Bac_to_bac表達系統(tǒng)中文版說明書

1、Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)試劑盒內(nèi)容物ProductCatalogno.pEi5tBdr*VectorExpressionControlBac-to-Bac®BacnlovirusExpressionSystem10359-0UpFastBac7"1Supplied20jdat05ug/plinTEtpHS.O(10|.Lgtotal)pFastBac"1-GusSupplied:20plat0.2rg/ulinTErpHS.O(4ngtotal)Biic-to-Bac，VectorKitpFastB-1Supplied:20plat05pg/|dinT

2、ErpH8.0(10jigtotal)pFastBacl-GusSupplied:2Dplat0.2ng/plinTE,pH8.0(4ngtotal)KitpF辭他隊由八pFastBacHTBpFastBLic111!?CSupplied:201deachat05Mg/plillIErpH6.0(10|igtotalcieachvector)pFastBac'HT-CATSupplied:15jilat1ng/idinTKpHBX)(15tigtotal)pFastBac11'Dual10712-024pFd5tBk"DualSupplied:20(1砥，pliiiT

3、ETpHB.0(10Mgtotal)pFastBac1'1Dual-Gus/CATSupplied:20plat0.2ng/plinIKpH8.0(4ngtotal)IntroductionOverview:Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)提供快速有效的方法產(chǎn)生重組桿狀病毒。此方法基于讓已經(jīng)轉(zhuǎn)入桿狀病的質(zhì)粒（桿粒）的位點特意轉(zhuǎn)座子的表達框的質(zhì)粒在Ecoli中擴增。Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)主要包括：*pFastBac捐獻質(zhì)粒的選擇，它要能夠產(chǎn)生包含目的位點的表達結(jié)構(gòu)，這個目的基因的產(chǎn)生被桿狀病毒特意位點啟動子控制。* 一個Ecoli宿主，DH10Bac包含桿狀病毒質(zhì)粒（桿

4、粒）和輔助質(zhì)粒，在轉(zhuǎn)染pFastBac表達結(jié)構(gòu)后可以產(chǎn)生重組桿粒。* 一個控制表達的質(zhì)粒，包括Gus和/或CAT基因，以便在感染細胞后產(chǎn)生重組桿狀病毒，表達3-葡萄糖酸酎酶和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶。Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的優(yōu)點：使用這個系統(tǒng)產(chǎn)生重組桿狀病毒較傳統(tǒng)的同源重組有以下優(yōu)點：* 與使用同源重組產(chǎn)生重組桿狀病毒所需的4-6周相比，鑒別純化重組病毒少于兩周* 減少了從斑點篩選重組病毒DN麗包含親緣和非重組病毒的幾率* 可以快速同時進行大量重組，適合表達功能性研究的蛋白選擇pFastBac菌體（Vector）:大量的pFastBac菌體都適于進行Bac-to-Bac表達系統(tǒng)。選擇對于你的

5、需要最合適的菌體。Vector特點今臼pFastBacTM1高水平表達的強AcMNP課乙烯（PHD啟動子用于簡單克隆的大量克隆位點Anderon1996pFastBacTMHT高水平表達的聚乙烯啟動子；N-末端含有6XHis,可以用來純化重組蛋白，并可用TEV蛋白酶切去；提供3個閱讀框Polayes1996pFastBacMDual兩個強啟動子（PH和p10）可以同時表達兩種蛋白；兩個大的克隆位點Harris和Polaye1997指南用途：指南提供了一個對于Bac-to-Bac表達系統(tǒng)的概述，并對以下提供指導：1、克隆目的基因到pFastBacTM供體質(zhì)粒的選擇2、轉(zhuǎn)化pFastBacTM結(jié)構(gòu)

