methuosis是一種新的蛋白酶獨立細胞死亡的形式

1、對吲哚類查耳酮作為新型非細胞凋亡形式Methuosis的誘導(dǎo)劑的合成和評價methuosis是一種新的蛋白酶獨立細胞死亡的形式，從胞吞胞吐派生的空泡的大量積累，最終導(dǎo)致細胞脫離底層和裂開。最近，我們描述了1查耳酮化合物，3 - 2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1-即，MIPP，它可以誘導(dǎo)methuosis在神經(jīng)母細胞瘤和其他類型的癌細胞發(fā)生。在此，我們描述了直接相關(guān)化合物庫的合成及構(gòu)效關(guān)系，供應(yīng)了深化了解兩個芳環(huán)系統(tǒng)的奉獻，并強調(diào)了一個強有力的衍生物，3 - 5 - 甲氧基-2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1-即，

2、MOMIPP在微摩爾濃度這樣低的濃度下可誘導(dǎo)methuosis。我們也分析了疊氮衍生物的生物活性，可能有助于旨在用光親和標(biāo)記技術(shù)鑒定蛋白質(zhì)目標(biāo)MOMIPP的將來商量。這些商量的潛在意義通過發(fā)現(xiàn)MOMIPP有效地降低了替莫唑胺耐藥性膠質(zhì)母細胞瘤和阿霉素耐藥乳腺癌細胞的生長活性而不斷被重視。因此，它可能可以作為一種能夠在癌癥中通過methuosis形式來促進細胞凋零的藥物原型，這種原理與傳統(tǒng)細胞死亡如細胞凋亡的機理不同。介紹盡管在開展中國家針對特有的某些類型的癌癥細胞的調(diào)控途徑的治療藥物有了最新進展，很多腫瘤術(shù)后幫助治療的重要支柱仍然是輻射和DNA烷化劑。一個例子是高度惡性腦腫瘤，膠質(zhì)母細胞瘤GB

3、M，在現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的護理是手術(shù)，在可能的情況下，也會有輻射和口服替莫唑胺TMZ網(wǎng)站的幫助治療。1后者方法的一個限制是，他們以通過破壞DNA而引發(fā)內(nèi)在的凋亡途徑的形式工作。2由于GBM細胞通常在海港抑癌基因的突變例如，PTEN，P53，PRB，他們是相對不敏感的凋亡刺激。3，4此外，膠質(zhì)母細胞瘤細胞通過提高他們修復(fù)DNA損傷的能力而獲得對烷化劑的抗藥性。5我們信任，有可能開發(fā)新的方法通過誘導(dǎo)可替代的非細胞凋亡的細胞死亡形式來治療這類有抗藥性的癌癥，這種細胞死亡形式不以DNA損傷作為觸發(fā)。為此，我們定義了一個獨特的細胞死亡的形式稱為“methuosis6,7methuosis的特點是大局部細胞的細胞質(zhì)

4、空間以從macropinosomes派生空泡形式產(chǎn)生位移。6后者當(dāng)膜皺褶偽足附上很多口袋狀細胞外液，并內(nèi)化時形成。在methuosis8，9，回收的減值和溶酶體導(dǎo)向販運macropinocytotic囊泡的作用把他們鎖定在中間階段，在此他們?nèi)诤隙鸩叫纬奢^大的液泡。這最終導(dǎo)致代謝活動削減，細胞膜裂開。6這種死亡被認為是非細胞凋亡形式，由于其并非伴隨著核染色質(zhì)濃縮，細胞出泡，或核小體DNA片段。methuosis也是caspase獨立的，由于它不能被廣譜蛋白酶抑制劑如ZVAD-FMK阻止。Methuosis本質(zhì)特點在于GBM細胞，它是被激活的Ras和Rac GTP酶異位表達而觸發(fā)這種形式的細胞死

5、亡的場所。然而，利用這種特別規(guī)的細胞死亡途徑殺死那些不易細胞凋亡的癌細胞的潛力取決于分子是否可以誘導(dǎo)methuosis druglike屬性識別。最近，我們描述了一個原型查耳酮相關(guān)化合物，它能在抗TMZ和非抗GBM細胞以及來自乳腺癌，結(jié)腸癌，胰腺的其他癌癥細胞系以帶有methuosis的特征形式來誘導(dǎo)細胞死亡10。在此，我們報告了相關(guān)化合物庫合成及構(gòu)效關(guān)系SAR的商量從而導(dǎo)出1定義的主要特點，為誘導(dǎo)methuosis活動，2確定改進生物活性的衍生物以及開展一個可能適合在將來目標(biāo)識別工作中用作光親探測器的疊狀類似物做籌備。結(jié)果SARs由于我們開頭尋求可能引發(fā)methuosis的 druglike

