熒光分光光度計(jì)

1、熒光分光光度計(jì)FluorescenceSpectrometer國(guó)別廠家：日本島津公司儀器型號(hào)：RF-5301PC根本原理：主要技術(shù)指標(biāo)：燈源：150WXe燈單色器：閃耀式全息光柵,F2.5刻線1300條/mm波長(zhǎng)范圍：220-900nm.波長(zhǎng)精度：土1.5nm,分辨率：1.0nm狹縫寬：1.5,3,5,10,15,20nm靈敏度：S/N比150以上帶寬5nm、水拉曼峰時(shí)測(cè)定方式：熒光光譜測(cè)定、定量測(cè)定、時(shí)間過(guò)程測(cè)定軟件功能：10通道顯示,數(shù)據(jù)RSC轉(zhuǎn)換,譜圖自動(dòng)找峰,不同譜圖加減乘除,譜圖倒數(shù)、導(dǎo)數(shù)、常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換等.主要功能：固體和液體的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和同步熒光光譜；熒光物質(zhì)的定量分析.使

2、用方法:1 .將熒光光度計(jì)的右側(cè)Xe燈開(kāi)關(guān)置于“ON的位置,再翻開(kāi)電源開(kāi)關(guān)和電腦電源.2 .雙擊電腦上的RF-5301PC圖標(biāo),靜等儀器自檢完成,出現(xiàn)喀嚓聲后,顯示RF-5301P窗口.3 .預(yù)熱：開(kāi)機(jī)預(yù)熱20分鐘后才能進(jìn)行測(cè)定工作.4 .新建文件夾：在Data文件夾里新建本次所做實(shí)驗(yàn)的子文件夾5 .啟動(dòng)RF-5301PC后在AcquireMode中選擇欲分析的工程.6 .設(shè)定參數(shù)：根據(jù)測(cè)量方式在Configure的Parameter里設(shè)定適宜的參數(shù).7 .置入樣品：將已經(jīng)裝入樣品的四面擦凈后的石英熒光比色皿放入樣品室內(nèi)試樣槽后,將蓋子蓋好.8 .掃描：參數(shù)設(shè)定完畢后,點(diǎn)擊窗口右下角的“Sta

3、rt圖標(biāo),開(kāi)始才3描,掃圖結(jié)束后輸入文件名將文件儲(chǔ)存.9 .保存：在“File中的“SaveChannel對(duì)曲線進(jìn)行保存.10 .轉(zhuǎn)換文件：在“File的“DataTranslation"里單擊要轉(zhuǎn)換的“ASCH格式或者“DIF格式.11 .關(guān)機(jī)：測(cè)試完畢后,關(guān)閉電腦.之后要先關(guān)閉氤燈Xe燈開(kāi)關(guān)置于“Off位置,散熱20分鐘后,再關(guān)閉電源開(kāi)關(guān).考前須知：1 .開(kāi)機(jī)時(shí),請(qǐng)保證先開(kāi)氤燈電源,再開(kāi)主機(jī)電源.每次開(kāi)機(jī)后請(qǐng)先確認(rèn)一下排熱風(fēng)扇工作正常,以保證儀器正常工作,發(fā)現(xiàn)風(fēng)扇有故障,應(yīng)停機(jī)檢查.2 .使用石英樣品池時(shí),應(yīng)手持其棱角處,不能接觸光面,用畢后,將其清洗干凈.3 .當(dāng)操作者錯(cuò)誤操作

