轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述

1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展綜述摘要：轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)作為一種新的高效、快捷的轉(zhuǎn)錄組研究手段正在改變著人們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的認(rèn)識(shí)。RNA-Seq利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)組織或細(xì)胞中所有RNA反轉(zhuǎn)錄而成cDNA文庫進(jìn)行測(cè)序，通過統(tǒng)計(jì)相關(guān)讀段(reads激計(jì)算出不同RNA的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本；如果有基因組參考序列，可以把轉(zhuǎn)錄本映射回基因組，確定轉(zhuǎn)錄本位置、剪切情況等更為全面的遺傳信息，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。文章主要比較近年來轉(zhuǎn)錄組研究的幾種方法和幾種RNA-Seq的研究平臺(tái)，著重介紹RNA-Seq的原理、用途、步驟和生物信息學(xué)分析，并就RNA-Seq技術(shù)面臨的挑

2、戰(zhàn)和未來發(fā)展前景進(jìn)行了討論及在相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用等內(nèi)容，為今后該技術(shù)的研究與應(yīng)用提供參考。關(guān)鍵詞：RNA-Seq;原理應(yīng)用；方法；挑戰(zhàn)；發(fā)展前景Abstract：Transcriptomesequencing(RNA-Seq)isakindofhighefficiency,quicktranscriptomeresearchmethodsarechangingourunderstandingoftranscriptome.RNA-Seqtousehigh-throughputsequencingoftissuesorcellsofallRNAreversetranscriptionintocDNA

3、libraryweresequenced,throughstatisticalcorrelationreadparagraph(reads)numberswerecalculatedfromtheexpressionofdifferentRNAtranscripts,findnew;ifthegenomereferencesequence,thetranscriptsmappedtogenomic,determinethepositionofthetranscriptionshearcondition,moregeneticinformation,hasbeenwidelyusedinbiol

4、ogicalresearch,medicalresearch,clinicalresearchanddrugdevelopment.ThispapercomparedseveralmethodsofplatformtranscriptomestudiesandseveralkindsofRNA-Seqinrecentyears,RNA-Seqfocusesontheprinciple,purpose,stepsandbioinformaticsanalysis,anddiscussestheRNA-Seqtechnologychallengesandfuturedevelopmentprosp

5、ectandtheapplicationinrelatedfieldandothercontent,providethereferencefortheresearchandapplicationofthetechnologyfuture.Keyword：RNA-Seq;application;principle;method;challenge;developmentprospects前言：轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的集合。轉(zhuǎn)錄組研究能夠從整體水平研究基因功能以及基因結(jié)構(gòu)，揭示特定生物學(xué)過程以及疾病發(fā)生過程中的分子機(jī)理。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序(RNA-Seq)是指

6、利用第二代高通量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行cDNA測(cè)序，全面快速地獲取某一物種特定器官或組織在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本。隨著后基因組時(shí)代的到來，轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等各種組學(xué)技術(shù)相繼出現(xiàn)，其中轉(zhuǎn)錄組學(xué)是率先發(fā)展起來以及應(yīng)用最廣泛的技術(shù)1。遺傳學(xué)中心法則表明，遺傳信息在精密的調(diào)控下通過信使RNA(mRNA)從DNA傳遞到蛋白質(zhì)。因此，mRNA被認(rèn)為是DNA與蛋白質(zhì)之間生物信息傳遞的一個(gè)“橋梁”，而所有表達(dá)基因的身份以及其轉(zhuǎn)錄水平，綜合起來被稱作轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)2。轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細(xì)胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，主要包括mRNA和非編碼RNA(non-

7、codingRNA,ncRNA)2,3。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn),了解轉(zhuǎn)錄組是解讀基因組功能元件和揭示細(xì)胞及組織中分子組成所必需的，并且對(duì)理解機(jī)體發(fā)育和疾病具有重要作用。整個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析的主要目標(biāo)是：對(duì)所有的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行分類；確定基因的轉(zhuǎn)錄結(jié)構(gòu)，如其起始位點(diǎn)，5和3'末端，剪接模式和其他轉(zhuǎn)錄后修飾；并量化各轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下(如生理/病理)表達(dá)水平的變化2,3。在過去的十幾年里，雜交技術(shù)的發(fā)展，再加上以標(biāo)簽序列為基礎(chǔ)的方法的應(yīng)用，第一次使研究人員對(duì)這一領(lǐng)域有了深入的了解，但毋庸置疑，隨著新一代測(cè)序(Next-generationsequencingNGS)

