NSFN生物學(xué)性能的試驗(yàn)研究

1、三維多孔絲素蛋白/納米羥基磷灰石支架生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究趙勇1曾泉2陳靜1陳治清1趙勇1四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔材料學(xué)研究室四川省成都市人民南路三段十七號(hào)610041E-mail:zhaodt66Tel:86HAOYongDepartmentofDentalMaterial,WestChinaCollegeofStomatology,SichuanUniversity,Chengdu610041曾泉2四JI大學(xué)納米生物醫(yī)學(xué)技術(shù)與膜生物學(xué)研究所四JI省成都市高新區(qū)高朋大道科院四路一號(hào)E-mail:zengquan13ZENGQuan陳靜1四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔

2、修復(fù)學(xué)研究室四川省成都市人民南路三段十七號(hào)610041E-mail：chenjingcdTel:86HENJingDepartmentofDentalProsthetics,WestChinaCollegeofStomatology,SichuanUniversity,Chengdu610041陳治清1四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院口腔材料學(xué)研究室四川省成都市人民南路三段十七號(hào)610041Email：zqingcTel:86HENZhiqingDepartmentofDentalMaterial,WestChinaCollegeofStomat

3、ology,SichuanUniversity,Chengdu610041基金項(xiàng)目：國家863課題（編號(hào):2002AA326080）作者簡介：趙勇（1966.4）,男，四川人，博士，口腔主治醫(yī)師。研究方向?yàn)榭谇环N植修復(fù)及相關(guān)生物材料。通訊作者：陳治清，教授，四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院，成都市人民南路三段十四號(hào)，610041,Tel:86mail:zqingc非編織絲素蛋白/納米羥基磷灰石支架生物學(xué)性能的實(shí)驗(yàn)研究摘要目的構(gòu)建三維多孔絲素蛋白/納米羥基磷灰石復(fù)合支架，用于骨組織工程。方法綜合運(yùn)用絲素蛋白纖維網(wǎng)的非編織制作方法和仿生礦化法，構(gòu)建三維多孔絲素蛋白/納米羥基磷灰石

4、復(fù)合支架。通過體外蛋白酶降解和成骨細(xì)胞培養(yǎng)，考察其生物學(xué)性能。結(jié)果蛋白酶對(duì)絲素蛋白降解的作用大小依次為，蛋白酶K>胰蛋白酶a-糜蛋白酶>I型膠原酶。所構(gòu)建的支架顯示出良好的生物相容性并能促進(jìn)成骨細(xì)胞生長和分化。結(jié)論三維多孔絲素蛋白/納米羥基磷灰石支架可望成為新型有機(jī)/無機(jī)復(fù)合生物材料，為組織工程支架的設(shè)計(jì)提供了新的思路。關(guān)鍵詞絲素蛋白仿生礦化細(xì)胞培養(yǎng)骨組織工程支架InVitroStudyonBiologicalCharacteristicsof3DNon-wovenSilkFibroinNet/Nano-hydroxapatiteScaffoldAbstractObjective:

5、Toevaluatethebiologicalcharacteristicsofthe3Dnon-wovensilkfibroinnet/nano-HAP(NSFN/nHAP)scaffoldsusedinbonetissueengineering.Methods:Invitroexperimentswerecarriedouttoinvestigatetheenzymaticdegradationofthescaffold.OsteoblastcultivationwastestedbySEM,MTTandALPtoevaluatethebiologicalreactionofthescaf

6、fold.Results:Silkfibroinisbiodegradable.Enzymaticdegradationoffibroinindicatedthattheextentofweightlossdependedonthetypeofenzyme,theenzyme-to-substrateratio,andthetreatmenttime.Amongtheenzymes,proteaseKwasthemostaggressiveandfollowedbytrypsin,o-chymotrypsinandcollagenaseI.TheproteaseKsolutionwiththe

