彈性纖維染色方法

1、改良Masson三色染色法在膠原纖維中的應(yīng)用中華首席醫(yī)學(xué)網(wǎng)    2006年05月24日 11:05:41 Wednesday   648作者：王玨, 朱禮國， 唐幕湘, 張健鄖陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報2006年2月25卷1期 實(shí)驗(yàn)技術(shù)   加入收藏夾      【關(guān)鍵詞】  膠原纖維    關(guān)鍵詞  改良；Masson三色染色法；膠原纖維     目前，Masson三色染色法仍是膠原纖維染色的主要

2、方法之一。它在臨床外檢和科研教學(xué)等方面有著重要的意義。在實(shí)際工作中，我們認(rèn)為傳統(tǒng)的Masson三色染色法1操作程序多，染色效果欠佳，且不太穩(wěn)定，對其做了改進(jìn)，現(xiàn)將做法介紹如下。1  方法1.1  染液的配制Harris蘇木素、1%鹽酸酒精、麗春紅酸性品紅、1%磷鉬酸、2%苯胺藍(lán).1.2  染色方法 石蠟切片34 m脫蠟至水,Harris蘇木素染3 min流水沖洗,1%的鹽酸酒精分化35 s流水沖洗,溫水返藍(lán)1 min流水沖洗, 麗春紅酸性品紅加溫染3 min，蒸餾水沖洗,1%磷鉬酸分化1 min，不洗，擦凈載玻片上的磷鉬酸殘液，2%苯胺藍(lán)復(fù)染1 min，

3、95%的酒精沖洗，95%酒精及無水酒精脫水，冷風(fēng)吹干，中性樹膠封片。2  結(jié)果膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維胞質(zhì)呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)褐色。3  討論通過長期實(shí)踐探索，我們摸索出一種程序更簡潔、組織著色效果更好，且性能穩(wěn)定的改良Masson三色染色法。其原理是利用蘇木素，酸性品紅和苯胺藍(lán)對結(jié)締組織和神經(jīng)嗜銀顆粒、膠原纖維等組織染色，使時間縮短，步驟簡便。改進(jìn)后的方法，將傳統(tǒng)的Masson三色染色法作了如下調(diào)整和改動：Bowin氏液由10%中性固定液2代替，省略了0.5%碘酒精作用10 min，5%硫代硫酸鈉作用5 min和1%冰醋酸處理1min及地衣紅染3060 min 等過程，然后將

4、原麗春紅酸性品紅，1%磷鉬酸，2%苯胺藍(lán)的染色時間分別由15 min，5 min,5 min,縮短為加熱3min,1 min,1 min.通過對以上各步的調(diào)整和改進(jìn)，使染色時間由原來的近3 h，縮短為30 min左右，且顏色對比度好，層次清楚，胞核胞漿著色均勻。值得注意的是：在經(jīng)過1%磷鉬酸分化后的幾步禁止用水沖洗，直接用95%酒精洗，然后脫水，透明封片，這樣可防止切片脫色，染出的組織切片效果更好。    參  考  文  獻(xiàn)1     凌啟波.實(shí)用病理特殊染色和組織化學(xué)M.廣東高等教育出版社.

5、1989,7.     2     龔志錦,詹洲.病理組織制片和染色技術(shù)M.上海:上海科學(xué)技術(shù)出版,1994,10.（鄖陽醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)室;鄖陽醫(yī)學(xué)院附屬太和醫(yī)院病理科,湖北 十堰  442000）網(wǎng)狀纖維網(wǎng)狀纖維是一種纖細(xì)的纖維。它沿著網(wǎng)狀細(xì)胞和突起分支，并互相交織成網(wǎng)，因而被稱為網(wǎng)狀纖維，又因這種纖維對銀的浸染著色特別顯著。故又稱為嗜銀纖維。它主要由III型膠原蛋白構(gòu)成，也具有642nm周期性橫紋1。它主要分布于骨髓、脾、淋巴結(jié)、肝和肺等臟器。癌組織中間未見有網(wǎng)狀纖維，但在其邊緣可見有大量的網(wǎng)狀纖維

