純化水微生物限度檢查法驗證方案和驗證報告.(DOC)

1、*有限公司驗證文件純化水微生物限度檢查法驗證方案題目：純化水微生物限度檢查法驗證方案編號：VDP-JY-010-01-1共頁第頁起草：審核：批準：日期：日期：日期：頒發(fā)部門：生效日期：分發(fā)部門：工程設備部、質(zhì)量部質(zhì)量部1純化水微生物限度檢查法驗證方案起草、審核、批準:起草人：審核人：批準人：起草日期：審核日期：批準日期：頒發(fā)部門：分發(fā)部門：質(zhì)量部質(zhì)量部驗證組織:驗證小組名稱:純化水微生物限度檢查法驗證方案驗證小組組長質(zhì)量部經(jīng)理負責組織、實施組員1QC主管負責驗證方案的起草負責檢測數(shù)據(jù)的復核負責出具檢驗報告2QA主管負責驗證方案的確認負責方法評價3微生物限度檢驗員負責測試操作和操作原始記錄1目錄

2、1. 驗證目的2. 驗證人員職責3. 參照標準4. 驗證項目內(nèi)容5. 評價合格標準6. 驗證試驗材料7. 驗證實施計劃8. 菌液制備9. 供試液制備10. 計數(shù)方法驗證11. 控制菌檢查方法驗證驗證結(jié)論和評價純化水微生物限度檢查法驗證方案1. 驗證目的:純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。確認該方法適合于純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定，控制菌的測定。2 驗證人員職責2.1驗證領導小組：2、1、1負責驗證方案及報告的批準2、1、2組織協(xié)調(diào)驗證工作2、1、3簽發(fā)驗證證書。2.2. 項目驗證小組長2.2.1. 負責驗證方案的起草2.2.2. 負責驗證的協(xié)調(diào)工作，以保證本驗證方案的順利實施。2.2

3、.3. 負責驗證報告的起草。2.2.4. 負責再驗證周期的確認。2. 3.質(zhì)量部2. 3.1.負責驗證方案審核2. 3.2.負責取樣及對樣品的檢驗2. 3.3.負責收集驗證記錄，并加以分析后，協(xié)助項目驗證小組長起草驗證報告。2. 3.4.負責驗證數(shù)據(jù)及結(jié)果的審核3. 參照標準：2010版中國藥典一部附錄XIII微生物限度檢查法。4. 驗證項目內(nèi)容：細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法的驗證，控制菌檢查方法驗證。5. 評價合格標準：試驗組的菌回收率和稀釋劑對照組的菌回收率均不得低于70%。6. 驗證試驗材料：6.1. 被驗證產(chǎn)品：品名 純化水 取樣點:(1) 4T/h純水系統(tǒng)二級反滲透裝置進純水箱口；(2

4、) 4T/h純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；(3) 4T/h純水系統(tǒng)三樓固體制劑純水箱總回水口4檢驗量5ml /次62儀器設備：621. YX.400A電熱蒸汽壓力消毒器6.2.2 YS- 840凈化工作臺6.2.3. 101型電熱干燥箱6.2.4. SPX-250B型生化培養(yǎng)箱6.2.5. PYX-DUS-X型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱6.2.6 303A-4型電熱培養(yǎng)箱6.2.7天平6.3. 稀釋劑：PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液；0.9%的無菌氯化鈉溶液6.4. 驗證用培養(yǎng)基名稱批號生產(chǎn)廠家營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基改良馬丁培養(yǎng)基改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基6.5.驗證用菌株:驗證

5、菌株代號（代數(shù)）來源培養(yǎng)基培養(yǎng)溫度培養(yǎng)時間（小時）大腸埃布困營養(yǎng)肉湯3035C金黃色葡萄球菌營養(yǎng)肉湯3035 r枯草芽抱桿菌營養(yǎng)肉湯3035 r白色念珠菌改良馬丁培養(yǎng)基2328 r黑曲霉菌改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基2328 r7、驗證設施計劃序號項目確認名稱實施負責人起始和完成日期1細困、霉困及酵母困計數(shù)方法驗證2驗證結(jié)果評定、驗證周期確認、驗 證報告和發(fā)放驗證證書&菌液制備8.1. 大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌菌懸液的制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1白金耳接種至10ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 C培養(yǎng)1824小時。 取經(jīng)3536C培養(yǎng)1824小時

