包埋法固定化微生物問題初探

1、包埋法固定化微生物問題初探韓斌 (南開大學環(huán)境科學與工程學院 環(huán)境科學系)指導老師：李瑩 蔡寶立 潘繼倫摘 要 本文概括介紹并比較了固定化技術的幾種主要的方法，并對目前筆者正在進行的包埋法固定化試驗中的兩個方法海藻酸鈉包埋法和PVAH3BO3包埋法做了一定的介紹和不同方法的比較。最后，簡要介紹了固定化細胞的性能的評價以及該種技術的應用和前景。關鍵字 固定化 包埋法 海藻酸鈉 PVAH3BO3 載體1、 引言固定化微生物技術使用化學或物理手段，將游離細胞或者酶定位于限定的區(qū)域，使其保持活性并可反復利用的方法。最初主要用于發(fā)酵生產(chǎn)，70年代后期，被利用到水處理領域，近年來則成為各國學者研究的熱點。

2、固定化微生物技術克服了生物細胞太小，與水溶液分離較難，易造成二次污染的缺點，保持了效率高、穩(wěn)定性強、能純化和保持高效菌種的優(yōu)點，在廢水處理領域有廣闊的應用前景。在實際應用過程中，如何固定、何種載體，才能使固定化微生物能較長時間的保持一定的強度和活度，才能降低固定化成本，延長固定微生物的使用壽命，是該技術在污水處理中得到廣泛應用的關鍵。2、 常用的固定化方法廢水處理中常用微生物固定化方法主要有：包埋法、交聯(lián)法、載體結(jié)合法。 2.1包埋法包埋法的原理是將微生物細胞截流在水不溶性的凝膠聚合物孔隙的網(wǎng)絡空間中。通過聚合作用或者離子網(wǎng)絡形成，或通過沉淀作用，或改變?nèi)軇囟?、pH值使細胞截流。凝膠聚合物

3、的網(wǎng)絡可以阻止細胞的泄漏，同時能讓基質(zhì)滲入和產(chǎn)物擴散出來。固定化微生物細胞的實用化對包埋載體的要求包括：（1） 固定化過程簡單，易于制成各種形狀，能在常溫常壓下固定化；（2） 成本低；（3） 固定化過程中及固定化后對微生物無害；（4） 基質(zhì)通透性好；（5） 固定化細胞密度大；（6） 載體內(nèi)細胞漏出少，外面的細胞難以進入；（7） 物理強度和化學穩(wěn)定性好；（8） 抗微生物分解；（9） 沉降分離性好。 在這些要求中，（1）和（2）涉及固定化細胞制備的成本；（3）（6）針對固定化細胞的催化活性；而（7）（9）則是出于對固定化細胞的操作穩(wěn)定性的考慮。2.2交聯(lián)法交聯(lián)法是使用雙功能的試劑與酶分子進行分子間

4、的交聯(lián)固定化方法。由于酶蛋白的功能團參與此反應，所以酶的活性中心構造可能受到影響，而使酶顯著失活。此外，交聯(lián)劑如戊二醛等價格昂貴，限制了其應用。2.3吸附法又稱載體結(jié)合法，是通過物理吸附、化學或者離子的結(jié)合，將微生物固定于非水溶性載體。這種方法操作簡單，對微生物活力影響小，但所結(jié)合的微生物數(shù)量有限，反應穩(wěn)定性和反復使用性差。主要分為物理吸附法、共價結(jié)合法、離子結(jié)合法和生物特異性吸附法四種方法。2.4三種固定化方法的比較盡管固定化方法多種多樣，但沒有一種理想的、普遍適用的方法。交聯(lián)法突出優(yōu)點是可以獲得很高的細胞密度，但由于缺乏良好的機械強度而不能得到廣泛的應用。吸附法的固定操作簡單，條件溫和，而