6、，但在其邊緣可見有大量的網(wǎng)狀纖維圍繞，俗稱癌巢。一、網(wǎng)狀纖維的形成它的形成主要是在纖維母細(xì)胞的粗面內(nèi)漿網(wǎng)中，合成可溶性膠原。在醛糖、類脂的作用下，形成可溶性膠原，隨后它被分泌到細(xì)胞外，在基質(zhì)中（或在細(xì)胞的表面）通過原膠原蛋白分子間的交聯(lián)，聚合成為不溶性的膠原原纖維即網(wǎng)狀纖維。二、網(wǎng)狀纖維在組織化學(xué)上的反應(yīng)網(wǎng)狀纖維的主要成分是網(wǎng)硬蛋白，在組織化學(xué)上，網(wǎng)狀纖維和膠原纖維是容易區(qū)別的。網(wǎng)狀纖維是分支纖細(xì)的纖維。Van Gieson 氏染色不顯色或微紅色。PAS反應(yīng)呈現(xiàn)紅紫色，銀浸染為黑色。膠原纖維用Van Gieson氏染色為紅色，PAS反應(yīng)呈微粉紅色。銀浸染為黃*色或棕黃*色。三、網(wǎng)狀纖維的顯示1

7、染色染料技術(shù)：從網(wǎng)狀纖維的顯示，區(qū)別和效果等方面，這種技術(shù)被認(rèn)為是不可靠的，其原因是它只能跟膠原纖維區(qū)別開來。2金屬浸染技術(shù)：這種技術(shù)對于顯示網(wǎng)狀纖維被認(rèn)為是十分可靠和廣泛使用的方法，它不但能夠區(qū)別網(wǎng)狀纖維和膠原纖維，而且可顯示纖細(xì)的網(wǎng)狀纖維。嗜銀反應(yīng)（Argyrophil reaction）嗜銀細(xì)胞與親銀細(xì)胞所不同的是需要一種附加的還原劑來還原，它們比親銀細(xì)胞數(shù)量多。必須注意：親銀反應(yīng)中將找不到任何的嗜銀細(xì)胞。親銀反應(yīng)（Argentaffin reation）親銀細(xì)胞有能力，直接地，不靠外加試劑，將銀液中的銀還原為一種不溶性的黑色金屬銀沉淀的細(xì)胞稱為親銀細(xì)胞。（Cells that have

8、 the ability to directly reduce silver solution producing an insoluble black metallic silver precipitate are termed-angentaffin cells）。四、網(wǎng)狀纖維的顯示方法有Gomori's法、Godon and sweet's法、Wilder's法、Foot's法（一）Gomori's法1、試劑的配制：取10%硝酸銀3份，加入10%的氫氧化鉀1份，混合后產(chǎn)生大量的黑色沉淀物，倒去表面的液體，保留下沉淀物，加入10-20倍或更多的蒸餾水

9、進(jìn)行沖洗，連續(xù)沖洗3次。待沉淀物清晰則可。用濃氨水逐滴加到溶液中。使沉淀物逐步溶解。待見沉淀物剩少數(shù)幾顆時，再取10%的硝酸銀液加入數(shù)滴，至溶液再現(xiàn)渾濁為止。再用氨水將其溶解，然后稀釋10-15倍。即可使用。平時保存于4冰箱中。2、操作步驟：(1)、切片脫蠟至水，蒸餾水洗，(2)、用0.5%高錳酸鉀氧化5min，(3)、自來水洗，繼用蒸餾水洗，(4)、用2%草酸漂白切片2min，(5)、自來水洗，蒸餾水洗，(6)、2%硫酸鐵銨媒染5min，(7)、水洗，蒸餾水洗，(8)、滴入氨性銀溶液浸染3-5min，(9)、蒸餾水洗數(shù)次，(10)、10%甲醛液還原5-10min，(11)、水洗2min，(1

10、2)、用核固紅染色10-15min，(13)、水洗10min，各級酒精脫水，(14)、常規(guī)透明，中性樹膠封固。結(jié)果：網(wǎng)狀纖維黑色，核紅色，膠原纖維黃棕色。(二).Gordon 和sweets氏法試劑的配制：取10%硝酸銀水溶液5ml,逐滴加入濃氨水，至形成沉淀物，再逐滴加氨水，將初次形成的沉淀物溶解。注意氨水不能加入過多。取3%過氧化鈉5ml加入，即可能產(chǎn)生沉淀，再逐滴加入氨水至沉淀再度被溶解。加入數(shù)滴10%硝酸銀，加入蒸餾水制成50ml溶液，即可使用，貯藏于4冰箱中。1、切片脫蠟至水。2、1%高錳酸鉀氧化5分鐘。3、水洗。4、2%草酸漂白1-2分鐘。5、水洗。6、2%硫酸鐵銨媒染切片10分鐘