8、平臺(tái)的市場(chǎng)化，RNA-Seq(RNAsequencing技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)徹底改變了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的思維方式。RNA-Seq，即RNA測(cè)序又稱轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，是最近發(fā)展起來的利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)3，該技術(shù)能夠在單核苷酸水平對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，在分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平的同時(shí)，還能發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，精確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP(編碼序列單核甘酸多態(tài)性)，提供更為全面的轉(zhuǎn)錄組信息。相對(duì)于傳統(tǒng)的芯片雜交平臺(tái)，RNA-Seq無需預(yù)先針對(duì)已知序列設(shè)計(jì)探針，即可對(duì)任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)，更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄

9、組復(fù)雜性的強(qiáng)大工具，已廣泛應(yīng)用于生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)研究、臨床研究和藥物研發(fā)等。本文在扼要介紹支持RNA-Seq的新一代測(cè)序平臺(tái)的基礎(chǔ)上，對(duì)RNA-Seq原理、特點(diǎn)以及到目前為止在研究真核生物轉(zhuǎn)錄特征方面的進(jìn)展做一個(gè)較為全面的綜述，并對(duì)其中有待進(jìn)一步研究的問題進(jìn)行了展望。1、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序基本原理及平臺(tái)4隨著后基因組時(shí)代的到來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序成為率先發(fā)展且應(yīng)用相對(duì)廣泛的技術(shù)5。最早廣泛應(yīng)用測(cè)序技術(shù)為70年代的Sanger法，這也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)，因其測(cè)序通量低、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，科學(xué)家們一直在尋求通量更高、速度更快、價(jià)格更便宜、自動(dòng)化程度更高的測(cè)序技術(shù)。自2005年以來，以Roche公司的454技術(shù)、I

10、llumina公司的Solexa技術(shù)以及ABI公司的SOLiD技術(shù)為標(biāo)志的高通量測(cè)序技術(shù)相繼誕生6。相較于傳統(tǒng)方法，該技術(shù)主要特點(diǎn)是測(cè)序通量高、測(cè)序時(shí)間和成本顯著下降，可以一次對(duì)幾十萬到幾百萬條DNA分子序列測(cè)定，這使某物種全基因組和轉(zhuǎn)錄組的全貌細(xì)致分析成為可能，又稱為深度測(cè)序，很多文獻(xiàn)中稱其為新一代測(cè)序技術(shù)，足見其劃時(shí)代意義7。利用深度測(cè)序技術(shù)進(jìn)行對(duì)某物種轉(zhuǎn)錄組分析的技術(shù)即RNA測(cè)序（RNA-Seq），該項(xiàng)技術(shù)能夠在單核苷酸水平對(duì)任意生物種的整體轉(zhuǎn)錄進(jìn)程檢測(cè)，不僅可以分析轉(zhuǎn)錄本的結(jié)構(gòu)和表達(dá)水平，還能夠發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本，準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)以及cSNP（編碼序列單核甘酸多態(tài)性），使

11、得到的轉(zhuǎn)錄組信息更為全面，便于進(jìn)一步注釋分類8。與基因芯片相比，RNA-Seq無需預(yù)先設(shè)計(jì)探針即可對(duì)特定條件下任意物種生長(zhǎng)發(fā)育階段整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，提供更精確的數(shù)字化信號(hào)、更高的檢測(cè)通量以及更廣泛的檢測(cè)范圍，因而其成為目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜變化活動(dòng)的強(qiáng)大且頗具優(yōu)越性的技術(shù)手段。一般來說，上述所有的高通量測(cè)序技術(shù)都能進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，但不同平臺(tái)和機(jī)型的測(cè)序方法及效果差異決定了各種高通量測(cè)序儀具有不同的應(yīng)用側(cè)重（表1），這就要求在熟悉各種高通量測(cè)序儀內(nèi)在技術(shù)特點(diǎn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行選擇應(yīng)用；另一方面，也可嘗試結(jié)合其他生物技術(shù)以獲得更好的數(shù)據(jù)覆蓋度和更為廉價(jià)的成本9。表1幾種主要測(cè)序平臺(tái)的比較10平片吃1