6、的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽抱桿菌營養(yǎng) 肉湯新鮮培養(yǎng)物1ml加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-610-7約為 50100cfu/ ml的菌懸液備用。&2白色念珠菌、黑曲霉菌懸液的制備 取白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1白金耳接種至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，25E培養(yǎng) 2448小時。取培養(yǎng)物1ml，加入9%滅菌生理鹽水9ml，混勻，10倍稀釋至10-510-6細 菌數(shù)約50100cfu/ ml的菌懸液備用。 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25C培養(yǎng)57天至大量抱子產(chǎn)生。力卩0.9%無菌氯化鈉溶液10ml將抱子洗脫。然后吸出抱子懸液，加入蒙有

7、滅菌紗 布的無菌試管中。取此抱子懸液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，逐管10倍稀釋至510-約為50100cfu/ ml的菌懸液備用。9供試品制備 供試品名稱及取樣點： 純化水 取樣點（1） 4T/h純水系統(tǒng)二級反滲透 裝置進純水箱口 ；（2） 4T/h 純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；（3） 4T/h純水系統(tǒng)三 樓固體制劑純水箱總回水口。方法建立：2010版中國藥典規(guī)定純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。但沒 規(guī)定取樣量，由于所使用的濾膜孔徑不大于 0.45um，直徑為50mm,規(guī)定每片濾膜上的菌 落數(shù)應不超過100個。如果取樣量過大，樣品含菌量較多，就會造成細菌不宜分散，點

8、計困 難；如果取樣量過少，不能有效反映樣品染菌量。為此采用每張濾膜取樣品5ml。10. 計數(shù)方法驗證10.1試驗組 取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液 沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、 枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml ）各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于相應培養(yǎng)基上培養(yǎng)。10.2菌液組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽抱桿菌分別取1ml面液分別注入平皿中，并立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置3536C培養(yǎng)24小時；白色念珠菌、

9、黑曲霉分別取 1ml面液分別注入平皿中，并立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置 2425C培養(yǎng)48小時。菌落計數(shù)結(jié)果（2個平 皿計數(shù)取平均值）見下表菌落計數(shù)結(jié)果（cfu / ml）試驗次數(shù)10-5稀釋10-6稀釋10-7稀釋12122大腸埃布困金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉10.3供試品對照組 取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用0.9%無菌氯化鈉溶液 沖洗濾膜3次，每次100ml，平行兩張濾膜，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培 養(yǎng)基平板上培養(yǎng)。細菌、霉菌及酵母菌各制備2個平皿，測定供試品本底菌數(shù)。10.4.稀釋劑試驗組取0.9%無菌氯化鈉溶液300

10、ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃 希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml ）各1ml，平行兩張濾膜，過濾后， 取濾膜，將其菌面朝上貼于相應培養(yǎng)基上培養(yǎng)。10.5稀釋劑對照組 取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，平行兩 張濾膜，減壓抽干后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)，平行制備2個平皿，置適宜溫度培養(yǎng)4872h,觀察結(jié)果，測定菌數(shù)。10.6.結(jié)果見附表11、控制菌檢查方法驗證（常規(guī)法）11.1試驗組 取純化水5ml,以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用PH7.0氯化鈉-

11、蛋白胨緩 沖液，沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球 菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml ）各1ml， 平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，接入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，按相應控制菌檢查法進行檢查。試驗結(jié)果：上述試驗組檢出試驗菌，按此控制菌檢查法進行供試品的該控制菌檢查。 故可按常規(guī)法進行控制菌檢查。12驗證結(jié)論和評價根據(jù)驗證試驗結(jié)果，純化水微生物限度檢查按照2010版中國藥典二部附錄XIII微生 物限度檢查法檢驗，細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)可采用薄膜過濾法檢查。8附表2:獨立試驗二：各試驗組菌落計數(shù)（回收率 %取樣點