11、。7、蒸餾水洗。8、氨銀溶液浸染2分鐘。9、蒸餾水沖洗數(shù)次。10、10%福爾馬林還原2分鐘。11、自來水洗。12、5%偏重亞硫酸鈉處理3分鐘。13、自來水洗。14、0.2%氯化金調(diào)色3分鐘。15、自來水洗。16、如果有要求，可做對比染色，如用核固紅染核。17、脫水，透明，封固。結(jié)果：網(wǎng)狀纖維顯示黑色，如有對比染色，細(xì)胞核顯示紅色，膠原纖維不著色。(三)Wilder氏法。1、切片脫蠟至水。2、1%高錳酸鉀氧化5分鐘。3、流水洗。4、2%草酸處理1-2分鐘。5、流水洗。6、1%硝酸鈾10秒鐘。7、蒸餾水洗。8、氨銀溶液浸染1分鐘。9、95%酒精速洗。10、于顯影液內(nèi)顯色1分鐘。11、蒸餾水洗。12

12、、0.2%氯化金調(diào)色1分鐘。13、蒸餾水洗。14、5%亞硫酸鈉處理1-2分鐘。15、水洗。16、如有需要，可作對比染色。17、常規(guī)脫水，透明，封固。結(jié)果：網(wǎng)狀纖維：黑色，其余著對比染色，膠原纖維不著色。(四).Foot氏法1、切片脫蠟至水。2、1%高錳酸鉀氧化5分鐘。3、自來水洗。4、2%草酸處理1-2分鐘。5、自來水洗，蒸餾水洗。6、于碳酸氨銀液中，在56烤箱內(nèi)浸染40-60分鐘。至切片呈黃棕色。7、速洗蒸餾水。8、20%福爾馬林還原5分鐘。9、水洗。10、0.2%氯化金水溶液調(diào)色1-2分鐘。11自來水洗。12、5%硫酸鈉固定切片1-2分鐘。13、如果需要，可作對比染色。14、脫水，透明，封

13、固。結(jié)果：網(wǎng)狀纖維顯示黑色，其它著染對比染色，膠原纖維不著色。五、銀染注意事項(xiàng)：1、所使用的玻璃儀器，須用清潔液處理。2、配制氨銀溶液時，氨水加入的量不能過多或不足，過多感應(yīng)下降，會使液體過堿，滴染時，切片容易脫落，過少則感應(yīng)上升，浸染效果不佳，不好掌握。3、配制氨銀液時，有可能用玻璃蒸餾水。4、使用的化學(xué)試劑應(yīng)盡量用分析純以上。5、切片氧化漂白應(yīng)徹底，不能使殘存的福爾馬林留于片上，否則將導(dǎo)致過早還原而使浸染不均勻。6、如果有某種原因而導(dǎo)致切片脫落時，應(yīng)使用涂膠的載片，以增加附貼性，7、如有可能，氨銀溶液以新配為佳，但也可保存于4冰箱中達(dá)一個月左右，這種液體易揮發(fā)，用后即須蓋緊，當(dāng)沉淀物出現(xiàn)時

14、，該溶液應(yīng)拋棄，8、20%福爾馬林還原5分鐘。9、應(yīng)秀氯化金調(diào)色時，可將膠原纖維著染的黃棕色去除掉。10、上述四種方法，根據(jù)各單位個人的需要或愛好選擇，沒有什么區(qū)別。六、臨床應(yīng)用1、可用于區(qū)別癌和肉瘤的診斷，例如：網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤和轉(zhuǎn)移于淋巴結(jié)內(nèi)的未分化癌，這兩者在HE的染色切片都較難區(qū)別，前者可產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維，后者不產(chǎn)生網(wǎng)狀纖維。鼻咽部活柱，應(yīng)將網(wǎng)染作為常規(guī)，給予使用，可增加診斷的準(zhǔn)確性。2、可用于區(qū)別血管內(nèi)皮瘤（肉瘤）和血管外皮瘤（肉瘤），它的瘤細(xì)胞在網(wǎng)狀纖維膜內(nèi)，而血管外皮瘤則在網(wǎng)狀纖維膜外，血管內(nèi)皮肉瘤的瘤細(xì)胞呈泡巢狀，周圍多被網(wǎng)狀纖維包繞；而血管外皮肉瘤的瘤細(xì)胞可見較多的網(wǎng)狀纖維。3、可用

