色，細胞質(zhì)被伊紅染色呈粉紅色。實驗報告1簡述石蠟切片的主要過程。2、分析影響HE染色的主要因素。石蠟切片法實例（二）番紅-固綠對染法一、目的要求1、熟悉植物石蠟切片的制作過程。2、掌握番紅-固綠對染法的基本原理和具體方法。二、實驗原理石蠟切片法也是在研究植物細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面常用的

20、制片方法。它可以使植物材料切成薄的薄片，又可以切成連續(xù)薄片，切片經(jīng)染色，觀察效果甚好。番紅-固綠對染法，為植物制片上最普遍的一種二重染色法，其染色程序簡單并能清晰地顯示出細胞的結(jié)構(gòu)。番紅為堿性染料，能使細胞核及木質(zhì)化的細胞壁染成紅色；固綠為酸性染料，能使細胞質(zhì)及纖維素的細胞壁染成綠色。三、實驗用品（一）器材切片刀，切片機，溫箱，溫臺，解剖刀，鑷子，單面刀片，臺木，毛筆，蠟鏟，酒精燈，包 埋紙盒，染色缸，玻片盤，溫度計，臉盆。（二）試劑FAA固定液，1%番紅，1%固綠，各級酒精（30% 50% 70% 80% 90% 95% 100%）,二甲 苯，石蠟，郝普特氏明膠粘片劑，樹膠。試劑配法：1、F

21、AA固定液（福爾馬林-醋酸-灑精混合液） 福爾馬林5 ml50%或 70%勺灑 90 ml冰醋酸5 ml此液適用于植物組織，此液中的酒精，有用50%的，也有用70%勺，一般薄嫩的材料右用 50%的，厚硬的材料用 70%勺，醋酸的用量也可根據(jù)材料情況作適當?shù)母淖?，對一些大塊而密實 的組織可增加用量，同時減少福爾馬林的用量。固定時間可因材料及醋酸含量的變化而異， 一般為520h。固定的材料，一般無需用水洗，可直接從70%勺酒精開始脫水。1、1%番紅番紅1g溶于100ml水中。2、1%固綠1g固綠溶于100ml95%酉精中。3、郝普特氏明膠粘片劑明膠1g蒸餾水100ml石炭酸2g甘油15ml配制時先將明膠溶解于 30 C的蒸餾水中（在水浴鍋進行），待溶解后再加石炭酸和甘