HPLC培訓(xùn)(峰與色譜條件)

1、HPLC高效液相高效液相色譜色譜 基本原理基本原理 加樣加樣 流動相流動相 流動相流動相 A C B B C A 固定相固定相 柱內(nèi)填料，柱內(nèi)填料，流動相流動相 洗脫劑。洗脫劑。 HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程?；静僮?1.打開泵電源，待自檢完成后打開“Purge”閥進(jìn)行排液以除去泵頭之前的氣泡，排氣完成后關(guān)閉“Purge”閥。按“Pump”鍵開啟泵，然后按“func”及數(shù)字鍵以0.2ml/min的速度慢慢將流速調(diào)1.0ml/min （其中測甘油果糖氯化鈉注射液時應(yīng)以0.1ml/min的速度慢慢將流速調(diào)0.5ml/m

2、in ）。 2.一般柱平衡時間為30min左右（測甘油果糖氯化鈉注射液時平衡時間會更長些），此時依次打開檢測器、工作站電源，打開計算機(jī)中工作站，待儀器自檢連接完成后查看基線，如基線平穩(wěn)即可進(jìn)樣采集數(shù)據(jù)。 3.檢測完成后，關(guān)閉計算機(jī)中工作站、檢測器、工作站電源，將泵的流速慢慢降至0.2ml/min，按“Pump”鍵關(guān)閉泵，將流動相換至10%甲醇水或乙腈水，再以1.0ml/min流速沖洗色譜柱30-60min。 4.最后將色譜柱充滿純甲醇保存。 5.手動進(jìn)樣器使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣閥，除去殘留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防止灰塵顆粒。流動相的配制流動相的配制 配制用水最好用蒸餾水（注射水）

3、配制用水最好用蒸餾水（注射水） 稱量、量取、調(diào)稱量、量取、調(diào)pH時盡可能精確時盡可能精確 流動相必須用流動相必須用0.45um濾膜過濾，注意區(qū)分有機(jī)膜、無機(jī)膜濾膜過濾，注意區(qū)分有機(jī)膜、無機(jī)膜 加入甲醇或乙腈后要混合充分加入甲醇或乙腈后要混合充分 流動相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣）流動相必須經(jīng)過脫氣（常用方法是超聲脫氣） 配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替配制所用的試劑盡可能用色譜純，如沒有色譜純可用分析純代替 流動相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動相禁止使用流動相應(yīng)現(xiàn)用現(xiàn)配制，染菌的流動相禁止使用 配制過程中應(yīng)注意自我保護(hù)配制過程中應(yīng)注意自我保護(hù)流動相使用前為什么要脫氣？

4、流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理流動相使用前必須進(jìn)行脫氣處理 ，以除去其中溶解的氣體（如，以除去其中溶解的氣體（如O2），以防止在洗脫過），以防止在洗脫過程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，程中當(dāng)流動相由色譜柱流至檢測器時，因壓力降低而產(chǎn)生氣泡。氣泡會增加基線的噪音，造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固造成靈敏度下降，甚至無法分析。溶解的氧氣還會導(dǎo)致樣品中某些組份被氧化，柱中固定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。定相發(fā)生降解而改變柱的分離性能。常用的脫氣方法比較：常用的脫氣方法比較： 氦氣脫氣法氦氣脫氣法加熱回流法：效果

5、較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。加熱回流法：效果較好，但操作復(fù)雜，且有毒性揮發(fā)污染。 抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。抽真空脫氣法：易抽走有機(jī)相。 超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。超聲脫氣法：流動相放在超聲波容器中用超聲波振蕩，超聲過程中觀察無氣泡生成即可。 在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效在線真空脫氣法：真空脫機(jī)利用膜滲透技術(shù)在線脫氣，無需額外操作，成本低，脫氣效果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。果明顯優(yōu)于以上幾種方法，并適用于多元溶劑體系。色譜柱的良好使用規(guī)范溶劑使用前必須過濾運(yùn)輸中變干了