4、或其它干擾引起微機(jī)錯(cuò)誤時(shí),可重新啟動(dòng)計(jì)算機(jī),但無(wú)須關(guān)斷氤燈電源.4 .光學(xué)器件和儀器運(yùn)行環(huán)境需保護(hù)清潔.切勿將比色皿放在儀器上.清潔儀器外表時(shí),請(qǐng)勿使用乙醇乙醍等有機(jī)溶劑,請(qǐng)勿在工彳中清潔,不使用時(shí)請(qǐng)加防塵罩.5 .為延長(zhǎng)氤燈的使用壽命,實(shí)驗(yàn)完畢后要先關(guān)閉Xe燈,不關(guān)電源主機(jī)電源光度計(jì)的右側(cè),等其散熱完畢后再關(guān)閉電源.工作原理熒光產(chǎn)生的原理熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見(jiàn)光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光.熒光產(chǎn)生的原理：化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量如光能、化學(xué)能等而進(jìn)入激發(fā)態(tài),當(dāng)其從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí),過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射即發(fā)光.熒光化合物的兩種特征光譜1 .熒光激發(fā)

5、光譜,就是通過(guò)測(cè)量熒光體的發(fā)光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜,它反映了不同波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率.2 .熒光發(fā)射光譜,如使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變,而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過(guò)發(fā)射單色器后照射于檢測(cè)器上,掃描發(fā)射單色器并檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度,然后通過(guò)記錄儀記錄熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線,所得到的譜圖稱(chēng)為熒光光譜.物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜,可以用作該物質(zhì)的定性分析.當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí),物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi),其發(fā)射光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正比關(guān)系,可以用作定量分析.熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高,濃度太大的溶液會(huì)有自熄滅作用,以

6、及由于在液面附近溶液會(huì)吸收激發(fā)光,使發(fā)射光強(qiáng)度下降,導(dǎo)致發(fā)射光強(qiáng)度與濃度不成正比,故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行.熒光發(fā)射的特點(diǎn)：可產(chǎn)生熒光的分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光；而一旦停止供能,發(fā)光熒光現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失.溶液熒光光譜通常具有的特征：1斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中,所觀察到的熒光的波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光的波長(zhǎng).2熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān).3熒光發(fā)射光譜的形成與吸收光譜的形狀有鏡像關(guān)系熒光的猝滅：熒光分子的輻射水平在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅,這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài),所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射.一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作

7、猝滅劑,以消除不需用的熒光.因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意預(yù)防光特別是紫外光的直接照射和與其他化合物的接觸.熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光,總或多或少地以其他形式釋放.熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率,與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比.熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)熒光強(qiáng)度/吸收光的光量子數(shù)激發(fā)光強(qiáng)度發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度,除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外,也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān).各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜熒光光譜,即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰.選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng),且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時(shí),得到的熒光強(qiáng)度也

8、最大.測(cè)量原理稀溶液IF=2.303FI0ecb,其中,I0為激發(fā)光強(qiáng)度；If為熒光強(qiáng)度；.f為熒光效率；b為液池厚度；e和C分別為發(fā)光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和摩爾濃度.技術(shù)指標(biāo)：波長(zhǎng)掃描范圍：220-900nm波長(zhǎng)精度：*5nm;狹縫范圍：0.15-20nm信噪比：S/N比150以上水拉曼峰測(cè)定,狹縫5nm最高掃描速度：5,500nm/min操作規(guī)程1 .開(kāi)機(jī)a.確認(rèn)所測(cè)試樣液體或固體,選擇相應(yīng)的附件.b.先開(kāi)啟儀器主機(jī)電源,預(yù)熱半小時(shí)后啟動(dòng)電腦程序RF-530XPC,儀器自檢通過(guò)后,即可正常使用.2 .測(cè)樣（1） spectrum模式a.在“AcquireMode中選擇"Spectr

9、um模式.對(duì)于做熒光光譜的樣品,"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下：“SpectrumType中選擇Emission;給定EX波長(zhǎng);給定EM的掃描范圍最大范圍220nm900nm;設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度,點(diǎn)擊“O觥成參數(shù)的設(shè)定.對(duì)于做激發(fā)光譜的樣品,"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下:“SpectrumType中選擇Excitation;給定EM波長(zhǎng);給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm900nm);設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度,點(diǎn)擊“OK完成參數(shù)的設(shè)定.b.在樣品池中放入待測(cè)的溶液,點(diǎn)擊“Start,'