6、到最高效的DH10BaCM產(chǎn)生重組質(zhì)粒3、轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒DN府ij昆蟲細胞產(chǎn)生重組桿狀病毒4、擴增滴定（Amplifyandtiter）桿狀病毒株，使用病毒株感染昆蟲細胞表達目的重組蛋白重要的：Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)是用來幫助你產(chǎn)生重組桿狀病毒，在昆蟲細胞中進行高水平表達目的基因的系統(tǒng)。雖然他可以幫助你很容易的產(chǎn)生桿狀病毒表達你的重組蛋白，但是使用這系統(tǒng)更傾向于有桿狀病毒生物學和昆蟲表達背景的使用者。我們高度推薦使用者具有病毒和組織培養(yǎng)的技術(shù)和知識。Bac-to-Bac表達系統(tǒng)表達系統(tǒng)的成分：表達系統(tǒng)簡單高效的產(chǎn)生重組桿狀不能給黨?；贚uckow1993年的方法，此系統(tǒng)利用了位點

7、特意的專座子Tn7區(qū)簡化和提高重組質(zhì)粒DNA* 系統(tǒng)的第一個成分是用來克隆目的基因的pFastBacTM菌株?；趐FastBacTM菌株的選擇，表達基因被AcMNPV勺PH或p10啟動子控制，在昆蟲細胞內(nèi)高水平表達表達框被Tn7的左右臂包圍，并且包含一個慶大霉素抗性點和SV40多腺昔酸化信號，形成一個微型的Tn7* 第二個主要結(jié)構(gòu)是Ecoli的DH10BacM品系，用來作為pFastBacTM菌株的宿主。DH10BacM細胞包含帶有微型-attTn7靶位點的病毒質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（詳細見下文）。一旦pFastBacTM表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH10Bac細胞，轉(zhuǎn)化就會發(fā)生在pFastBacT菌株的微型Tn

8、7單位和微型-attTn7的靶位點之間產(chǎn)生重組質(zhì)粒。這個轉(zhuǎn)化反應發(fā)生在輔助質(zhì)粒提供的轉(zhuǎn)化蛋白處。如果你已經(jīng)完成了轉(zhuǎn)化反應，你需要分離這個高分子量的重組質(zhì)粒DNA并將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染如昆蟲細胞趨產(chǎn)生重組桿狀病毒，用來進行初步表達實驗。在桿狀病毒株擴增和滴定后，高效價的病毒株可以用來感染細胞，進行大規(guī)模的重組蛋白的表達。桿狀病毒菌株：病毒菌株（桿粒），bMON14272（136KB）在DH10BacEcoli中包括：* 一個低拷貝的微型F復制子* 卡那霉素的抗性標記* 一個來自于pUC載體的編碼LacZa肽的DNA片段，用來接觸病毒轉(zhuǎn)座子，Tn7（微型attTn7）已經(jīng)被插入。插入的微型attTn7

9、不會中斷LacZa肽的閱讀框。桿粒在具有卡那抗性的大的質(zhì)粒EcoliDH10Bac中擴增，在顯色物質(zhì)如Bluo-gal或X-gal和誘導劑IPTG存在時，能補充染色體LacZ的缺失形成藍斑（LacZ+）輔助質(zhì)粒：DH10BacEcoli也包含輔助質(zhì)粒，pMON7124（13.2kb）,他編碼轉(zhuǎn)移酶和四環(huán)素抗性基因。這個輔助質(zhì)粒提供Tn7轉(zhuǎn)化功能。圖示Bac-toBac系統(tǒng)：下圖刻畫了重組病毒的產(chǎn)生和目的基因的表達pFaslBiacdanorRcamtinantDonorPlasmidCompetentDHlOBac11"Eg»Cd%Anltiielie£.carj

10、(lacZjConfisinngRoDorrtbinamlBabindReccmbnantGeneExpnesstoncrVralAiiificalc'n實驗輪廓：流程：下圖揭示了表達目的基因的一般步驟1、pFastBacdonor質(zhì)粒（步驟：目的基因的克?。┑玫?、pFastBac重組體（轉(zhuǎn)化至DN10Bac細胞（含有桿粒和helper）得到3、含有重組桿粒的Ecoli細胞（重新劃線）得到4、驗證過的含有重組桿粒的Ecoli細胞（過夜培養(yǎng)，分離重組桿粒DNA得到5、重組桿粒DNA（使用Cellfectin試劑感染細胞）得到6、P1重組桿狀病毒株（106pfu/ml）（感染昆蟲細胞擴增

