降纖酶SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳操作規(guī)程

1、中國3000萬經(jīng)理人首選培訓(xùn)網(wǎng)站降纖酶SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳操作規(guī)程 目的： 建立降纖酶SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作規(guī)程，保證正確操作。 2. 依據(jù)： 中華人民共和國衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)（試行）（97）衛(wèi)藥標(biāo)字01號。 3. 范圍： 適用于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定降纖酶分子量及純度的操作。 4. 職責(zé)： QC檢驗員對本標(biāo)準(zhǔn)的實施負(fù)責(zé)。5. 程序： 5.1. 定義：SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白分子量，是根據(jù)大多數(shù)蛋白都能與陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉（SDS）按重量比結(jié)合成復(fù)合物，使蛋白分子所帶的負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過天然蛋白分子的凈電荷，消除了不同蛋白分子的電荷效應(yīng)，使蛋白分子相對遷移率（R

2、f）的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白的對數(shù)和相對遷移率所作的標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出供試品的分子量。5.2. 儀器裝置：由穩(wěn)壓電泳儀和垂直板電泳槽組成。5.3. 試劑與儀器：-巰基乙醇、丙烯酰胺、N，N 亞甲基雙丙烯酰胺、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴酚藍(lán)、甘氨酸、過硫酸銨、三氯醋酸、甲醇、考馬斯亮藍(lán)R-250、甘油、鹽酸、醋酸、四甲基乙二胺。燒杯、刻度吸管、微量移液器。5.4. 溶液的配制：5.4.1. 丙烯酰胺N，N亞甲基雙丙烯酰胺貯備溶液：稱取丙烯酰胺29.2g。N、N亞甲基雙丙烯酰胺 0.8g，加水溶解，并稀釋至100ml，過濾至棕色瓶中，4保存。5.4

3、.2. 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH8.8）：稱取三羥甲基氨基甲烷18.15g，加水溶解，用2mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH值至8.8，加水稀釋至100ml，4保存。5.4.3. 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH6.8）：量取上述三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH8.8）適量，加水（1：3）稀釋，用2mol/L鹽酸液調(diào)節(jié)pH值至6.8，4保存。5.4.4. 10%十二烷基硫酸鈉溶液：稱取十二烷基硫酸鈉10g，加水溶解，并稀釋至100ml，室溫保存。5.4.5. 供試品緩沖液： 水 4.8ml 三羥甲基氨基甲烷緩沖液(6.8) 1.2ml 甘油 1.0ml 10%SDS溶液 2.0ml 0.5%(W/V)溴酚

4、藍(lán)溶液 0.5ml -巰基乙醇 0.5ml 總體積 10.0ml5.4.6. 電極貯存液（pH8.3）：稱取三羥甲基氨基甲烷15g，甘氨酸72g，SDS5g，加水溶解，并稀釋至1000ml，4保存。臨用前稀釋5倍。5.4.7. 10%過硫酸銨（臨用前配制）：稱取過硫酸銨1g，加水溶解并稀釋至10ml。5.4.8. 固定液：稱取5g三氯醋酸，加水200ml溶解，加甲醇200ml，再加水至500ml。5.4.9. 染色液，稱取0.5g考馬斯亮藍(lán)R-250，溶于200ml水中，量取甲醇200ml與醋酸50ml，三液合并，加水至500ml。5.4.10. 脫色液：量取甲醇400ml、醋酸100ml，加

5、水至1000ml，充分混合。5.4.11. 保存液：量取甲醇400ml、醋酸100ml與甘油100ml，加水至1000ml充分混合。5.5. 凝膠的制備：5.5.1. 分離膠的制備（12%）： 水 3.35ml 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH8.8） 2.5ml 10%SDS 100l 丙烯酰胺N, N 亞甲基雙丙烯酰胺貯備液 4.0m l 脫氣15分鐘以上 10%過硫酸銨 50l 四甲基乙二胺 5l將分離膠充分混合后，小心地倒入膠膜中，再在膠面上覆上一層水，水平靜置直至膠體凝固。5.5.2. 濃縮膠的配制： 水 6.1ml 三羥甲基氨基甲烷緩沖液（pH6.8） 2.5ml 10%SDS 100

6、l 丙烯酰胺N，N 亞甲基雙丙烯酰胺貯備液 1.3ml 脫氣15分鐘以上 10%過硫酸銨 50l 四甲基乙二胺 10l將分離膠上的水層去掉，倒入混合好的濃縮膠，插入“梳子”，“梳子”底部與分離膠的前沿相距約1cm，水平放置直到膠體凝固。 5.6. 供試品的制備： 5.6.1. 標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液：按標(biāo)準(zhǔn)蛋白的蛋白含量，加供試品緩沖液制成每1l中含1g蛋白的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。臨用前置沸水浴中5分鐘，冷卻。 5.6.2. 供試品溶液：按供試品的蛋白含量，加供試品緩沖液制成每1l中含1g蛋白的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液。臨用前置沸水浴中5分鐘，冷卻。電 泳：凝膠板制好后，取出梳子，各孔加510l 的供試品溶液或標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液

7、，倒入電極緩沖液，接通電源，調(diào)節(jié)起始電壓100伏以下進(jìn)行電泳，數(shù)分鐘后，待樣品進(jìn)入分離膠以后，加大電壓至200伏電泳，直到溴酚藍(lán)接近膠板底部時，關(guān)閉電源，停止電泳，取下膠板。用尺子量出分離膠的長度并記錄，同時在溴酚藍(lán)前沿處做標(biāo)記。5.8. 膠板的處理：5.8.1. 將膠板置于固定液中，固定至溴酚藍(lán)變成黃色（約1530分鐘）。5.8.2. 將固定后的膠板置于染色液中，于37染色約23小時。5.8.3. 將染色的膠板置于脫色液中，不斷更換脫色液直至藍(lán)色背景脫凈。5.8.4. 將膠板觀察結(jié)果、記錄、編號，然后保存于保存液中。5.9. 結(jié)果觀察及數(shù)據(jù)處理：5.9.1. 觀察膠面有幾條電泳帶，依據(jù)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做出判斷。5.9.2. 以標(biāo)準(zhǔn)蛋白分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)，以相對遷移率為橫坐標(biāo)，線性回歸作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，將供試品的相對遷移率代入回歸方程，求得供試品的分子量。 計算公式： Rf=L1×L3L2L4 式中：Rf 為標(biāo)準(zhǔn)蛋白或供試品的相對遷移率； L1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白或供試品移動的距離； L2為溴酚藍(lán)