12、1社g*艇UGAI!工KnW4MGfiF1JCABlftOLihSiJLjtHHrlifceHtliSpifipf現(xiàn)仔修玨可逆集忖隔爵合鹿前庠情普酸含蒯序電價(jià)H成第序平為詵長(zhǎng)M）H035每岫費(fèi)用-1煙-2T第%*I*9RW并加5-兩事毛妻楮漠類用梅卷百人.麻磬盤嘮運(yùn)的同478優(yōu)點(diǎn)性精比品；目K應(yīng)對(duì)最廣茬雷惶民：豆行速度規(guī)率最K產(chǎn)艮鬲i文且刷住商風(fēng)不需塞DMA獷熠府推費(fèi)用餐高添長(zhǎng)肉;近行料間長(zhǎng)失德率而2、目前研究轉(zhuǎn)錄組的方法主要有（l）基于雜交技術(shù)，如CDNA芯片和寡聚核昔酸芯片；（2）基于測(cè)序技術(shù)，如早先基于Sange測(cè)序的SAGE（SerialAnalysisofGeneExpression

13、）和MpSS（Massivelypara-llelSignaturesequeneing）全長(zhǎng)DNA文庫和EST文庫的測(cè)序分析?，F(xiàn)在對(duì)CDNA、EST等的測(cè)序工作已升級(jí)為第二代測(cè)序技術(shù)新一代測(cè)序技術(shù)較sange測(cè)序技術(shù)通量更高、運(yùn)行時(shí)間更短、測(cè)序片段更長(zhǎng)現(xiàn)在通常將基于第二代測(cè)序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析稱為RNA-Seq。2.1、種主要的轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較見表2,其中RNA一Seq具有以下優(yōu)勢(shì)：（l）通量高，運(yùn)用第二代測(cè)序平臺(tái)可得到幾個(gè)到幾百億個(gè)堿基序列，可以達(dá)到覆蓋整個(gè)基因組或轉(zhuǎn)錄組的要求；（2）靈敏度高，可以檢測(cè)細(xì)胞中少至幾個(gè)拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本；（3）分辨率高，RNA-Seq的分辨率能達(dá)到單個(gè)堿

14、基，準(zhǔn)確度好，同時(shí)不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號(hào)帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題；（4）不受限制性，可以對(duì)任意物種進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組分析，無需預(yù)先設(shè)計(jì)特異性探針，能夠直接對(duì)任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。同時(shí)能夠檢測(cè)未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識(shí)別可變剪切位點(diǎn)及SNP、UTR區(qū)域3,4。表3是轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的比較，通過比較可以看出該技術(shù)應(yīng)用的范圍。3、RNASeq的主要用途11RNA一seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具有十分廣

15、泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：（l）檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；（2）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達(dá)量、不同樣本間差異表達(dá)；（3）非編碼區(qū)域功能研究，如microRNA、非編碼長(zhǎng)RNA（IncRNA）、RNA編輯；（4）轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；（5）開發(fā)SNPs和SSR等。表2三種轉(zhuǎn)錄組研究方法的比較10平臺(tái)nSiJinMH/SiilrnGAIiHdirm葡卻原理嘮#染料共培臺(tái)成朝序用分子白取剖甲早盤it長(zhǎng)（埠500S5每Mh型用-2-60-2-1而磷串有）予帕件換人、tt.t片毋國W胸T418睨點(diǎn)性怪地胃：目的取用景廣甌語性景仁；運(yùn)和遹圍長(zhǎng)產(chǎn)量高；義序制備厚單.不