6、小分子，我們注意到Kirchhausen和同事11寫的一個報告，他們描述了被稱為vacuolin-1的分子及一些其他三嗪類化合物，這些化合物能夠抑制Ca2+依靠溶酶體胞吐。雖然這些化合物能誘導(dǎo)標(biāo)記的細胞空泡化，他們并沒有引起細胞死亡。然而，在本報告中包含的信息中，一種結(jié)構(gòu)獨特的誘導(dǎo)液泡的化合物我們的注意，由于它相像的一類分子稱為查耳酮。這種化合物的結(jié)構(gòu)被描繪在圖1化合物1。查耳酮由一個1,3 - 二苯基-2 - 丙烯-1框架組成，這種框架是黃酮類天然產(chǎn)物的前體組成。然而，查耳酮已長期被廣泛應(yīng)用于描述很多在此框架內(nèi)建立的合成衍生物。幾種查耳酮12已發(fā)現(xiàn)有顯著的抗癌活性，但尚未被報道能誘導(dǎo)細胞空泡

7、化。12-14 這促使我們疑心化合物1可能代表了一種新型的查耳酮，它可以通過誘導(dǎo)methuosis殺死癌細胞。我們發(fā)現(xiàn)，化合物1幾個小時內(nèi)在膠質(zhì)瘤細胞引起廣泛空泡，48小時內(nèi)造成細胞活力的重大損失。10化學(xué)數(shù)據(jù)庫的檢索發(fā)現(xiàn)了相像性 75的其他化合物。其中，化合物2圖1被選定做進一步商量。它引起的空泡比化合物1引起的更大、更多。化合物2被安排的縮寫是MIPP，即3 - 2 - 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯1。 MIPP的生物效應(yīng)的簡略評價說明，這種化合物誘導(dǎo)細胞死亡的形式與methuosis的數(shù)據(jù)圖表相匹配。10此外，MIPP在抑制對TMZ有高抗的GBM細胞的生

8、長和活力方面也特別有效。 10Figure 1. Structures of compounds 1 and 2, initially found to be active inducers of methuosis(10) as compared with commercially available analogues 38, which failed to induce the hallmarks of methuosis in culture U251 GBM cells.由于需要MIPP的濃度10M才能有效誘導(dǎo)methuosis，所以我們開頭組裝MIPP相關(guān)化合物庫，并與經(jīng)效能提高確

9、實定的目標(biāo)類似物進行初步特區(qū)的比擬。我們首先從比擬MIPP和市售的幾個相關(guān)化合物圖1化合物3-8誘導(dǎo)methuosis的活性開頭。當(dāng)在U251 GBM細胞中添加濃度為10m時，后者沒有觸發(fā)細胞空泡化。1-8化合物圖1的檢驗說明，吲哚和吡啶環(huán)之間的特有關(guān)系很可能在一些特定活動中起到重要作用。簡略來說，化合物1有效與化合物7無效的比擬說明吡啶環(huán)的重要性，由于當(dāng)用段 - 甲氧基苯基環(huán)化合物來代替它時呈現(xiàn)無效。因此，一種類似物的初始構(gòu)成被合成，以用來商量調(diào)查吡啶氮的位置對生物活性的影響。，-不飽和酮的核心根底類似物可以由吲哚-3 - carboxaldehydes和芳酮的Claisen-Schmidt

10、縮合制備。15苯乙酮或各種乙酰吡啶，吲哚-3 - 甲醛的縮合反響產(chǎn)生化合物9-12圖1A。這些化合物依據(jù)三個標(biāo)準(zhǔn)與濃度為10M的MIPP進行了活性比擬：1在24和48 h借助相差顯微鏡進行活細胞的形態(tài)空泡評估; 248小時時結(jié)束用3 - 4,5 - 二甲基-2 - 基-2,5 - 二苯基溴化四唑MTT法對細胞存活率評估，并在第一個24小時;后添加新奇化合物。348小時暴露在這些化合物中的細胞上顯示細胞集落形成方式2周為限。這一分析結(jié)果見表1說明，第一個吡啶環(huán)的氮取向是其是否具有活性的一個關(guān)鍵特征。元和正射類似物10和11，以及苯乙酮類似物9，均在誘導(dǎo)methuosis方面與MIPP相比相對無效