11、病毒）得到7、P2重組桿狀病毒株（107pfu/ml）（滴定感染昆蟲細胞）得到8、蛋白的表達培養(yǎng)昆蟲細胞：一般指導：介紹：對于您的桿狀病毒轉(zhuǎn)移菌，我們推薦使用Sf9和Sf21昆蟲細胞作為宿主。在開始你的轉(zhuǎn)化試驗和表達之前，確定你有U獲的Sf9和Sf21,并將其凍存。使用無血清的介質(zhì)：昆蟲細胞可能在無血清的條件下收獲。我們推薦使用Sf900nSFMSf900nSFM對于維持Sf9和Sf21以及對于大規(guī)模生產(chǎn)重組蛋白，都是無蛋白的最優(yōu)的介質(zhì)。昆蟲細胞培養(yǎng)參考指導：維持和傳代昆蟲細胞在貼壁和懸浮條件下冷凍細胞使用無血清的介質(zhì)按比例增加細胞產(chǎn)量一般指導：昆蟲細胞對于環(huán)境很敏感，此外化學和營養(yǎng)因素，物理

12、因素都可以影響昆蟲細胞的成長。需要優(yōu)化以得到最大產(chǎn)量。考慮以下培養(yǎng)條件：* 溫度：細胞的感染和成長的最適合范圍是27-28度* PH:對于許多培養(yǎng)系統(tǒng)6.1-6.4時合適的范圍。Sf900IISFM在此范圍內(nèi)支持一般的空氣和開蓋培養(yǎng)* 同滲重摩：鱗翅類細胞使用介質(zhì)的最優(yōu)同滲重摩是345-380mOsm/kg* 通風：對于最優(yōu)生長條件和蛋白的表達，昆蟲細胞要求被動的通氧。積極的通氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%* 剪切力：懸浮培養(yǎng)產(chǎn)生機械剪切力。生長的昆蟲細胞在含有血清的介質(zhì)中(10%-20%FBS),對于細胞的剪切力一般會得到足夠的保護。如果你的細胞在無血清條彳下生長，加入剪切力保護劑例如P

13、luronicF-68。注意：在Sf900nSFM中生長的細胞不需要加入剪切力保護劑。轉(zhuǎn)染的細胞：你需要的是對數(shù)期的細胞95啜育能力，可以完成成功的轉(zhuǎn)染。產(chǎn)生重組的pFastBacTM菌株(Vector)一般信息：介紹：為了產(chǎn)生包含目的基因的重組質(zhì)粒，使用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)，你需要使用限制酶消化和連接，將你的目的基因克隆進入pFastBac菌的其中一種。一般分子生物學技術(shù)：為了幫助限制酶消化和連接DNA的序列，需要其他一般的分子生物學技術(shù)擴增和保存質(zhì)粒：pFastBac菌種和他的相應的表達對照質(zhì)粒包含氨茉青霉素抗性基因，可以使用Ecoli進彳TAmp篩選。為了擴增和保存pFa

14、stBac和pFastBac對照質(zhì)粒，使用以下方法：1、使用載體株系感染一個recA,endAEcoli株，例如Top10,DH10B者DH5a2、在含有100ug/mlAmp的LB瓊脂糖平板選擇轉(zhuǎn)化株。3、選擇含有質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子制備甘油菌以便長期保存克隆進入pFastBacTM1介紹：為了幫助你設計策略克隆你的目的基因進入pFastBacTM1,參考以下建議和表格克隆考慮事項：pFastBacTM1菌株是非融合菌株(無融合標簽)。為了保證重組蛋白的表達，你的插入必須含有：*一個ATG起始密碼子用于轉(zhuǎn)錄起始*一個終止密碼子。注意：終止密碼子包含在所有三個閱讀框中的多克隆位點中注意：重組蛋白的產(chǎn)生