12、丄試驗時間年 月曰完成時間 年 月曰驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對 照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌回收率（%）稀釋劑對 照組菌回 收率（%）大腸埃希菌（培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（培 養(yǎng)48小時 計數(shù)）12平均值枯草芽抱 桿菌（培養(yǎng) 48小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌（培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（培 養(yǎng)72小時 計數(shù)）12平均值結(jié)論：本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%按標準規(guī)定，本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。復核人（簽名）： 試驗人（簽名）： 驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試

13、品對 照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌回收率（%）稀釋劑對 照組菌回 收率（%）大腸埃希菌（培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（培 養(yǎng)48小時 計數(shù)）12平均值枯草芽抱 桿菌（培養(yǎng) 48小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌（培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（培 養(yǎng)72小時 計數(shù)）12平均值結(jié)論：本次試驗各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%按標準規(guī)定，本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。復核人（簽名）： 試驗人（簽名）： 12驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對 照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù)（cf

14、u）試驗組菌回收率（%）稀釋劑對 照組菌回 收率（%）大腸埃希菌（培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄球菌（培 養(yǎng)48小時 計數(shù)）12平均值枯草芽抱 桿菌（培養(yǎng) 48小時計數(shù)）12平均值白色念珠菌（培養(yǎng)72小時計數(shù)）12平均值黑曲霉（培 養(yǎng)72小時 計數(shù)）12平均值結(jié)論：通過三次獨立試驗，證明所采用的供試液制備方法及薄膜過濾法適合于純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定。復核人（簽名）： 試驗人（簽名）： *有限公司驗證文件純化水微生物限度檢查法驗證報告題目：純化水微生物限度檢查法驗證報告編號：VDP-JY-010-01-2共頁第頁起草：審核：批準：日期：日期：日期：頒發(fā)部門：質(zhì)量部生效日期：分發(fā)

15、部門：151、驗證目的2、參照標準3、驗證項目內(nèi)容4、評價標準5、驗證實施時間6、驗證方法7、驗證結(jié)論和評價16、驗證目的根據(jù)中國藥典2010年版的要求，純化水微生物限度試驗采用薄膜過濾法檢查。為了確認該方法適合于本公司純化水細菌、霉菌及酵母菌數(shù)計數(shù)測定，控制菌的測定。特對此檢測方法進行驗證。二、參照標準中國藥典2010版二部附錄微生物限度檢查法。三、驗證項目內(nèi)容細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法驗證，控制菌的驗證。四、評價標準試驗組的菌回收率和稀釋劑對照組的菌回收率均不得低于70%五、驗證實施我們項目驗證小組從（微生物限度檢驗室完成驗證時間開始）開始，進行各種菌液、供 試液的制備，開始驗證工作。1、

16、菌液制備1.1大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌菌懸液的制備 取大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1白金耳接種至10ml 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35 C培養(yǎng)1824小時。 取經(jīng)3536C培養(yǎng)1824小時的大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、與枯草芽抱桿菌營養(yǎng) 肉湯新鮮培養(yǎng)物1ml加入到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，10倍稀釋至10-610-7約為 50100cfu/ ml的菌懸液備用。1.2白色念珠菌、黑曲霉菌懸液的制備 取白色念珠菌的新鮮斜面培養(yǎng)物1白金耳接種至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng) 2448小時。取培養(yǎng)物1ml，加入9%滅菌生理鹽水9ml，混勻，

17、10倍稀釋至10-510-6細 菌數(shù)約50100cfu/ ml的菌懸液備用。 接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物于改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25C培養(yǎng)57天至大量抱子產(chǎn)生。力卩0.9%無菌氯化鈉溶液10ml將抱子洗脫。然后吸出抱子懸液，加入蒙有滅菌紗 布的無菌試管中。取此抱子懸液1ml加到9ml0.9%無菌氯化鈉溶液中，逐管10倍稀釋至 10-5約為50100cfu/ ml的菌懸液備用。2.供試品制備供試品名稱及取樣點： 純化水。取樣點（1） 4T/h純水系統(tǒng)二級反滲透裝置進純水 箱口 ;（2） 4T/h 純水系統(tǒng)液體制劑二樓潔具間用水點；（3） 4T/h純水系統(tǒng)三樓固體制劑 純水箱總回水口。按照驗證方案