16、需妻mu/增或厚樓餐點(diǎn)讀總6騎用高茂長(zhǎng)館i運(yùn)楙笄卡失疊等高表3RNA-Seq與其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)比較技術(shù)J.J11.心L品八仔日MFSfPLNA-S1原磔雜交Sun就目測(cè)用高通法巾信日貞尢鎮(zhèn)報(bào)信司效中化信弓敖寧化信方分辨幸數(shù)個(gè)-1gbp單堿基雉就班通£=7-1-raG俄島背墳itt低必表達(dá)定雁十現(xiàn)幾百儕是西困全轉(zhuǎn)錄組圖鑿而相對(duì)較低分析啦小起始R.NA用垃磐少3、RNASeq的主要用途11RNA一seq技術(shù)能夠在單核昔酸水平對(duì)特定物種的整體轉(zhuǎn)錄活動(dòng)進(jìn)行檢測(cè)，從而全面快速地獲得該物種在某一狀態(tài)下的幾乎所有轉(zhuǎn)錄本信息。由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以得到全部RNA轉(zhuǎn)錄本的豐度信息，加之準(zhǔn)確度又高，使得它具

17、有十分廣泛的應(yīng)用領(lǐng)域。主要應(yīng)用于：（l）檢測(cè)新的轉(zhuǎn)錄本，包括未知轉(zhuǎn)錄本和稀有轉(zhuǎn)錄本；（2）基因轉(zhuǎn)錄水平研究，如基因表達(dá)量、不同樣本間差異表達(dá)；（3）非編碼區(qū)域功能研究，如microRNA、非編碼長(zhǎng)RNA（IncRNA）、RNA編輯；（4）轉(zhuǎn)錄本結(jié)構(gòu)變異研究，如可變剪接、基因融合；（5）開發(fā)SNPs和SSR等。4、RNA-Seq的基本步驟11提取樣本總RNA后，根據(jù)所測(cè)RNA種類進(jìn)行分離純化。再進(jìn)而片段化為所用測(cè)序平臺(tái)所需的長(zhǎng)度（或反轉(zhuǎn)錄后片段化），反轉(zhuǎn)錄后連接測(cè)序接頭。接著利用PCR擴(kuò)增達(dá)到一定豐度上機(jī)測(cè)序，直到獲得足夠的序列。所得序列通過與參考基因組比對(duì)或從頭組裝（denovoassembl

18、ing形成全基因組范圍的轉(zhuǎn)錄譜。試驗(yàn)流程，如圖1所示。AAAAAAImm-boazhiRZA片四化處理AAAAAA反轉(zhuǎn)耒合通X5it>DNA.；E.-nt1：.rAAAAMMMMMMM*MMWTTTTnzA界酎子接送連接圖1RNAeq試驗(yàn)流程4.1、 送樣要求1）請(qǐng)?zhí)峁┱?qǐng)?zhí)峁㎡D260/280介于1.82.2之間，濃A250ng/i總量>40胭總RNA,并確保RNA無降解，無污染；或提供濃度>50ng/用1總量A400n的mRNAo2）送樣管務(wù)必標(biāo)清樣品編號(hào)，管口使用Parafilm膜密封。3) 樣品保存期間切忌反復(fù)凍融。4) 送樣時(shí)使用干冰運(yùn)輸。5) 質(zhì)檢以我方電泳膠圖、紫

19、外分析儀定量為準(zhǔn)。6) 請(qǐng)?zhí)顚懲暾乃蜆佑唵?，并提供RNA電泳檢測(cè)照片，用自封袋密封后隨同樣品一起送樣。5、序言轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)中的應(yīng)用隨著第二代測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，其高通量、快速、低成本的特點(diǎn)成為越來越多的生物學(xué)研究者在解決生物學(xué)問題時(shí)的首選，尤其在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方面更顯示出極大的潛力。轉(zhuǎn)錄組(transcriptome)是指特定生物體在某種狀態(tài)下所有基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的總和，轉(zhuǎn)錄組研究是功能基因組研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。轉(zhuǎn)錄組是連接基因組遺傳信息與生物功能(蛋白質(zhì)組)的必然紐帶，同時(shí)相對(duì)于真核生物全基因組測(cè)序來說，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的序列不含有內(nèi)含子及其它非編碼序列，因此轉(zhuǎn)錄組測(cè)序有著無可比擬