15、要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始ATG一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG(ATT),盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測。pFastBacTM1的多克隆位點：下圖是pFastBac?的多克隆位點。限制位點標出來以便顯示實際切刻位點。潛在的終止密碼子下劃線表示。pFastBacTM1的全序列可以從網(wǎng)站下載。pFastBacTM1的圖譜和描述見后綴390139514001405141014151StartofTranscriptionPolyhedrinpromotej>TAGATCATG

16、GAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTAwild-typeATGmutcrtedloATTTTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCBamHlRsrBssHIIJIGGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCCGGTCCGAAGCGCEcoRIStuSaiSstSpeNotNspVIIIIIIIGCGGAATTCAAAGGCCTACGTCGACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGCTTTCXbaIP5tIXhoISphIKpnIHindIIIIIIIIIGAAT

17、CTAGAGCCTGCAGTCTCGAGGCATGCGGTACCAAGCTTGTCGAGAASV40pol/adenylationsignalGTACTAGAGGATCAIAATCAGCCATACCACATTTGTAGAGGTTTTACTTG克隆進入pFastBacTMHTA,B,C介紹：pFastBacMHT載體由三個讀碼框(A,B,C)提供的多克隆位點從而實現(xiàn)克隆目的基因，并且在N端帶有6XHis。克?。簆FastBacTMHT菌株是融合菌株。為了保證表達重組蛋白，你必須：*克隆你的基因要帶有ATG位于4050-4052堿基對間。這個將會產(chǎn)生融合表達，帶有6XHis標簽，可以用TEV切除*

18、你的插入要含有終止密碼注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始ATG一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG(ATT),盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測pFastBactmHtA的多克隆位點：下圖是pFastBactmHtA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點。StartolTran&criplionPolyhBdriripromoterA390LTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATA

19、AGTAwild-lypcATGmutaledtoATT=13951TTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCC4001GGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCGGTCCGAAACC40506xHi&tagLAGGATATCTyrAspHeATGICGTACTftCCATCACCATCACCATGAGGATMetSerTyrTyrHisHisHisHisHisHisAspTEVrecognitionsiteEheIWcoI的加HI4092413441764213CCAACGProThrEgdRI

20、IGAATTCG1UPheNspYICTTTCGLj二占三匚ACCThrAAALysGAAAACGluAsnSfulIGGCCTAGlyL&UXbaIIAATCTAAstLeuCTGTATLeuryrMlICGTCGAArgArgTTTPMCAGGGCGCCATGGATCCGGln.GlyAlaMetTEV3g心siteAspProS道I酣啟IN(rtIIICGAGCTCAACTAGTGCGGCCGArgAlaGluLeuVaiArgPro產(chǎn)期IXhoIIIGAGCCTGCAQTCTCGGluPt。AlaVaiSerSphIAGGCATGCGArgHisAlaKpnlH仃rdIIIII

21、GTACCAVaiProAGCTTGSerLeuTCGAGAAGTACTAGASerArgSerThrArgSV40polyadenvlalionsignulGGATCATAATCAGCCATACCACGlySer*pFastBactmHtB的多克隆位點：下圖是pFastBactmHtA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點?？蜃〉暮烁仕犸@示出的是易變區(qū)域。StartofTranscriptionPdyhediinpromoterA3901TAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTAwild-typeAT

22、GmutatedtoATT13951TTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCC4001GGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCGGTCCGAAACCGxHistaq4050409241344176421BATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATMetSerTyrTyrHisHisHisHisHisHisAspTACGATATCTyrAspILeTEVrecognitionsiteEheINcolBamHICCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGC'G