11、。相比之下，去除MIPP吲哚環(huán)化合物122 - 甲基，雖削減但并未消除活性。Scheme 1. Synthesis of Analogues of MIPP (Compound 2)aaThe specific substituents at R1, R2, R3, and Ar for each numbered compound are listed in the chart. For AD, the specific conditions and reagents were as follows: (A) piperidine, CH3OH, reflux, 1989%. (B) BBr

12、3, CH2Cl2, 78 C, 61 and 95% for 15 and 21, respectively. (C) POCl3, DMF, 0 C, 90%; piperidine, CH3OH, reflux, 89%. (D) NaH, CH3I, DMF, RT, 82%.Table 1. Summary of SAR Studies Performed on MIPP (Compound 2) and Related Compounds Generated in Schemes 1 and 2Table * Results are expressed as percent of

13、controls that received vehicle alone (DMSO). Values are the mean SD of quadruplicate (MTT) or triplicate (colony formation) determinations.接下來，我們分別用市售5 - 甲氧基和5 - 芐氧基吲哚-3 甲醛籌備化合物13和14來探究吲哚環(huán)的5位上基團的官能團作用。5 - 甲氧基化合物13，反過來用BBr3甲基化形成5-OH的化合物15圖1B。如表1所示，盡管他們在短期的增長/可行性實驗中細胞毒性不全都。但當(dāng)在集落形成實驗和細胞形態(tài)方面比擬時,化合物13和14

14、的活性類似MIPP。相比之下，5 - 羥基取代化合物15在全部的檢測中表現(xiàn)出的生物活性卻大大降低。為了確認吡啶氮的位置仍然是5 - 甲氧基取代的化合物活性的關(guān)鍵，類似物16和17被分析。假設(shè)其失去活性那么證實吡啶氮見表1的必要性。由于比擬化合物12-15與MIPP說明吲哚環(huán)5位和2位的轉(zhuǎn)變都會影響活性，我們從市售2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚動身合成了2 - 甲基-5 - 甲氧基類似物。我們通過Vilsmeier-哈克甲酰化2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚合成了關(guān)鍵中間體18，接著與4 - 乙酰吡啶耦合出化合物19圖1C。無論是在MTT法的可行性分析還是在克隆形成實驗中，這種化合物的抑制活性

15、超過MIPP見表1。此外，甲基吲哚氮的化合物13與NaH/CH3I在二甲基甲酰胺DMF方案1D制造20時產(chǎn)生了一種化合物，它能誘發(fā)一些胞質(zhì)空泡化，但只有溫和影響細胞活力見表1。因此，比擬化合物13，19和20后，我們明白當(dāng)吲哚1、2位分別被H和甲基占用時，其取得最正確的活性。5-OH的化合物21，由BBr3去甲基化的191B方案形成，與5 - 甲氧基化合物19見表1相比，其表現(xiàn)出在活性上的顯著降低與先前觀察到的5-OH在化合物15的不利效果全都。在生理條件下使用MIPP的局限性之一是其在水溶液中始終有肯定溶解度。因此，我們做了一組在生理PH時增加極性的實驗，用來探討轉(zhuǎn)變過的吲哚5位基團所帶來的

16、影響。由于我們以前的SAR商量說明，吲哚環(huán)的5位基團有肯定隨機性比擬化合物13和14，所以我們設(shè)計了一個14的類似物，增加了電荷和吲哚2位上的一個甲基。我們設(shè)想，OH類似物21可被甲基4 - 溴甲基苯甲酸烷基化，然后被其酸水解，從而產(chǎn)生一種在pH=7.4時的高水溶性類似物。然而，我們有些吃驚，沒有明顯的產(chǎn)品，可以由21直接烷基化生產(chǎn)。我們在不同pKa值的多個基地進行了篩選，從K2CO3到Cs2CO3，以及乙胺，tetramethylguanidine，1,8 - 二氮雜雙環(huán)5.4.0-螺-7烯DBU，氫化鈉。我們在全部的反響中對在吡啶氮發(fā)生的烷基化反響進行了觀察。強如TMG和NaH的，即使使用