20、的高性價(jià)比優(yōu)勢(shì)。研究基因組結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及遺傳語言的根本規(guī)律，更需要對(duì)測(cè)序所得的海量數(shù)據(jù)進(jìn)行精準(zhǔn)且全面的揭示和分析，于是生物信息學(xué)便成為一門迅速興起的交叉學(xué)科，它位于生物、計(jì)算機(jī)、數(shù)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域的交叉點(diǎn)上，不斷深入去探索堿基序列數(shù)據(jù)背后的生物學(xué)意義。目前轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析技術(shù)可以解決新基因的深度發(fā)掘、低豐度轉(zhuǎn)錄本的發(fā)現(xiàn)、轉(zhuǎn)錄圖譜繪制、可變剪接的調(diào)控、代謝途徑確定、基因家族鑒定及進(jìn)化分析等各方面的問題。轉(zhuǎn)錄組研究是基因功能及結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)和出發(fā)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)學(xué)等許多領(lǐng)域。5.1、 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在生物學(xué)中的應(yīng)用快速獲得您感興趣的細(xì)胞、組織或生物體內(nèi)的mRNA種類及其豐度，幫助您發(fā)現(xiàn)

21、由于可變剪接或者可變多聚腺苷化位點(diǎn)選擇所產(chǎn)生的新mRNAisoforms;快速獲得您感興趣的不同細(xì)胞或者不同組織內(nèi)的mRNA種類及其豐度，分析mRNA的差異表達(dá)信息。通過差異表達(dá)基因功能分析，可以發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞分化，特別是胚胎干細(xì)胞和神經(jīng)干細(xì)胞分化，機(jī)體發(fā)育，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程中基因表達(dá)調(diào)控改變的整體特征；如果您希望研究某種基因如何通過改變細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來發(fā)揮其生物學(xué)功能，您可以對(duì)該基因進(jìn)行突變、敲除或敲低，然后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞內(nèi)的RNA-seq分析，通過差異表達(dá)分析即可以快速全面獲得您需要的信息。5.1.1、 哺乳動(dòng)物組織的轉(zhuǎn)錄組分析12哺乳動(dòng)物基因組的巨大性和復(fù)雜性給其轉(zhuǎn)錄組研究

22、帶來嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。Mortazavi等研究員結(jié)合川umina測(cè)序平臺(tái)，對(duì)成年小鼠的腦、肺、骨骼肌組織RNA進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序及分析，獲得1.4億數(shù)據(jù)，約90%的位置與已知外顯子相匹配，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)了未見報(bào)道的序列信息。約300辦新鑒定的3'UTR可能在microRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平調(diào)控中起重要作用；約3000個(gè)新鑒定的5外顯子，提示有新的啟動(dòng)子序列被利用。尤其在RNA剪接方面，該研究利用高通量測(cè)序獲得的海量數(shù)據(jù)，對(duì)比到約2X105種可能剪接方式的數(shù)據(jù)庫，鑒定出1.45105種不同的剪接方式，其中可變剪接占主導(dǎo)，3500個(gè)基因擁有至少一種內(nèi)部剪接方式。該研究成果表明：高通量測(cè)序技

23、術(shù)不僅能夠檢測(cè)到低豐度轉(zhuǎn)錄本，而且可以發(fā)現(xiàn)未知轉(zhuǎn)錄本，精確識(shí)別可變剪接位點(diǎn)，提供全面的轉(zhuǎn)錄組信息，這些均是芯片雜交技術(shù)或SAGE文庫測(cè)序技術(shù)無法比擬的，是目前深入研究轉(zhuǎn)錄組復(fù)雜性的有力工具。5.2、 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用在癌變和其他復(fù)雜疾病發(fā)生和發(fā)展過程中，細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)模式會(huì)發(fā)生顯著改變。如果您是臨床醫(yī)生或者從事相關(guān)研究的科學(xué)家，希望快速全面掌握您感興趣的癌癥或者其他疾病發(fā)生中基因表達(dá)模式的改變，對(duì)該疾病的診斷和治療提供重要解決策略；那么，RNA-seq可以通過對(duì)照正常樣本和疾病樣本中表達(dá)模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析快速為您提供正確答案。在細(xì)菌和病毒侵染時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)模式