23、CCATG昌AICCProThrThrGluAsnLeuTyrPheGiniGlyAlaMetGlySerTEVcRavagesiteEcoRIStuISeiISstIISpeIWofIGGAATTCAAAGGCCTACGTCGACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGLylieG1UArgProThrSerThrSerSerLeuVmlAlaAlaNspVXba1PstlXho11SphIIKpn|GCTTTCGAATCTAGAGCCTGCAGICTCGAGGCATGCGGTACCAlmPheGluSerArgAlaCysSerLeuGluAlaCysGlyThr7111SV40polya

24、denylatlonsignalAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACCA.LysLeuVaiGluLysTyr*pFastBactmHtC的多克隆位點：下圖是pFastBactmHtA的多克隆位點。其實ATG用黑體標出。限制性位點標出來以便顯示實際切刻位點。框住的核甘酸顯示出的是易變區(qū)域。注意pFastBacTMHTC在XbaI位點內(nèi)有一個終止密碼子，他在N端標簽框內(nèi)。確定你的基因的5'端是在XbaI位點上游開始。ownorTranscriptionPolphedrirtpromoterA3901TAGATCATGGAGATAATTAAAA

25、TGATAACCATCTCGCAAATAAATAAGTAwild-typeATGmutatedtoATT3951TTTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCC4001GGATTATTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCTCGGTCCGAAACCGxHistag4050IIATGTCGTACTACCATCACCATCACCATCACGATTACGATATCMetSerTyrTyrHisHisHisHisHisHisAspTyrAspILe4092413441764221TEVrecognitionsiteEheINeoIB

26、atrtHIIIlI-CCAACGACCGAAAACCTGTATTTTCAGGGCGCCATGIg3gATCProThrThrGluAsnLeuTyrPheGlnGlyAlaMetGLylie-TEVcieavageatehCORISWIIICGGAATTCAAAGGCCTACArgAsnSerLysAlaTyrSa/1IGTCGACVaiAspSsfISpeINotIIIIGAGCTCACTAGTCGCGGCGluLeuThrSerArgGlyCGCArc：NspVITTTCGAPheArgXiaIPstXhoSphIKpnHindIIIIIIIIIATCTAGAGCCTGCAGTCTCGA

27、GGCATGCGGTACCAA*SV40polyadenylationsignalGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAATCAGCCATACC克隆進入pFastBacTMDual介紹：pFastBacTbual包含兩個多克隆位點，可以同時表達兩個異源基因，一個通過PH啟動子控制，另一個通過P10啟動子控制。參見下列建議以便有助于你的基因克隆克隆事項：pFastBacTbual是一個非融合載體。為了保證重組蛋白的表達，你的插入必須含有以下兩點*一個ATG起始密碼子*如果你不使用多克隆位點中的終止密碼子，就必須要有一個終止密碼子注意：重組蛋白的產(chǎn)生要求你的插入包含一個轉(zhuǎn)錄起始A

28、TG一般來說，轉(zhuǎn)移載體包含完整的PH引導序列，可以提高表達的產(chǎn)量。對于插入克隆上游的聚乙烯啟動子，注意到蛋白翻譯能夠起始于多克隆位點上游突變的ATG(ATT),盡管如此，從這個位點起始的效率是低的，而且一般不干涉表達和重組蛋白的檢測。PH啟動子下游的多克隆位點：下圖是pFastBacTMDual中PH啟動子下游的多克隆位點的圖示。限制性位點標記出來顯示了實際的切刻位點。潛在的終止密碼子有下劃線標出。scanofPol/hedrmprornoterTran&criprion4481ATGGAGATAATTAAAATtATAACCATCTCGCAAATAAATAACTATTTTACwilt

29、-typeATGmuiatedtoAIT4531TGTTTTCGTAACAGTTTTGTAATAAAAAAACCTATAAATATTCCGGATTA8a/nHIRsrllas6HlifCORI4561TTCATACCGTCCCACCATCGGGCGCGGATCCCGGTCCGAAGCGCGCGGAAStdSalS&tI2萍IWoM4631TTCAAAGGCCTACGTCGACGAGCTCACTAGTCGCGGCCGCTTTCGAArCTPsiIXholMhdIII461AGAGCCTGCAGTCTCGACAAGCTTGTCGAGAAGTACTAGAGGATCATAAT874。polya