7、concentrationof0.3mg/mlalmostcausedacompleteweightlosswithin20daysofincubation.NSFN/nHAPshowedanexcellentcytocompatibilityforthegrowthofosteoblastsandhadthecapabilitiestoimprovetheviabilityofosteoblasts.Conclusion:PorousNSFN/nHAPscaffoldmaybeahopefulscaffoldusedinbonetissueengineering.KeywordsFibrio

8、nBiomineralizationCellcultivationDegradationBonetissueengineering蠶絲纖維所具有的獨(dú)特性能能夠滿足生物支架材料的多方面的要求：蠶絲具有較高的強(qiáng)度和柔性，對(duì)水和氧的通透性好，可以制成纖維、海綿或膜。這些特點(diǎn)使得蠶絲可望成為優(yōu)良的基質(zhì)材料應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)材料和方法1.1材料NSFN/nHAP支架（自備），蠶絲（雙宮絲，成都天友絲綢公司），纖維素半透膜（分子透過水平8000-15000道爾頓，德國），SD新生乳鼠，新生小牛血清等（四川大學(xué)華西口腔醫(yī)學(xué)院衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供）；F-12培養(yǎng)基（Gibco,NY,USA）;MTT（Amresc

9、o,USA）;PBS液；碳酸氫鈉；0.25%胰蛋白酶；I型膠原酶（Gibco,NY,USA）;蛋白酶K（ACT:39.5U/MG,AMRESCO）;華糜蛋白酶（效價(jià)400單位/mg,中國上?；瘜W(xué)試劑公司）；堿性磷酸酶試劑盒（南京建成生物。理想支架材料的篩選和應(yīng)用是骨組織工程研究的重要內(nèi)容。絲素蛋白在骨組織工程方面的應(yīng)用需要解決絲素蛋白支架的設(shè)計(jì)和生物學(xué)性能這兩個(gè)主要問題。本文通過體外降解和細(xì)胞培養(yǎng)等方法，對(duì)非編織絲素蛋白/納米羥基磷灰石支架（NSFN/nHAP）進(jìn)行生物學(xué)效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究。制品有限公司）。恒溫培養(yǎng)箱等細(xì)胞培養(yǎng)器具；高效分析儀（BioAssayReader,HTS7000Plus,

10、美國）；倒置相差顯微鏡（IX50/IX70,Olympus,日本）等。1.2方法1.2.1 絲素蛋白（SF）的體外蛋白酶降解實(shí)驗(yàn)采用失重法觀察不同的蛋白酶在體外對(duì)SF的降解作用。蠶絲經(jīng)脫膠、溶絲、透析等步驟制成厚約1mm的絲素蛋白膜，80°C，6h干燥，稱重待用。每種蛋白酶分別采用a、b兩種不同的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中蛋白酶K（PRO）的濃度為0.3mg/ml（a）、0.1mg/ml（b）,I型膠原酶（COL）、為糜蛋白酶（CHY）、胰蛋白酶（TRY）等均為1mg/ml（a）、0.5mg/ml（b）。將SF膜（每片約10mg）分別置于培養(yǎng)瓶中（n=5）;每個(gè)培養(yǎng)瓶中注入蛋白溶液2.5ml

11、。37°C恒溫水浴20天，不含蛋白酶的PBS作為對(duì)照。每天換液1次，分別在降解過程的1、5、10、15、20天棄浸泡液，蒸餾水漂洗SF膜，干燥稱重。各個(gè)時(shí)間點(diǎn)絲素蛋白重量減少的百分率按下列公式計(jì)算：失重率=（sf降解前重量SF降解后重量）/SF降解前重量X100%每組計(jì)算結(jié)果求均數(shù)得降解后的失重率2,3。1.2.2 NSFN/nHAP的制備蠶絲（雙宮絲，成都天友絲綢公司）經(jīng)脫膠處理，采用甲酸/氯化鈣表面溶解的方法制備非編織支架結(jié)構(gòu)4，然后交替礦化獲得NSFN/nHAP支架。實(shí)驗(yàn)所用NSFN/nHAP為5個(gè)礦化周期形成的復(fù)合支架5。支架經(jīng)充分漂洗后室溫干燥，修整成與24孔及12孔培養(yǎng)板