17、1當(dāng)量，也產(chǎn)生可觀的吲哚的N-烷基化以及吡啶，吲哚羥基烷基化等反響。單被烷基化產(chǎn)品的產(chǎn)量在5-吲哚的地位是微缺乏道的。因此，一個新的路線即在引入吡啶基團方案2前官能化吡啶就產(chǎn)生了。市售的2 - 甲基-5 - 甲氧基吲哚被BBr3甲基化產(chǎn)生22。 4 - 甲基-溴甲基苯甲酸烷基化產(chǎn)物在相轉(zhuǎn)移條件下用于合成單 - O-被烷基化產(chǎn)品23。16經(jīng)過POCl3/DMF的甲?；幚?，中間體24和25被獨立制備。相關(guān)反響在溫和條件根底下碳酸氫鈉生產(chǎn)了酯24，而在5 N的氫氧化鈉條件下產(chǎn)生酸25。4 - 乙酰吡啶的縮合產(chǎn)生了相應(yīng)的產(chǎn)物26、27。然而，在神經(jīng)母細胞瘤的實驗測試發(fā)現(xiàn)，既不是26也不是27誘導(dǎo)me

18、thuosis見表1。Scheme 2. Analogues with 5 Modifications of the Indole Ring Generated by Functionalizing the Indole Prior to Introduction of the Pyridine MoietyaaConditions and reagents: Compound 22: BBr3, CH2Cl2, 78 C, 93%. Compound 23: methyl-4-(bromomethyl)benzoate, NaOH, TBAB, CH2Cl2, RT, 63%. Compou

19、nd 24: (1) POCl3, DMF, 0 C; (2) NaHCO3, 90%. Compound 25: (1) POCl3, DMF, 0 C; (2) 5 N NaOH, 99%. Compound 26: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 34%. Compound 27: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 21%.化合物19MOMIPP與化合物2MIPP生物活性比擬上述商量確定化合物19是最有力誘導(dǎo)methuosis的化合物。此后，我們將3 - 5 - 甲氧基-2

20、- 甲基-1H-吲哚-3 - 基-1 - 4 - 吡啶基-2-丙烯-1這種化合物縮寫為“MOMIPP。 MOMIPP與化合物2MIPP高生物活性在商量U251膠質(zhì)瘤細胞中被證實，商量中我們接受MTT法的可行性分析，細胞生長實驗，形態(tài)評估，和集落形成實驗來比擬MOMIPP和MIPP。圖2A顯示的是藥物對細胞活力的影響的劑量反響曲線。分別添加每個化合物到指定的濃度，保持2天，并且在第一天后要補充原料。MOMIPP與MIPP的IC50分別為1.9微米與4.8微米。為了獲得對每個化合物的活性持續(xù)比擬的方法，我們通過連續(xù)三天對在2.5，5，或10M的化合物處理下培育的細胞數(shù)量圖2B進行計數(shù)的方法來評估它

21、們對細胞的生長和生存的影響。與可行性商量不同的是，在這些實驗中，該化合物在商量開頭時被添加，并沒有持續(xù)的補充。在這些條件下，MOMIPP顯然在削減細胞的生長和降低細胞活性方面比MIPP更有效。在用MOMIPP處理的組中細胞數(shù)量的削減以大規(guī)模早期細胞空泡的消失和底層非活性細胞的損傷的形式表現(xiàn)。與此相反，用MIPP處理的細胞最初在第1天和第2天經(jīng)歷過空泡階段，卻表現(xiàn)出恢復(fù)趨勢，尤其是在2.5M濃度下圖3A。這些商量說明，單獨作用時，MOMIPP比MIPP對細胞形態(tài)和細胞活力的影響更持久。當(dāng)用集落形成實驗來評估細胞增殖能力和長期活力時，MOMIPP和MIPP的區(qū)分就表現(xiàn)特別明顯圖4。當(dāng)細胞處理2天時

22、，MOMIPP顯然在削減細胞集落形成方面比MIPP有效圖4A。如果處理被縮短到4小時，MOMIPP還是較MIPP有效，但都需要更高的濃度以削減集落形成圖4B。Figure 2. Comparison of the effects of MOMIPP (compound 19) and MIPP (compound 2) on growth and viability of U251 GBM cells. (A). One day after plating the cells in 96-well dishes, MOMIPP () or MIPP () was added at the in

23、dicated concentrations. Controls consisted of cells in parallel wells treated with an equivalent volume of vehicle (DMSO). Medium containing fresh compound was added after 24 h, and MTT assays were performed after a total 48 h of treatment. Each point represents the mean (SD) from four separate well