5、且載體可以再生；但是細胞與載體之間的結(jié)合力較弱，因此操作的穩(wěn)定性不好。包埋法有較好的綜合性能，催化活性保留和存活力都比較高，且包埋在反應工程（包括反應器的設計、操作穩(wěn)定性等）中應用靈活，因此，包埋法成為整個固定化生物催化劑技術中應用最廣泛的固定化方法；但是包埋法的擴散阻力較大，使細胞的催化活性受到限制，且不適用于涉及大分子物質(zhì)的反應。三種固定化方法總結(jié)于下表：表一 三種固定化方法的比較性 能交聯(lián)法吸附法包埋法制備的難易結(jié)合力活性表面固定化成本存活力適用性穩(wěn)定性載體的再生空間位阻適中強低適中無小高不能較大易弱高低由適中低能小適中適中適中低有大高不能大3、 包埋法固定化微生物的兩種方法舉例天然高分

6、子多糖類的海藻酸鈉，具有固定化成形方便，對微生物毒性小以及固定化密度高等優(yōu)點，但是其抗微生物分解性能較差，機械強度較低，同時海藻酸鈉凝膠再高濃度的磷酸緩沖液的反復沖擊下，經(jīng)過一段時間，顆粒變軟、粘連。合成高分子化合物中常用的載體材料是聚乙烯醇（polyvinyl alcohol 簡稱PVA），其突出優(yōu)點是抗微生物分解性能好，機械強度高，化學穩(wěn)定性能好。但是聚合物網(wǎng)絡的形成條件比較劇烈，對微生物細胞的損害較大，而且成形的多樣性和可控性不好。下面將對這兩種包埋方法作一個簡單的介紹：3.1海藻酸鈣包埋法3.1.1原理 海藻酸鈣包埋法是一種使用最廣、研究最多的包埋固定化方法，它具有固化、成形方便，對微

7、生物毒性小，固定化細胞密度高等優(yōu)點。海藻酸是用于包埋固定化微生物的第一個聚合物，但是當存在高濃度的K+、Mg2+、磷酸鹽以及其他單價金屬離子時，海藻酸鈣凝交的結(jié)構會受到破壞。此外，由于海藻酸鈣凝膠網(wǎng)絡的孔隙尺寸太大，酶可能會從網(wǎng)絡中泄露出來，因此不適合大多數(shù)酶的固定化。海藻酸鹽是棕色藻類的胞內(nèi)產(chǎn)物，它由兩種不同類型的單糖組成，即1，4D甘露糖醛酸（M）和1，4L古洛糖醛酸（G）。海藻酸鹽是一種聚合物。海藻酸鹽不能形成熱可逆性凝膠。通常是在其鈉鹽溶液中加入二價離子，如Ca2+，通過Ca2+取代Na+來形成凝膠網(wǎng)絡。凝膠的性質(zhì)與引入的二價陽離子及海藻酸鈉的類型（主要是兩種單糖的組成比例）有關。二價

8、陽離子對凝膠的機械強度有較大的影響，元素周期表的第二主族金屬離子于海藻酸鈉鹽形成的凝膠，其強度順序如下：Ba2+>Sr2+>Ca2+>>Mg2+利用海藻酸鈉凝膠固定化微生物法安全、快速、制備簡單，反應條件溫和，成本低廉且適用于大多數(shù)微生物的固定化。3.1.2固定化方法以海藻酸鹽為載體，建立包埋固定化微生物的方法如下：方法I將海藻酸鈉加熱溶于水；將海藻酸鈉溶液與微生物細胞混合均勻，使海藻酸鈉最終濃度為2%4%；將海藻酸鈉與菌體混合液用針形管滴入5%10%的CaCl2溶液中，固定化78h；濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法 II將按方法I制得的固定化細胞顆粒置于0.06m

9、ol/L的己二胺溶液中攪拌12h；濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法III將按方法I制備的固定化顆粒浸泡于下列溶液中： 殼聚糖 0.5% CaCl2 0.2mol/L pH 6.0濾出顆粒，水洗后，用0.5%戊二醛交聯(lián)5min；濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。 分別利用以上三種固定化方法，包埋黑曲酶細胞，比較各種固定化細胞的活性，其結(jié)果如表二： 表二 海藻酸鈣包埋法的比較固定化方法方法I方法II方法III固定化細胞相對活性57.1%52.9%44.8%由表二可以看出，用海藻酸鈉系列包埋固定化方法固定化微生物，固定化細胞的活性較高。其中用方法I固