15、于神經(jīng)系統(tǒng)方面腫瘤的區(qū)別，如：交感神經(jīng)母細(xì)胞，腦的髓母細(xì)胞瘤，這些腫瘤的形態(tài)有時象肉瘤，但銀染時，神經(jīng)系統(tǒng)的網(wǎng)染為陰性，不過腦的原發(fā)性肉瘤有較多的網(wǎng)狀纖維。4、可用于觀察癌組織的發(fā)生發(fā)展過程。如：原位癌，可見有完整的基底膜，而浸潤性癌則可見到被破壞的基底膜。5、可用于區(qū)別淋巴系統(tǒng)方面的腫瘤，如：淋巴肉瘤和網(wǎng)織細(xì)胞肉瘤，前者瘤細(xì)胞間的網(wǎng)狀纖維比正常稍減少，后者則比正常時增多。6、可用于急性骨髓纖維化的鑒別診斷，該病的網(wǎng)狀纖維增多，纖維可以是致密和融合性的。膠原纖維染色通常呈陰性，盡管偶爾有的病例可能顯示膠原纖維化。彈性纖維彈性纖維主要由彈性蛋白（一種黃*色硬蛋白，它是黃*色彈性纖維組織的主要成分

16、，干燥時易脆，而濕潤時呈彎曲并富彈性）構(gòu)成。它廣泛分布于全身的各個部位，尤以循環(huán)系統(tǒng)，呼吸系統(tǒng)和皮膚系統(tǒng)為甚。新鮮時它呈黃*色，固又稱為黃*色纖維。彈性纖維較細(xì)，直徑0.2-1.0um，有分支，不成束。但可交織成網(wǎng)。它富有彈性，容易拉長，但不能拉到超過它的極限，外力除去后又恢復(fù)原狀。彈性纖維與膠原纖維交織在一起，在HE染色的標(biāo)本上，含量少時不易與膠原纖維區(qū)別，含量多時呈折光性強(qiáng)的淡粉紅色。由彈性蛋白構(gòu)成彈性纖維的鞘，并非完全的密封，在其周圍有許多微細(xì)孔，這些微細(xì)孔可作為營養(yǎng)物及排除廢物的場所。彈性纖維主要來源于帶有平滑肌特征的間胚葉細(xì)胞，少量可由脈管的內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，先形成前彈性蛋白（pro-e

17、lastin），這時在電鏡下可見到直徑為200nm的電子密度微纖維，在成熟的彈性纖維蛋白，電密度減少或喪失，較為均勻一致。彈性纖維與膠原纖維，網(wǎng)狀纖維不同，它極難容于有機(jī)或無機(jī)的溶液里。一、彈性纖維的變形和病理變化隨著年齡的增長，特別是到了老年的時候，彈性纖維可發(fā)生生理性的變化，這時可觀察到彈性纖維的縱行分裂，斷成碎片，最后成為顆粒，這些變化同時也伴有化學(xué)變化，氨基酸和鈣的含量有所增加，這些變化在皮膚是最明顯的。當(dāng)有病變的時候，我們便可在切片觀察到有的彈性纖維增生，有的被破壞，斷裂、崩解，失去彈性。如主動脈瘤，就可見到瘤壁上的彈性纖維已經(jīng)失去了彈性。這是由于主動脈壁的彈性纖維受到內(nèi)壓的不斷沖擊

18、，彈性纖維過度牽拉，超過它的極期，再也恢復(fù)不了原狀，因此在切片標(biāo)本上（特殊染色）只能見到其痕跡或反應(yīng)物。二、彈性纖維的染色方法(一).Weigert氏雷鎖辛品紅法（1898）（Weigerts resorcin-fuchsin method）試劑的配制： Wergert氏雷鎖辛品紅液： 堿性品紅 2g 雷鎖辛 4g 蒸餾水 200ml 30%三氯化鐵 25ml取500ml的燒瓶加入蒸餾水和雷鎖辛，用玻棒攪拌均勻，加熱直至沸騰，持續(xù)1-2min，再加入30%的三氯化鐵水溶液繼續(xù)攪拌直至煮沸2-3min后，此時溶液的顏色變?yōu)樽狭_藍(lán)色，冷卻后過濾。倒