24、s, with the results expressed as percent of the mean of the parallel control wells. (B) U251 cells seeded in parallel 35 mm dishes were treated with MOMIPP (), MIPP (), or an equivalent volume of DMSO (), and cells were harvested for counting on each of three consecutive days. Each point is a mean S

25、D from three separate cultures.Figure 3. Comparison of the abilities of MOMIPP and MIPP to induce the morphological hallmarks of methuosis. One day after plating, U251 GBM cells were treated with MOMIPP or MIPP at final concentrations of 2.5 (A) or 10 M (B). Controls received an equivalent volume of

26、 vehicle (DMSO). Cells were observed by phase contrast microscopy on three sequential days after addition of the compounds, without changing the medium or replenishing the compounds. Methuosis is characterized by extensive accumulation of phase-lucent cytoplasmic vacuoles, with eventual cell roundin

27、g and detachment from the substratum as viability Figure 4. Comparison of the abilities of MOMIPP and MIPP to inhibit survival of U251 GBM cells in colony-forming assays. (A) Cells were plated for colony-forming assays as described in the Experimental Section. One day after plating the cells, MOMIPP

28、 () or MIPP () was added to the medium at the indicated concentrations, and cells were maintained in the presence of the compounds for 48 h. Thereafter, the compounds were removed, and colonies 50 cells were counted after 2 weeks. Each point represents the mean (SD) from three separate dishes, with

29、the results expressed as percent of the mean of the parallel control dishes containing DMSO. (B) The effects MOMIPP () and MIPP () on colony formation were compared as in panel A, except that cells were exposed to the compounds for only 4 h instead of 48 h.為了確定誘導(dǎo)methuosis的化合物針對抗TMZ的神經(jīng)母細胞瘤是否有效，我們使用以前

30、生成的根本上不受濃度高達100微米TMZ影響的抗TMZ膠質(zhì)瘤細胞系10圖5A如圖5b所示，MIPP和MOMIPP能夠誘導(dǎo)methuosis和降低抗TMZ細胞的細胞活性，但MOMIPP的效能明顯優(yōu)于MIPP。MOMIPP通過methuosis形式殺死有抗藥性的腫瘤細胞的能力并不僅僅局限于膠質(zhì)母細胞瘤。例如，我們觀察到類似情況，MOMIPP在親代和抗阿霉素的MCF-7乳腺癌細胞圖5C，D引起空泡并導(dǎo)致其集落形成能力的降低。為了確定對腫瘤細胞造成最大限度毒性作用的濃度的MOMIPP是否也會對正常細胞產(chǎn)生毒性，我們用10MMOMIPP處理人類乳腺上皮細胞HMEC。圖5E所示，在參加MOMIPP后24小

31、時內(nèi)HMECs進行大范圍的細胞質(zhì)空泡化。到48小時，細胞活力削減約40，而在類似的細胞密度下同期處理的MCF7乳腺癌細胞削減了70圖5F。為了進一步評估MOMIPP對正常細胞的影響，我們把化合物應(yīng)用到人體皮膚成纖維細胞。在全部其他細胞測試實驗中，到24小時10MMOMIPP明顯誘導(dǎo)成纖維細胞空泡化圖5G。與HMECs類似，接種在適宜密度來保持指數(shù)增長的正常成纖維細胞在接觸到MOMIPP 48小時時，表現(xiàn)出生存能力下降40的特點。然而，當(dāng)纖維母細胞接種在一個較高的初始密度，使他們在MOMIPP參加時以形成固定相，那么細胞活性根本上不受影響圖5H，即使細胞發(fā)生空泡未顯示。這些觀察說明，雖然MOMI

32、PP會對正常細胞產(chǎn)生毒性，但與癌癥細胞系，如U251和MCF7相比，正常細胞對這類化合物相對不太敏感。MOMIPP對亞融合與融合的成纖維細胞的影響差異供應(yīng)了一個可能的解釋，這意味著，以空泡為典型的內(nèi)體販運的中斷可能在不分裂的細胞中比在正常增殖的細胞中具有相對較好的耐受性。 Figure 5. MOMIPP effectively inhibits the viability of drug-resistant GBM and breast cancer cells. (A) TMZ-resistant U251 glioblastoma cells (U251-TR) were derived

33、 as described previously.(10) The graph, reprinted from ref 10 with permission, shows that in contrast to the parental U251 cells, the viability of U251-TR cells is not reduced by treatment with TMZ. (B) The U251-TR cells were treated with the indicated concentrations of MIPP or MOMIPP for 48 h and