12、孔徑一致的圓片，環(huán)氧乙烷消毒，無菌PBS漂洗后，置入培養(yǎng)板中待用。1.2.3 體外細(xì)胞培養(yǎng)采用組織塊原代培養(yǎng)方法，分離培養(yǎng)成骨細(xì)胞。經(jīng)5次傳代，充分增殖后，用培養(yǎng)液稀釋配制成5X104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液。根據(jù)分組需要將細(xì)胞懸液加入到相應(yīng)的24孔板，每孔1ml。12孔板每孔接種2ml細(xì)胞懸液。分組方法：細(xì)胞與NSFN/nHAP支架共培養(yǎng)為實(shí)驗(yàn)組，細(xì)胞與NSFN共培養(yǎng)為陽性對(duì)照組，細(xì)胞在培養(yǎng)板中培養(yǎng)作為空白對(duì)照組，每組28個(gè)樣本1.2.4 體外細(xì)胞培養(yǎng)的檢測方法分別在培養(yǎng)的1、3、5、7天收集標(biāo)本，進(jìn)行MTT檢測。用SPSS10.0軟件進(jìn)行組間兩兩比較和統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)方法為LSD,t檢驗(yàn)。共培養(yǎng)的

13、第3天和第7天進(jìn)行SEM觀測。樣本處理方法：棄培養(yǎng)液，用2.5%的戊二醛固定4h,酒精梯度脫水，醋酸異戊脂浸泡過夜，臨界點(diǎn)干燥后，噴金待檢。共培養(yǎng)的第3天和第7天，收集12孔板中NSFN/HA支架材料上培養(yǎng)的成骨細(xì)胞，進(jìn)行堿性磷酸酶（ALP）活性檢測。2結(jié)果2.1SF體外蛋白酶降解SF的酶水解呈現(xiàn)以下特點(diǎn)：1）SF的降解與蛋白酶種類有關(guān)。2）SF的降解與蛋白酶的濃度、酶解時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。3）蛋白酶K對(duì)絲素蛋白水解作用最為強(qiáng)烈。當(dāng)?shù)鞍酌窴為其它蛋白酶濃度的1/10（即0.1mg/ml）時(shí)，對(duì)SF降解的效果分別是I型膠原酶的3.6倍、是a-糜蛋白酶的1.6倍、比胰蛋白酶對(duì)SF的降解率高出6%。蛋

14、白酶對(duì)SF降解的作用大小依次為，蛋白酶K胰蛋白酶a-糜蛋白酶I型膠原酶（圖1）。務(wù)X蜜二洸i挈010152D降辭時(shí)阿DegrsclBtianTime(d啟-O-PBSCOL-fl，,CCL+-VPRO-ab-th-PRO-bnTRY-a一TRY/-fr-CHY-s圖1:絲素蛋白體外蛋白水解的在不同時(shí)間段的失重率Fig.1:Weightlossofsilkfibroinafterenzymaticdegradationindifferentperiod.2.2成骨細(xì)胞與兩種支架共培養(yǎng)形貌特征培養(yǎng)3天時(shí)，兩種支架上的細(xì)胞數(shù)目較少。SEM可見細(xì)胞順著絲纖維所構(gòu)成的三維孔隙邊緣攀附、包裹于支架上，并爬

15、行進(jìn)入孔隙的內(nèi)部。此時(shí)三維NSFN/nHAP纖維骨架清晰可見。培養(yǎng)7天后，成骨細(xì)胞數(shù)量明顯增多。低倍鏡下，整個(gè)絲纖維骨架己經(jīng)被苔薛般密集排列的細(xì)胞纏繞。細(xì)胞增殖鋪展，似“疊瓦”狀排列并跨越多孔纖維支架的孔隙和間隔，覆蓋在支架表面。此時(shí)支架已隱藏于密集的細(xì)胞群落之中（圖2b）。高倍鏡下可見：成骨細(xì)胞緊密貼附于NSFN/nHAP支架的表面。細(xì)胞伸出許多偽足并分泌大量的細(xì)絲狀膠原（圖3）。圖2:NSFN/nHA豉架細(xì)胞接種前(a)和成骨細(xì)月共培養(yǎng)7天(b)的SEM物貌。(X300)Fig.2:SEMrevealsthestructureofNSFN/nHAPbeforecellcultivation