24、也會(huì)發(fā)生顯著變化。這些變化對(duì)機(jī)體的抗感染功能至關(guān)重要。如果您是從事相關(guān)研究的醫(yī)生或者科學(xué)家，希望快速全面掌握在某病毒或者細(xì)菌侵染過程中細(xì)胞基因表達(dá)模式的改變特征，為有效抵抗病原侵染提供重要解決策略；那么RNA-seq可以通過對(duì)照正常樣本和侵染樣本中表達(dá)模式發(fā)生顯著變化的基因，及其功能分析為您提供正確答案。5.2.1、 癌細(xì)胞和組織中的基因融合132009年美國密歇根大學(xué)醫(yī)學(xué)院的ChristopherA.Maher等研究者采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)癌細(xì)胞進(jìn)行測(cè)序分析，以期找到新的基因融合。該研究成功“重新發(fā)現(xiàn)”了慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞中BCR-ABL110的基因融合、前列腺癌細(xì)胞和前列腺癌組織中T

25、MPRSS2-ERG2基因融合。另外，研究者還驗(yàn)證了在癌細(xì)胞和腫瘤組織中導(dǎo)致嵌合轉(zhuǎn)錄的新的基因融合（SLC45A3-ELK4）。表征癌細(xì)胞中特定基因組失常在確定癌癥的治療目標(biāo)中有重要的作用，因此確定誘發(fā)癌癥的基因失常是癌癥研究的一個(gè)主要手段。由癌細(xì)胞中染色體重新排列而導(dǎo)致的基因融合被認(rèn)為是一些最普遍的“癌癥基因”產(chǎn)生的主要原因。由于它們?cè)谥掳┻^程中的誘發(fā)作用和精確地癌細(xì)胞局限性，融合基因可以描繪出理想的診斷標(biāo)記物和合理的治療目標(biāo)物。周期性基因融合，與血液惡性腫瘤、罕見骨腫瘤及軟組織腫瘤密切相關(guān)，并且最近還發(fā)現(xiàn)了其在一些常見的實(shí)體瘤中的作用，如：前列腺癌和肺癌。ChristopherA.Mahe

26、等人通過對(duì)不同細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及后續(xù)的qRT-PCRFISH、ArrayCGH或高密度SNPArray的驗(yàn)證，證實(shí)了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)τ跈z測(cè)基因融合是一個(gè)非常有效地工具。另外，在ChristopherA.Maher等人用IlluminaGenomeAnalyzer進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究中，為了消除假陽性數(shù)據(jù)，克服缺少長(zhǎng)讀子的深度及減少局部基因定位排列中的短讀子的難度，長(zhǎng)讀子和短讀子的序列數(shù)據(jù)被并入到一起進(jìn)行分析。結(jié)果證明，這種整體化的處理方法極有效地減少了假候選基因并大大增加了試驗(yàn)可行的候選基因的比率。一個(gè)重要的局限性則是，當(dāng)鄰側(cè)的兩個(gè)基因只引起調(diào)控序列的融合而不是轉(zhuǎn)錄序列的時(shí)候，則不能使用轉(zhuǎn)錄組