10、;即可開(kāi)始掃描.c.掃描結(jié)束后,系統(tǒng)提示保存文件.可在"Presentation中選擇"Graf""Radar""BothAxesCtrl+R來(lái)調(diào)整顯示名果范圍；在"Manipulate中選擇"PeakPick來(lái)標(biāo)出峰位,最后在"Channel中進(jìn)行通道設(shè)定.d.述操作步驟對(duì)固體樣品同樣適用.(2) Quantitative模式a.在“AcquireMode中選擇"Quantitative模式.b."Configured"Parameters的參數(shù)設(shè)置如下：Method選擇&

11、quot;MultiPointWorkingCurve""OrderofCferVe"1s和"No"給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度,點(diǎn)擊“OK完成參數(shù)的設(shè)定.c.在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"AutoZero命令校零點(diǎn).d.點(diǎn)擊“Standard模式,制作工作曲線.e.將樣品池中的空白溶液換成一系列的濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量,執(zhí)行“Rea晞令,得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度,系統(tǒng)根據(jù)測(cè)量值自動(dòng)生成一條熒光強(qiáng)度-濃度曲線.f.在“Presentation中選擇"DisplayEquation,得到標(biāo)準(zhǔn)方程.將此工作曲線&q

12、uot;Save"為擴(kuò)展名為“.std的文件.g.工作曲線制備完畢,即可進(jìn)入未知樣的測(cè)量,選擇進(jìn)入“Unknown模式,將樣品池中的濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液換成待測(cè)樣品溶液,執(zhí)行"Read命令,即可得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度和相應(yīng)的濃度.將此"Save'為擴(kuò)展名為“.qnim文件.(3) TimeCourse模式a.在“AcquireMode中選擇"TimeCourse模式.b."Configured"Parameters的參數(shù)設(shè)置如下：給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度；設(shè)定反響時(shí)間；讀取速度；讀取點(diǎn)數(shù)；點(diǎn)擊“OK,完成參數(shù)的設(shè)定.c.在樣品池中

13、放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"AutoZero命令校零點(diǎn).d.將樣品池中的空白溶液換成待測(cè)溶液,點(diǎn)擊“Start,'即可開(kāi)始掃描.掃描結(jié)束后,即可得到熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的工作曲線.e.將此工作曲線“Save為擴(kuò)展名為“.TMC的文件.3.關(guān)機(jī)退出軟件后關(guān)畢主機(jī).考前須知a.請(qǐng)注意保護(hù)液體比色皿,特別是測(cè)試有機(jī)樣品的同學(xué)請(qǐng)?jiān)跍y(cè)量完畢后用有機(jī)溶劑清洗,枯燥后再放入盒子中,否那么會(huì)造成比色皿外表嚴(yán)重污染,影響透光度.b.固體樣品池僅剩一個(gè),測(cè)試完畢請(qǐng)物歸原處.測(cè)試完畢請(qǐng)注意登記,關(guān)閉儀器.分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷無(wú)輻射躍遷一一去活化過(guò)程處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定,通過(guò)輻射或非輻射躍遷等

14、去活化過(guò)程返回至基態(tài).這些過(guò)程包括：1振動(dòng)弛豫在液相或壓力足夠高的氣相中,處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周?chē)姆肿?從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過(guò)程,稱(chēng)為振動(dòng)弛豫.2內(nèi)轉(zhuǎn)換對(duì)于具有相同多重度的分子,假設(shè)較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí),那么電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng)耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷,如S2-S1;T2-T1定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜.它們是熒光定性分析的根底.1激發(fā)光譜改變激發(fā)波長(zhǎng),測(cè)量在最強(qiáng)熒光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化,以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖可得到激發(fā)光譜.激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似,經(jīng)校正后二者完全相同！這是由于分子吸收光能的過(guò)程就