34、then subjected to colony-forming assays as described in the Experimental Section. Each point is based on colony counts from three dishes (mean SD), with the results expressed as percent of the mean from parallel control dishes treated with an equivalent volume of vehicle alone (DMSO). (C) Parental a

35、nd doxorubicin-resistant (DoxR) MCF-7 breast cancer cells(56) were treated with 10 M MOMIPP for 24 h and then examined by phase-contrast microscopy. (D) Long-term viability of parental or DoxR MCF-7 cells was assessed by colony-forming assay after a 48 h of treatment with the indicated concentration

36、s of MOMIPP. The results are the mean SD of determinations performed on three parallel dishes. (E) Normal HMECs were treated with 10 M MOMIPP or an equivalent volume of DMSO (control) and examined by phase-contrast microscopy after 24 h. (F) MCF-7 cells or HMECs were plated in 96-well plates. After

37、48 h, while the cells were still subconfluent, fresh medium containing 10 M MOMIPP or an equal volume of vehicle (DMSO) was added. MTT viability assays were performed at a 48 h end point. Values are the means (SD) from four separate wells. (G) Normal human skin fibroblasts were treated with 10 M MOM

38、IPP or an equivalent volume of DMSO (control) and examined by phase-contrast microscopy after 24 h. (H) Normal human fibroblasts were seeded in 96-well plates at subconfluent density (1000 cells/well) or confluent density (10000 cells/well). After 24 h, fresh medium containing 10 M MOMIPP or an equa

39、l volume of vehicle (DMSO) was added. MTT viability assays were performed at a 48 h end point. Values are the means (SD) from four separate wells.潛在的光親探針的合成及生物活性我們SAR的商量說明，MIPP或MOMIPP例如，修改吡啶環(huán)結(jié)構(gòu)的特別微小的變化可以消除他們誘導(dǎo)methuosis的能力。雖然查耳酮被普遍認可為親電試劑，誘導(dǎo)methuosis所需的結(jié)構(gòu)特異性的嚴(yán)格要求說明，MIPP和MOMIPP的直接影響最有可能源于它們與一個或多個不同的靶分

40、子之間的相互作用。幾個關(guān)于通過親電化合物進行特定蛋白質(zhì)修改的例子已有報道見商量。因此，今后的一個重要目標(biāo)是確定能誘導(dǎo)methuosis的查耳酮的靶目標(biāo)。確定藥物靶點的一個常用的方法是親和層析。然而，在這一點上，我們的SAR商量還沒有發(fā)現(xiàn)任何非本質(zhì)的數(shù)據(jù)庫，可以鏈接到一個龐大的親和標(biāo)簽庫例如，生物素或拴了沒有失去活性的堅實基體。因此，我們致力于制備用活性基團微小改進的具有生物活性的類似物，這可能對親光性的藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)工作有肯定意義。18最初，我們設(shè)計了一個MIPP的苯甲類似物作為潛在的光親和探針。苯甲酮是常常被納入靶目標(biāo)識別商量的活潑分子。在化合物14的結(jié)構(gòu)的根底上，我們假定5苯甲酰類似物可能保

41、存了作為光親和探針的活性和功能。二苯甲酮類似物化合物，苯甲酰MIPP30用兩個步驟制備，首先從2 - 甲基吲哚的VilsmeierHaack中間體圖3A?；_頭。該系統(tǒng)已被證明能用甲基化的吲哚直接?；? - 6位。在我們的實驗中，2 - 甲基吲哚的VilsmeierHaack中間體經(jīng)酰化后產(chǎn)生比例分別為1:3的5- 和6 - 苯甲?；? - 甲基吲哚-3 - 甲醛混合物28和29。這個區(qū)域選擇性的特點是一維的Overhauser核效應(yīng)NOE，這在試驗階段也有陳述。該方案的其次個步驟，最后30和31兩個化合物，由4 - 乙酰吡啶在哌啶條件下耦合醛形成。隨后的形態(tài)和可行性商量顯示，與芐衍生物化合物

42、14不同的是，當(dāng)在U251細胞數(shù)據(jù)未顯示測試時，沒有一個苯甲酮類似物30日和31日能誘導(dǎo)methuosis。Scheme 3. Synthesis of 5 and 6 Azido Derivatives of MIPPaa(A) Conditions and reagents: Compounds 28 and 29: (1) COCl2, DMF, 1,2-DCE, 0 C; (2) AlCl3, benzoyl chloride, 0 C RT, 13 and 41% for 28 and 29, respectively. Compound 30: 4-acetyl-pyridine,