27、測(cè)序這個(gè)方法。但無論如何，該研究建立了基于轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)新基因融合的可靠方法路線，為系統(tǒng)界定癌癥相關(guān)突變開辟了重要途徑。5.3、 轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在農(nóng)業(yè)中的應(yīng)用在植物的正常生長(zhǎng)，抗旱、抗逆、以及優(yōu)良品系培育等過程中細(xì)胞的基因表達(dá)模式會(huì)發(fā)生顯著變化。如果您是從事農(nóng)業(yè)研究的科學(xué)家或農(nóng)學(xué)家，RNA-seq可以通過對(duì)照正常樣本和您感興趣樣本中表達(dá)模式發(fā)生顯著差異的基因讓您快速全面掌握在您感興趣的植物性狀中起重要功能的基因，給力您育種或者相關(guān)農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究的進(jìn)程。5.3.1、 擬南芥可變剪接研究14SergeiA.Filichkin等研究者采用轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)擬南芥進(jìn)行可變剪接分析，發(fā)現(xiàn)42%以

28、上具有內(nèi)含子的基因具備可變剪接形式，這個(gè)數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于EST測(cè)序方法（20%-30%）?？勺兗艚愚D(zhuǎn)錄本多數(shù)具有提前終止密碼子（PTC+）,PTC+可作為無義介導(dǎo)的mRNA降解監(jiān)控機(jī)制（NMD）的靶標(biāo)，或通過調(diào)控非預(yù)期剪接和轉(zhuǎn)錄機(jī)制（RUST）來調(diào)控功能轉(zhuǎn)錄本水平。該研究還發(fā)現(xiàn)在不同環(huán)境因素脅迫下，PTC+及相關(guān)剪接變體的相對(duì)比率會(huì)隨之發(fā)生轉(zhuǎn)變。研究成果還提示，和動(dòng)物體內(nèi)類似，NMD和RUST同樣在植物體內(nèi)的基因表達(dá)中廣泛存在并扮演非常重要的角色。6、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)面臨的挑戰(zhàn)和展望前景隨著測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，我們能夠?qū)D(zhuǎn)錄組開展更為深入的測(cè)序工作，能夠發(fā)現(xiàn)更多、更可靠的轉(zhuǎn)錄子，目前的大規(guī)模并行測(cè)序

29、技術(shù)已經(jīng)徹底改變了我們對(duì)轉(zhuǎn)錄組的研究方法，測(cè)序結(jié)果的質(zhì)量也在不斷提高，得到的信息量也在爆炸式增長(zhǎng)。然而和其他所有新生技術(shù)一樣，RNA-Seq技術(shù)也面臨著一系列新問題：其一是龐大的數(shù)據(jù)量所帶來的信息學(xué)難題，比如如何最好地詮釋和比對(duì)鑒定多個(gè)類似的同源基因，如何確定最佳測(cè)序量，獲得高質(zhì)量的轉(zhuǎn)錄圖譜等15；其二是如何針對(duì)更復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄組來識(shí)別和追蹤所有基因中罕見RNA亞型的表達(dá)變化。有可能提前實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)的將是使用配對(duì)末端測(cè)序和單分子測(cè)序等更新的測(cè)序技術(shù)，以及使用更長(zhǎng)的讀段來增加測(cè)序深度和覆蓋度16 ；其三，目前的高通量測(cè)序技術(shù)大都需要較多的樣品起始量，這使得來源極為有限的生物樣品分析受到限制，因此如何

30、對(duì)單細(xì)胞或少量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一個(gè)亟待解決的問題。最近這方面的研究也取得了一定進(jìn)展，如Tang等17建立了一種mRNA-Seq方案，它以PCR為基礎(chǔ)擴(kuò)增單個(gè)細(xì)胞的mRNA轉(zhuǎn)錄組，成功分析了取自小鼠四細(xì)胞胚胎時(shí)期的單個(gè)卵裂球的轉(zhuǎn)錄組。然而該方法只能捕捉帶有poly（A）尾巴的mRNA,也不能檢測(cè)絕大多數(shù)較長(zhǎng)的mRNA（大于3kb）的5'末端,同時(shí)也不能保留原轉(zhuǎn)錄子的方向信息。除此之外還有一些新的針對(duì)低數(shù)量細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究的技術(shù)正在不斷被開發(fā)18。最后，標(biāo)準(zhǔn)的RNA-Seq技術(shù)不能提供序列轉(zhuǎn)錄的方向信息，而這對(duì)于轉(zhuǎn)錄組注釋尤為重要，采用single-strandsequencing1