16、(a)andosteoblastcultivationfor7days.(300)x圖3:成骨細(xì)胞與NSFN/nHA哄培養(yǎng)7天后,SEM所見的細(xì)胞貼附狀態(tài)。(a：X1000,b:X5000)Fig.3: OsteoblastspreadingontheframeofNSFN/nHAPscaffoldafter7daysofco-cultivation.(SEM)2.3MTT檢測實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的成骨細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增殖。培養(yǎng)的第3天，NSFN組的細(xì)胞數(shù)量高于實(shí)驗(yàn)組及空白組（p<0.05）。培養(yǎng)第5天時(shí)，3組材料上的細(xì)胞增殖量均達(dá)到第1天的2倍左右，但各組細(xì)胞量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。1周后

17、，成骨細(xì)胞在NSFN和NSFN/nHAP支架材料上生長更為活躍，與空白組對(duì)照，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）。說明NSFN和NSFN/nHAP均具有促進(jìn)成骨細(xì)胞生長的性能（圖4）。圖4:成骨細(xì)胞在三種材料上不同培養(yǎng)時(shí)間段的MT他測結(jié)果Fig.4: MTTresultsofosteoblastco-cultivationinthreegroups（blankgroup,NSFNgroupandNSFN/nHAPgroup）atvariousperiods.2.4ALP檢測ALP檢測結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析方法同上。成骨細(xì)胞培養(yǎng)的第3天，空白對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞ALP活力沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p>0.0

18、5）。至細(xì)胞培養(yǎng)的第7天，實(shí)驗(yàn)組和陽性對(duì)照組的ALP值均比培養(yǎng)3天時(shí)增高3倍左右。NSFN/nHAP組ALP值的增高尤為突出。各組間均存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（p<0.05）o圖5:成骨細(xì)胞在三種不同材料上培養(yǎng)3天和7天的ALP活性Fig.5:ALPtestresultsofosteoblastinthreegroupsafter3and7daysofco-cultivation.3討論文獻(xiàn)證明：不同種類的蛋白酶對(duì)SF降解作用不盡相同，不同形貌的SF（如SF膜、SF海綿或NSFN）在同一種蛋白酶作用下，也有不同的降解效果，而體內(nèi)情況更為復(fù)雜。SF的降解實(shí)際上是多種酶、不同的理化環(huán)境等多種因素

19、協(xié)同作用的結(jié)果6。盡管如此，通過簡化實(shí)驗(yàn)方法，了解其基本的降解規(guī)律，有利于盡快優(yōu)化設(shè)計(jì)支架材料。關(guān)于SF的降解，除了本實(shí)驗(yàn)所用的蛋白酶外，激酶（actinasR、竣化酶（carboxylase）、蛋白酶E、蛋白酶XXI等都曾用于考察SF的降解。一般認(rèn)為，糜蛋白酶作用于絲素蛋白纖維的無定型結(jié)構(gòu)區(qū)域，并可提高絲素的結(jié)晶度，蛋白酶E也作用于絲素蛋白的無定型區(qū)。Minour在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，蛋白酶XIV,不但能夠溶解絲素蛋白，還能直接將絲素蛋白分解為多肽和氨基酸，15天內(nèi)，70%的絲素蛋白海綿即可被1.0U/ml的蛋白酶XIV降解3,6。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Minour和Arai的實(shí)驗(yàn)基本一致。UngeF在NSF