43、 piperidine, MeOH, reflux, 13%. Compound 31: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 74%. (B) Conditions and reagents: Compound 32: NaNO3, H2SO4, 0 C, 95%. Compound 33: H2, 10% Pd/C, EtOH, RT, 97%. Compound 34: (1) NaNO2; (2) NaN3, 75% AcOH, 0 C, 66%. Compound 35: POCl3, DMF, 0 C, 88%. Compound

44、 36: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 39%. Compound 37: NaNO3, H2SO4, 0 C, 62%. Compound 38: H2, 10% Pd/C, EtOH, RT, 99%. Compound 39: (1) NaNO2; (2) NaN3, 75% AcOH, 0 C, 53%. Compound 40: POCl3, DMF, 0 C, 69%. Compound 41: 4-acetyl-pyridine, piperidine, MeOH, reflux, 39%.芳香疊氮化合物含有常被用在光親

45、和標(biāo)記的另一種光活性基團。因此在MOMIPP的疊氮部位的結(jié)構(gòu)變化較苯甲酰組化合物30疊氮部位的要小前提下，我們接下來探究疊氮化合物是否可以被添加到吲哚環(huán)的5 - 或6位而沒有失去誘導(dǎo)methuosis活性。化合物365-疊氮MIPP的合成基于2-烷基吲哚5位的直接硝化和進一步的疊氮結(jié)構(gòu)重氮化轉(zhuǎn)換26見方案3B。2 - 甲基吲哚在濃硫酸條件下被選擇性硝化生成產(chǎn)物32見試驗階段驗證regiospecificity的細節(jié)，然后加氫生成胺33。溫和重氮化條件下，氨基吲哚轉(zhuǎn)化為芳香疊氮化合物34。疊氮化物通過甲酰化得到35，35與4 - 乙酰吡啶的濃縮產(chǎn)生365疊氮MIPP。此外，對 2 - 甲基-5

46、- 甲氧基吲哚進行相同反響步驟，其中硝化反響主要生成6-硝化產(chǎn)品37。依據(jù)相同的序列完成以上所述的反響步驟就得到416疊氮MOMIPP。365-疊氮MIPP和416 - 疊氮MOMIPP的生物活性評價說明通過判別U251細胞中細胞空泡圖6a形成和集落形成的抑制作用圖6B，C，這兩種化合物保存了誘導(dǎo)methuosis的活性。雖然比不上MOMIPP，5-疊氮化合物在其生物活性方面明顯優(yōu)于6疊氮化合物。Figure 6. Comparison of the effects of MOMIPP (compound 19), 5-azido-MIPP (compound 36), and 6-azido

47、-MOMIPP (compound 41) on morphology and viability of U251 glioblastoma cells. (A) The indicated compounds were added to the cells at concentrations of 2.5 or 10 M, and the cells were observed by phase-contrast microscopy after 48 h. (B and C) U251 cells were treated with varying concentrations of th

48、e indicated compounds for 48 h, and long-term cell viability was assessed by colony-forming assays. Each represents the counts from three dishes (mean SD), with the results expressed as percent of the mean from parallel control dishes treated with an equivalent volume of vehicle alone (DMSO).商量- -me

49、thuosis是一種新發(fā)現(xiàn)的非細胞凋亡的形式，由胞吞胞吐販運形式的轉(zhuǎn)變引發(fā)，進而導(dǎo)致大量細胞空泡化和細胞代謝的完整性破壞。這里，我們描述了類似查耳酮的小分子MIPP，它能夠在GBM和其他腫瘤細胞株中誘導(dǎo)methuosis。在這里，我們呈現(xiàn)了旨在對被稱為MOMIPP的5 - 甲氧基類似物鑒定的SAR商量，這種化合物在細胞培育系統(tǒng)展現(xiàn)了更好的效能和穩(wěn)定性。我們也制造了有活性的疊氮化合物，可能有助于將來旨在識別MOMIPP的蛋白質(zhì)受體方面的商量。在為SAR商量效勞的化合物庫形成過程中，我們進行了各種indole-3-carboxaldehydes和芳香酮在哌啶催化下的Claisen-Schmidt縮