31、9和strandspecificsequencing0技術(shù)能很好的解決這一問題,或?qū)⒊蔀镽NA-Seq技術(shù)發(fā)展的一個(gè)重要方向。雖然RNA-Seq技術(shù)還面臨著種種困難，但作為一個(gè)剛剛起步的新技術(shù)RNA-Seq已經(jīng)顯示出其他轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)無可比擬的優(yōu)勢(shì)：既能提供單堿基分辨率的轉(zhuǎn)錄組注釋又能提供全基因組范圍的“數(shù)字化的基因表達(dá)譜，而且其成本通常比芯片和大規(guī)模的SangerEST測(cè)序要低,有人甚至提出了RNA-Seq最終取代基因芯片的猜測(cè)。然而就目前來看，作為兩個(gè)高通量的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究技術(shù)，在應(yīng)用的某些方面既存在重疊和競(jìng)爭(zhēng)也存在優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，一種技術(shù)能彌補(bǔ)另一種技術(shù)遺漏的部分,通常對(duì)一個(gè)生物學(xué)問題的回答需要不

32、同實(shí)驗(yàn)技術(shù)的協(xié)同配合，例如序列捕獲（SequenceCaptur破術(shù)就是結(jié)合了芯片和深度測(cè)序，利用芯片探針捕獲待測(cè)片段，再用深度測(cè)序技術(shù)分析核酸序列。但基因芯片的缺點(diǎn)，就在于它是一個(gè)“封閉系統(tǒng)”，它只能檢測(cè)人們已知序列的特征(或有限的變異)；而RNA-Seq的強(qiáng)項(xiàng)，就在于它是一個(gè)開放系統(tǒng)”，它的發(fā)現(xiàn)能力和尋找新的信息的能力從本質(zhì)上高于芯片技術(shù)，相信隨著相關(guān)學(xué)科的進(jìn)一步發(fā)展和測(cè)序成本的進(jìn)一步降低，RNA-Seq必將在轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域占主導(dǎo)地位。參考文獻(xiàn)：1 LockhartDJ,WinzelerEA.Genomics,geneexpressionandDNAarrays.Nature,2000,

33、405(6788):827636.2 CostaV,AngeliniC,DeFeisI,CiccodicolaA.UncoveringthecomplexityoftranscriptomeswithRNA-Seq.JBiomedBiotechnol,2010,2010:853916.3 WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomics.NatRevGenet2009,10(1):5763.4許波，張偉強(qiáng)，馮曉曦，等.轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在玉米中的應(yīng)用研究進(jìn)展J.玉米科學(xué),2014,22(1):6772,78.5

34、MaherCA,Kumar-sinhaC,CaoXH,etal.TrancriptomeSequencingtodetectgenefusionsincancer.Nature,2009,458(7234):97一101.6周曉光，任魯風(fēng),李運(yùn)濤，等.下一代測(cè)序技術(shù)：技術(shù)回顧與展望J.中國科學(xué)生命科學(xué),2010,40(1);23-377 .ZhouXG,RenLF,LiYT,etal.Thenext-generationsequencingtechnology:atechnologyreviewandfutureperspectiveJ.ScientiaSinicaVitae,2010,40(

35、1):23-37.8 SchusterSC.Next-generationsequencingtransformstoday'sbiologyJ.Nature,2008,200(8):16-18.9 WangZ,GersteinM,SnyderM.RNA-Seq:arevolutionarytoolfortranscriptomicsJ.NatureReviewsGenetics,2009,10(1):57-63.10楊曉玲，施蘇華，唐恬.新一代測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用前景J.生物技術(shù)通報(bào)，2010(10):76-81.11張春蘭，秦孜娟,王桂芝，等.轉(zhuǎn)錄組與RNASeq技術(shù).生物孩術(shù)通報(bào)，2012年第12期,12祁云霞，劉永斌，榮威恒.轉(zhuǎn)錄組研究新技術(shù)：RNAseq及其應(yīng)用.遺傳,2011,33(11):1191一1202.13 AliMottazav