19、去濾液，將濾紙和沉淀物一起放入烤箱中一起烤干。取200ml95%酒精，將濾紙與沉淀物一起放入加熱溶解，除去濾紙，冷卻后過濾，用95%酒精湊足200ml，再加入4mlHCL。即可使用，保存于4冰箱，可長期使用。操作方法：1、切片脫蠟至水，2、0.5%高錳酸鉀水溶液氧化5min，3、水洗，4、2%草酸漂白1-2min，5、水洗，6、入95%酒精，7、入Weigert氏雷鎖辛液，室溫染1-2h，8、95%酒精分化至背景清晰為止，9、Van Giesson氏液或核固紅作對比染色，10、脫水透明，封固。結(jié)果：彈性纖維：深藍(lán)或深黑色，其余成分視用何種對比染色而定。特點(diǎn)：1、可將微細(xì)彈性纖維顯示出來。2、方

20、法可靠，顏色鮮紅色，切片可保存。3、配制好的染液可使用較長時間。注意事項(xiàng)：1 1908年Hart應(yīng)用該法，將1%HCl酒精稀釋了Weigert氏原液。即原液5-20ml。酸酒精30-40ml。結(jié)果彈性纖維顯示藍(lán)色黑色。2、1929年French改良了這種方法，用Weigert氏原液中的2g品紅，改為1g結(jié)晶紫。結(jié)果彈性纖維顯示深藍(lán)綠色。3、1929年Sheridan改良了該法，Weigert氏原液中的2g品紅改用為2g結(jié)晶紫。結(jié)果彈性纖維顯示為綠色。4、在溶化沉淀物時，應(yīng)隔水溶化，不要直接于明火上加熱熔解。5、配制后的染液用小磨口瓶裝，以防溶液揮發(fā)，影響染色效果。6、該溶液雖可保存較長時間，但

21、仍以新鮮配制為好。7、切片在透明時，有人提出切片不要經(jīng)過苯酚二甲苯。其原因之一是對已染色的切片有影響。(二)Gomori's醛品紅法（1950）（Gomroris aldehyde-fuchsin method）試劑的配制：堿性品紅 1g70%酒精 98ml三聚乙醛 1ml濃鹽酸 1ml將品紅溶于酒精里，再加入HCl和三聚乙醛，混合后于室溫放置2-3天后即可成熟，保存于4冰箱內(nèi)，使用期1-2個月。操作方法：1、切片脫蠟至水，2、0.5%高錳酸鉀水溶液氧化5min，3、水洗，4、2%草酸漂白1-2min，5、水洗，6、入70%酒精稍浸泡1min，7、入染液中浸染10-15min，8、70

22、%酒精分化，至無余色脫下為止，9、0.5%橙黃G做對比染色，20-30s，10、脫水，透明，封固。結(jié)果：彈性纖維深藍(lán)色，背景不同程度的黃*色。特點(diǎn)：1、可把較細(xì)的彈性纖維給予顯示出來。2、它不但染彈性纖維，也可染胰腺的B細(xì)胞，肥大細(xì)胞，神經(jīng)細(xì)胞的尼氏小體，表面肝炎抗原（HBsAg）粘蛋白等。3、方法可靠安全，操作得當(dāng)，可獲滿意結(jié)果。4、顏色鮮艷，利于攝影。注意事項(xiàng)：1、醛品紅液在成熟之后方可使用，染色最佳時間一般在7-10天，2、分化時應(yīng)隨時觀察切片，防止褪色過度，可改用95%酒精為分化劑。(三).地衣紅技術(shù)（orcein techique）（Unna.1891）染液配制：地衣紅 1g70%酒

23、精 99ml濃HCL 1ml將地衣紅溶于酒精中，也可以用水浴鍋加熱以助其溶解，冷卻過濾后加入HCL于室溫放置1-2天。操作方法：1、切片脫蠟至70%酒精，2、入上述染液中浸染3h（室溫）或1-2h（37）3、70%酒精分化，4、脫水，透明，封固。結(jié)果：彈性纖維棕紅色或深棕色。(四).Verhoff氏酒精蘇木素技術(shù)（1908）（Verhoff's alcoholic hematoxylin ted）染液的配制：A.5%酒精蘇木素.B.10%三氯化鐵水溶液.C.lugol's碘.溶2g碘片于少數(shù)的蒸餾水中，再溶1g的碘化鉀，兩者總量為100ml。操作方法：1、切片脫蠟至水，2、用上述染液（A.2分，B.4分，C.4分）染色10-15min，3、水洗，2%的三氯化鐵分化至彈性纖維清晰為止，4、水洗，95%酒精除去沉淀于切片的碘，5、水洗，用Van Giesson或中性紅作對比染色，6