50、合反響，從而能有效供應(yīng)吲哚查耳酮。由于哌啶作為一種催化劑，我們起初在具有催化作用的大量哌啶的條件下進行了醛縮合。然而，當(dāng)過量使用哌啶時，我們通常觀察到更高的產(chǎn)量。在幾乎全部情況中，產(chǎn)品從溶液中析出，然后用簡潔沖洗的方法很容易的從多余的催化劑或起始原料中純化出來。我們的SAR商量在探求這一類具有誘導(dǎo)methuosis活性的化合物需要什么分子特征方面供應(yīng)了一些有益的啟示。首先，關(guān)于吲哚環(huán)，氮的甲基化化合物20或去除2 - 甲基化合物13降低但并未消除活性。在5位，不同的修改有相反的結(jié)果。5 - 甲氧基化合物19歲，MOMIPP的活性大大提高，而5 - 芐化合物14與經(jīng)取代的MIPP類似。相反，用O

51、H化合物21，P-甲基芐氧基酯化合物26和P-羧基芐氧基化合物27修改5位都造成活性的重大損失?？傊?，這些商量結(jié)果說明，將來嘗試進一步提高效能，制造更多的水溶性衍生物，或?qū)⑦@些化合物附在親和基質(zhì)，吲哚環(huán)上的這些位置存在的敏捷性是用的。關(guān)于其次個芳基查耳酮架構(gòu)系統(tǒng)，我們了解到，吡啶環(huán)的對位氮定位對活性是至關(guān)重要的。像2 - 吡啶化合物10，3 - 吡啶化合物11和16，吡嗪化合物17，或苯基類似物化合物9這些類似物是無效的。在對MOMIPP以methuosis誘導(dǎo)細胞死亡的潛在機制的思考中，一種可能性是，它可以作為親電試劑即邁克爾受體。親電基團使具有親電基團的內(nèi)在基質(zhì)變?yōu)榧毎H核試劑，他們在藥物

52、設(shè)計上不常使用，由于他們可以任意修改很多生物大分子。這可能會導(dǎo)致脫靶效應(yīng)，包括陽性半抗原的形成。在表1總結(jié)的SAR商量顯示，雖然在我們的系列中的很多化合物具有，-不飽和酮支架，也公認能作為邁克爾受體，但只有MOMIPP和其他一些化合物能在微摩爾濃度下成為methuosis有效誘導(dǎo)劑。因此，MOMIPP不大可能通過蛋白質(zhì)的親電改造誘導(dǎo)細胞死亡。它仍然是有可能的，MOMIPP可作為一個特定目標(biāo)的邁克爾受體運作，并帶有與特定的蛋白質(zhì)構(gòu)成的中介結(jié)合體分子的某些功能，并且在這里，鄰近的，-不飽和酮的親核殘基如半胱氨酸可能促進共價性改造。這種特定蛋白質(zhì)修改的例子已有過報道，化合物在革蘭氏陽性菌中結(jié)合到受體

53、蛋白ERBB2，29TRPA1離子通道，核蛋白質(zhì)KSRP/FUBP2，3130和sortase酶中。這些類型的觀測促使了人們對那些通過對其特定受體的共價性改造而起效的藥物的愛好的普遍高漲。被廣泛歸類為查耳酮的化合物已被證明通過多種機制表現(xiàn)出抗癌活性，包括中斷p53與MDM2蛋白或HDM2的相互作用，抑制P-糖蛋白13，34，35-37和中斷微管聚合。后者的化合物被設(shè)計成很多秋水仙堿的和能結(jié)合-微管蛋白的天然產(chǎn)品combretastatins的類似物。很多出版物已都出版證實查爾酮及相關(guān)分子可以作為抗有絲分裂劑，并且在生疏他們的SAR方面已取得實質(zhì)性進展。雖然我們的能誘導(dǎo)methuosis的活性化合物例如，MOMIPP可劃分為查耳酮類化合物，但其特定的特點與先前所描述的大多數(shù)抗有絲分裂的查耳酮類化合物完全不同。，methuosis誘導(dǎo)劑的嚴(yán)格的結(jié)構(gòu)特異性和吲哚和吡啶基團特定取代模式的依靠性，區(qū)分了以前報道為抗有絲分裂劑的查耳酮類化合物和MOMIPP。我們觀察到有絲分裂阻滯前用這些化合物處理的細胞沒有丟失活力未公布的觀察。相反，大量類似于我們用MOMIPP處理時觀察到的胞內(nèi)空泡在用抗有絲分裂的查耳酮類化合物處理時并沒有消失。在文獻中描述的全部具有細胞毒性的查耳酮類化合物中，與MOMIP