20、N上進(jìn)行為期7周的人體細(xì)胞培養(yǎng)。這些人體細(xì)胞包括：內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、角化細(xì)胞、骨肉瘤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)所有種類的細(xì)胞均可在絲素蛋白纖維網(wǎng)上粘附和鋪展。細(xì)胞分裂、增殖，鋪展于單個(gè)纖維的表面。大多數(shù)細(xì)胞在非編織的絲蛋白網(wǎng)上至少能夠生長7周。角化細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞在絲素蛋白纖維網(wǎng)上的生長尤其旺盛，預(yù)示SF可能用作生物材料重建骨組織和皮膚。其他研究也證實(shí)成纖維細(xì)胞在SF上附著狀態(tài)是理想的，SF有利于細(xì)胞的分化、生長和功能表達(dá)8,9。本實(shí)驗(yàn)中，成骨細(xì)胞數(shù)量在培養(yǎng)1周后明顯增加，分布更均勻。細(xì)胞首先沿著絲素蛋白纖維攀附生長，并能夠經(jīng)三維多孔的孔隙深入到支架材料的內(nèi)部。細(xì)胞在支架的表面

21、重疊，基質(zhì)堆積，開始跨越絲素蛋白纖維之間的孔隙間隔，并封閉載體表面的部分孔隙。盡管如此，由于本實(shí)驗(yàn)所用的NSFN三維多孔支架的孔隙度控制在78%,孔徑平均值約為177.9這種結(jié)構(gòu)尺度適宜成骨細(xì)胞的生長。至培養(yǎng)1周以后，成骨細(xì)胞雖生長旺盛，鋪展密集而重疊，但是支架表面仍然預(yù)留許多孔隙。這對(duì)于在繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞的過程中，保持支架材料的通透性，使支架內(nèi)部的細(xì)胞能夠充分獲得所需要的營養(yǎng)物質(zhì)，為保證細(xì)胞生長的正常代謝提供了良好的條件。這也是NSFN/nHAP支架材料的優(yōu)點(diǎn)所在。此外，骨細(xì)胞對(duì)新的生長環(huán)境非常敏感，支架材料表面的材料構(gòu)成成分、表面能、粗糙度、表面形貌等都可能影響接種骨細(xì)胞的骨形成的進(jìn)程。其中，

22、表面形貌和微觀結(jié)構(gòu)粗糙度是影響細(xì)胞粘附、生長和成骨的主要因素。NSFN/nHAP支架的表面是仿生礦化形成的納米級(jí)磷灰石晶體結(jié)構(gòu)10，納米材料比表面積大，有利于功能性蛋白的附著和細(xì)胞的粘附。這種微觀結(jié)構(gòu)實(shí)現(xiàn)了支架設(shè)計(jì)中所追求的多等級(jí)結(jié)構(gòu)(hierarchicalstructure),也為成骨細(xì)胞的生長提供了有利的環(huán)境。4結(jié)論SF的降解與蛋白酶種類有關(guān)。SF的降解與蛋白酶的濃度、酶解的時(shí)間呈正相關(guān)關(guān)系。仿生礦化的NSFN支架在體外細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，能促進(jìn)成骨細(xì)胞的生長和分化。本研究綜合運(yùn)用仿生礦化和非編織絲素蛋白纖維網(wǎng)的制作技術(shù)，成功合成了非編織的三維多孔絲素蛋白/羥基磷灰石復(fù)合支架材料。體外實(shí)驗(yàn)初步證

23、明，該支架材料具有良好的生物相容性，可生物降解，加工成型容易。該支架材料的優(yōu)化設(shè)計(jì)和性能仍待進(jìn)一步探討。參考文獻(xiàn)1 FiniM,MottaA,TorricelliP,etal.Thehealingofconfinedcriticalsizecancellousdefectsinthepresenceofsilkfibroinhydrogel.Biomaterials,2005,26:352735362 HoranRL,AntleK,ColletteAL,etal.Invitrodegradationofsilkfibroin.Biomaterials,2005,26:338533933 Ara

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