10、定化細胞的活性最高，在方法II、III中，由于在海藻酸鈣凝膠表層突上了一層高分子膜，雖然增強了固定化顆粒的機械強度，但是同時加大了底物及氧的擴散阻力，從而降低了細胞活性。此外，在方法II、III中所采用的戊二醛對細胞液具有毒性，在使用前應作毒性試驗，確定是否采用改種交聯(lián)劑。3.1.3海藻酸鈉包埋法固定化試劑對細胞活性的影響（1）海藻酸鈉對細胞活性的影響 海藻酸鈉是一類天然高分子多糖類，對微生物沒有毒害作用。但海藻酸鈉的濃度會影響固定化細胞的機械強度、質(zhì)量傳遞等，進而影響到微生物的活性。海藻酸鈉濃度對固定化細胞活性的影響如表三所示。表三 海藻酸鈉濃度對細胞活性的影響海藻酸鈉濃度/%細胞相對活性/

11、%成球難易海藻酸鈉濃度/%細胞相對活性/%成球難易1.056.2易2.552.3易1.557.1易3.045.6較難2.055.4易（2）CaCl2濃度細胞活性的影響在海藻酸鈉包埋固定化過程中，凝膠化劑CaCl2中的Ca2+于海藻酸鈉根離子螯合形成不溶于水的海藻酸鈣凝膠，從而將細胞固定。CaCl2溶液的濃度對固定化細胞顆粒機械強度的影響見表四。表四 CaCl2濃度對固定化細胞凝膠機械強度的影響CaCl2濃度/%234510機械強度較好較好較好好好隨著CaCl2濃度的增加，微生物細胞的活性降低。當CaCl2濃度低于5%時，細胞活性可以保持在80%以上；但是當CaCl2濃度達到10%，細胞活性下降

12、到60%左右，主要原因估計有兩種（i）由于鹽的滲析作用，引起細胞脫水，致使微生物活性部分喪失；（ii）在PCR技術中，CaCl2是使細胞處于感受態(tài)的物質(zhì)，這個時候微生物是最脆弱的，很容易被外界的干擾破壞。從表四可以看出，CaCl2濃度對固定化細胞的機械強度影響較大。當CaCl2濃度為2%3%時，固定化顆粒在使用過程中會出現(xiàn)膨脹，甚至出現(xiàn)裂縫活破碎現(xiàn)象。因此，海藻酸鈣包埋法固定化細胞活性較高。3.2 PVAH3BO3包埋法3.2.1原理聚乙烯醇是一種新型的微生物包埋固定化載體，它具有機械強度高，化學穩(wěn)定性好，康微生物分解性能強，對微生物無毒，價格低廉等一系列優(yōu)點，是一種具有實用潛力的包埋材料，近

13、年來在國內(nèi)外獲得了較廣泛的研究。聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，簡稱PVA）的結(jié)構為： 聚乙烯醇在加熱后溶于水，在其水溶液中加入添加劑后發(fā)生凝膠化，或者在低溫下（-10）冷凍形成凝膠，從而將微生物包埋固定在凝膠網(wǎng)絡里。常用添加劑有硼酸和硼砂，在PVA水溶液中加入硼酸活著硼砂，由于化學反應而形成凝膠。PVA于硼酸反應形成的凝膠為單二醇型，與硼砂反應形成的凝膠為雙二醇型，其結(jié)構式如圖1。 圖1 PVA與硼酸和硼砂形成的凝膠結(jié)構PVA于硼砂反應形成凝膠時，成形困難，凝膠呈海綿狀結(jié)構，強度較低。但硼砂的用量較硼酸用量低得多，所以值的進一步研究。就目前的研究來看，大多采用H3BO3做交聯(lián)劑

14、。PVAH3BO3包埋法是一種制備容易且價格低廉的固定化方法，其反應原理如圖2。圖2 PVAH3BO3包埋法的反應原理利用該方法制得的凝膠顆粒機械強度高，使用壽命長且彈性好。 3.2.2固定化方法 以PVA為固定化載體，建立了利用PVAH3BO3包埋固定化微生物細胞的方法，具體方法如下： 方法I將聚乙烯醇（PVA）加熱溶于水；將微生物細胞與PVA溶液混合均勻，使PVA最終濃度為10%；將上述混合液滴入飽和的硼酸溶液中，放置10h，使其充分反應；濾出固定化顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。方法II將聚乙烯醇（PVA）加熱溶于水,冷卻；將微生物細胞與PVA溶液混合均勻，使PVA最終濃度為10%；將PVA