6、的色譜柱要完全浸濕（預(yù)處理）如果樣品中含有無需考慮而保留強(qiáng)的組分時,必須進(jìn)行前處理清楚了解色譜柱填料適用的pH范圍(3-7)，溫度(1.2色譜柱故障診斷- 峰形問題可能的原因可能的原因1.小峰在大峰前流出2.柱床塌陷3.樣品溶劑不合適4.柱過濾片部分堵塞5.柱過載，偶爾發(fā)生NormalFronting伸舌峰（前延峰）伸舌峰（前延峰）對稱系數(shù)對稱系數(shù)0.9手動進(jìn)樣器的使用、維護(hù)手動進(jìn)樣器的使用、維護(hù)樣品溶液進(jìn)樣前必須用0.45um濾膜過濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損轉(zhuǎn)動切換時不能太慢，更不能停留在中間 位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增， 甚至超過泵的最大壓力避免使用針頭彎曲，毛刺，變鈍的進(jìn)樣針

7、 使用后，用適當(dāng)溶劑沖洗進(jìn)樣閥，除去殘 留的樣品，溶劑，緩沖鹽等，蓋好封蓋防 止灰塵顆粒 必要時更換轉(zhuǎn)子密封墊必要時更換轉(zhuǎn)子密封墊系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 1.色譜柱的理論板數(shù) * 2.分離度 * 3.重復(fù)性 4.拖尾因子色譜柱的理論塔板數(shù)（n）用于評價色譜柱的分離效能。n=16(tR/w)2 或n=5.54(tR/wh/2)2計算色譜柱的理論板數(shù)。保留時間tR峰寬w半高峰寬wh/2分離度（R）用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程序，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)。除另有規(guī)定外，待測組分與相鄰共存物之間的分離度應(yīng)大于1.5。計算公式 或重復(fù)性用于評價連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采

8、用外標(biāo)法時，通常取各品種項(xiàng)下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，其峰面積測量值的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD采用內(nèi)標(biāo)法時，其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于2.0%。拖尾因子（T）用于評價色譜柱的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項(xiàng)下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為 。 除另有規(guī)定外，峰高法定量時T應(yīng)在0.95 1.05之間。峰面積法測定時，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測量。系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)1.理論塔板數(shù) n2.分離度 （R 1.5）3.重復(fù)性 RSD=0.1%4.拖尾因子 T=1.04min012345678mAU 05010015

9、0200250300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000001.D) 7.548min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000002.D) 7.537min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000003.D) 7.531min012

10、345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000004.D) 7.490min012345678mAU 050100150200250300350 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2010-02-17 10-55-42SIG000006.D) 7.379替硝唑含量替硝唑含量理論塔板數(shù)=15487對稱因子=1.05min012345678mAU 050100150200250300 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品

11、替硝唑注射液1 2010-01-05 14-48-56SIG000002.D) 7.826含量測定-內(nèi)標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成規(guī)定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：校正因子（f）ASCS/ARCR 式中： AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；AR為對照品的峰面積或峰高；CS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度，CR為對照品的濃度。再取各品種項(xiàng)下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分（或其雜質(zhì)）和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：含量（ cX ） fA

12、xC/S /As 式中： AX為供試品（或其雜質(zhì)）峰面積或峰高；CX為供試品（或其雜質(zhì)）的濃度；A/S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高；C/S為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度；f為校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測量結(jié)果的影響。含量測定-外標(biāo)法按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密量取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測組分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：含量（CX）cR Ax /AR 式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)采用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。替硝唑有關(guān)物質(zhì)替硝唑有

13、關(guān)物質(zhì)其中雜質(zhì)與2-甲基-5硝基咪唑的分離度為1.69min02468101214mAU 05001000150020002500 VWD1 A, 波長=310 nm (D:質(zhì)檢-成品替硝唑注射液1 2009-10-06 14-53-17SIG000080.D) 5.008 5.303 7.510有關(guān)物質(zhì)1.加校正因子的主成分自身對照法加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項(xiàng)下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測組分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述內(nèi)標(biāo)法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各

14、品種項(xiàng)下，用于校正雜質(zhì)的實(shí)測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項(xiàng)下。測定雜質(zhì)含量時，按各品種項(xiàng)下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%25%或其峰面積能準(zhǔn)確積分通常含量低于0.5%的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10%；含量在0.5%2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5%；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2.0%。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜峰上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。2.不加校正因子的主成分自身對照法不加校正因子的主成分自身對照法測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照品溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照品溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則