18、，采用每張濾膜取純化水 5ml。六、驗證方法（一）、細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)方法1、試驗組 取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用 0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾 膜3次，每次100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽 抱桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml）各1ml，平行兩張 濾膜，過濾后，取濾膜，將其菌面朝上貼于相應培養(yǎng)基上培養(yǎng)。計數(shù)。2、 菌液組大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌與枯草芽抱桿菌分別取1ml面液分別注入平皿中，并立即傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置3536C培養(yǎng)24小時；白色念珠菌、黑曲霉分別取 1ml面液分別

19、注入平皿中，并立即傾注玫瑰紅鈉瓊脂 培養(yǎng)基，每個面液分別制備二個平皿，置 2425C培養(yǎng)48小時。菌落計數(shù)結(jié)果（2個平 皿計數(shù)取平均值）見下表菌落計數(shù)結(jié)果（cfu / ml）試驗次數(shù)10-5稀釋10-6稀釋10-7稀釋121212大腸埃布困金黃色葡萄球菌枯草芽抱桿菌白色念珠菌黑曲霉3供試品對照組 取純化水5ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用 0.9%無菌氯化鈉溶液沖 洗濾膜3次，每次100ml，平行兩張濾膜，過濾后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng) 基平板上培養(yǎng)。細菌、霉菌及酵母菌各制備 2個平皿，測定供試品本底菌數(shù)。4.稀釋劑試驗組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，每次

20、100ml，在最后一次的沖洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml ）各1ml，平行兩張濾膜，過濾后， 取濾膜，將其菌面朝上貼于相應培養(yǎng)基上培養(yǎng)。5稀釋劑對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，平行兩張 濾膜，減壓抽干后，取出濾膜，菌面朝上貼于瓊脂培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)， 平行制備2個平皿， 置適宜溫度培養(yǎng)4872h，觀察結(jié)果，測定菌數(shù)。6附表（二）控制菌檢查方法驗證（常規(guī)法）試驗組 取5ml的純化水，以無菌操作加入過濾器內(nèi)，用PH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖 液，沖洗濾膜3次，每次100ml，在最后一次的沖

21、洗液中分別加入上述的金黃色葡萄球菌、 枯草芽抱桿菌、大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌菌液（50100cfu/ml ）各1ml，平行兩張濾膜，過濾后，取濾膜，接入膽鹽乳糖培養(yǎng)基100ml中，按相應控制菌檢查法進行檢查。試驗結(jié)果：上述試驗組檢出試驗菌，按此供試液制備法和控制菌檢查法進行供試品 的該控制菌檢查。故可按常規(guī)法進行控制菌檢查。七、驗證結(jié)論和評價通過三次獨立試驗，證明所采用的供試液制備方法及薄膜過濾法適合于純化水細 菌、霉菌及酵母菌數(shù)測定。控制菌可按常規(guī)法進行檢查。本次驗證各試驗組的菌回收率和各稀釋劑對照組的菌回收率均不低于70%按標準規(guī)定，本次試驗結(jié)果符合規(guī)定。根據(jù)驗證試驗結(jié)果，純化水微生物限度檢查按照 2010版中國藥典二部附錄XIII微 生物限度檢查法檢驗，細菌、霉菌及酵母菌計數(shù)采用平皿法檢查，符合規(guī)定。19附表2:獨立試驗二：各試驗組菌落計數(shù)（回收率 %取樣點丄試驗時間年 月曰完成時間 年 月曰驗證菌株平皿號菌液組菌落數(shù)（cfu）供試品對 照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌落數(shù)（cfu）稀釋劑對照組菌落數(shù)（cfu）試驗組菌回收率（%）稀釋劑對 照組菌回 收率（%）大腸埃希菌（培養(yǎng)48小時計數(shù)）12平均值金黃色葡 萄