15、與微生物細胞的混合液到入已滅菌的培養(yǎng)皿中，緩慢加入飽和硼酸溶液，浸泡10h；將凝膠切成3mm×3mm×3mm的小方塊，用生理鹽水洗凈，備用。方法III將聚乙烯醇（PVA）與海藻酸鈉加熱溶于水,冷卻；將微生物細胞與上述溶液混合均勻，使PVA與海藻酸鈉最終濃度分別為7.510%，0.4%1.0%；將上述混合液用針形管滴入下列溶液中： H3BO3（飽和溶液） CaCl2 1.05.0 pH值4.07.0放置10h，使之充分反應；濾出顆粒，用生理鹽水洗凈，備用。利用上述固定化方法，包埋固定化黑曲酶，比較了固定化細胞的活性，結(jié)果如表五所示。表五 PVAH3BO3法固定化的比較固定化方

16、法方法I方法I方法III固定化細胞相對活性/%20.4%23.1%35.2%從表五可以看出，采用方法III，即改進的PVAH3BO3法固定化細胞，其活性明顯提高，這是由于在方法III的固定化過程中，引入了少量的海藻酸鈉。海藻酸鈉作為一種多糖類天然高分子化合物，對微生物細胞器一定的保護作用，減輕了硼酸對微生物的毒性作用，因此提高了固定化細胞的相對活性。3.2.3 PVAH3BO3法中固定化試劑對細胞活性的影響（1） PVA對細胞活性的影響 一般來說，PVA的濃度對微生物細胞活性的影響不大，即使高達10%時，對細胞活性也沒有明顯的不良影響。但是，PVA濃度增大，溶液的黏度隨之增大，使底物和產(chǎn)物的擴

17、散，尤其是氧氣的傳遞受到影響，進而影響細胞活性。（2） H3BO3對細胞活性的影響 硼酸的細胞毒性比較大，因而其對微生物細胞活性的影響是導致PVAH3BO3包埋固定化細胞活性底的主要原因。4、固定化細胞性能的評價4.1固定化顆粒的密度固定化顆粒是指一定體積內(nèi)固定化顆粒的量， 因此，確定固定化顆粒的密度，也就是測定其體積和重量。但是由于固定化顆粒表面附著著一些水分，它不是固定化顆粒的組分，也無法通過過濾除去，可利用某些特殊溶劑（如葡萄糖）吸收，而這種溶劑不會擴散到固定化顆粒內(nèi)，該溶劑被稀釋的量即為附著的水量。這樣，測定固定化顆粒的總量以及附著的水量即可通過計算的出其體積、密度和重量。具體方法此處

18、不再詳細敘述。4.2固定化顆粒的通透性和機械強度 固定化顆粒的通透性，也稱為傳質(zhì)性能，是用來衡量的固定化細胞與外界交換能力的重要指標。通透性越好，固定化細胞與外界的物質(zhì)交換越容易，固定化微生物對于外界污染物的降解能力越強。 機械強度，主要衡量固定化顆粒在外界的持續(xù)壓力沖擊下保持形狀的能力，一般來說，機械強度越大，顆?？芍貜屠寐试礁?，在工程上的應用價值越大。 但是，通透性和機械強度是一對矛盾。在固定化過程中，固定化時間越長，顆粒的機械強度越大，但是通透性卻降低；反之，固定化時間越短，通透性提高，機械強度卻無法保證。因此，在實驗中應該綜合考慮兩個因素，在兩個指標中尋找最優(yōu)的組合。4.3固定化顆粒的最適溫度、最適pH值 固定化后的顆粒，由于在存在狀態(tài)上與游離的微生物不同，因此在最適溫度和最適pH值方面也會有很大的不同。可以通過做對照試驗，測出不同組別在不同溫度和pH值的條件下降解速率，從而找出最佳的降解的溫度和pH值。 同時可以看到，在固定化以后，微生物可以存在的溫度和pH值范圍比固定化以前有了顯著的擴大。4.4微生物的包埋量 由于在制作固定化顆粒的過程中，不可避免的會有一部分微生物沒有包埋到顆粒之中，這部分