30、d已nyfeHun$1第居I4731CAGCTCATACCACATTTGTAG&GGTTTTA匚TTGCTTTAAAAACCTCCCACP10啟動子下游的多克隆位點：下圖是pFastBacTMDual的AcMNPVp10啟動子下游的多克隆位點。限制性位點標記出來以便顯示實際切刻位點。潛在的終止密碼子標記下劃線。StartofTranscriptionIpi。promorA4460TATACGGACCTTTAATTCAACCCAACACAATATATTATAGTIAAATAAGA4410ATTATTATCAAATCATTTGTATATTAATTAAAATACTATACTGTAAATTAI

31、ISmallXhoI.4360CATTTTATTTACAATCACTCGACGAAGACTTGATCACCCGGGATCTCGAGNeoIM)elPvuIINsiSphIKpnlIIIIII4310CCATGGTGCTAGCAGCTGATGCATAGCATGCGGTACCGGGAGATGGGGGAHSVtkpclyadenylationsignal4260GGCTAACTGAAACACGGAAGGAGACAATACCGGAAGGAACCCGCGCTATG轉(zhuǎn)化和分析介紹：如果你已經(jīng)完成了你的連接反應，你就要準備把你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化進Ecoli了。很多Ecoli宿主菌和轉(zhuǎn)化程序都是可

32、以使用的。一般推薦轉(zhuǎn)化Ecoli和分析轉(zhuǎn)化在下面列出Ecoli宿主：一旦你把你的插入序列克隆進入了pFastBacTM，你需要轉(zhuǎn)化連接反應到Ecoli,并選擇優(yōu)Am而性的轉(zhuǎn)化株。你可以使用任何recA,endAEcoli菌。包括Top10,DH10B或者DH5a進行轉(zhuǎn)化。不要轉(zhuǎn)化連接反應進入DH10Bac細胞。注意TOP1解口DH10EB受態(tài)細胞可以從Invitrogen得到轉(zhuǎn)化方法：你可以選擇使用任何方法對Ecoli進行轉(zhuǎn)化?；瘜W轉(zhuǎn)化是最便利的方法，而電轉(zhuǎn)對大質(zhì)粒是最有效的方法。選擇好轉(zhuǎn)化株，使用含有100ug/mlAmp的LB平板。轉(zhuǎn)化株分析：一旦你得到Am近性轉(zhuǎn)化株，我們有以下推薦：1、

33、選出10個轉(zhuǎn)化株，在含有100ug/ml的Amp的LB或S.O.B培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)2、使用你選的方法分離質(zhì)粒DNA我們推薦使用公司的試劑盒3、使用限制性方法分析質(zhì)粒，證明是重組質(zhì)粒并證明插入起始的正確。使用限制性酶或者酶化合物對Vector和插入端各進行一次酶切。使用PCR寸轉(zhuǎn)化株進行分析：你也可以使用PCR方法對陽性轉(zhuǎn)化株進行分析。使用合適的PCR引物和Amp條件。如果你是第一次使用此方法，你最好使用限制性分析作平行試驗。使用錯誤的引物或污染的平板可能會得到假象。以下方法可以給你提供便利。其他方法也是可用的。需要的材料：高保真PCRSuperMix,合日的PC硒后引物過程：1、對于每個樣品，在

34、0.5ml的小離心管加入48ul的高保真PCRSuperMix和各1ul的前后引物。2、選出10個克隆，在上述離心管中進行重懸（記得做一個Patch板保護克隆以便進行更深的分析）3、94度10分鐘溶解細胞滅活核酸酶4、20-30個循環(huán)進行擴增5、延伸使用72度10分鐘。4度儲存6、瓊脂糖凝膠電泳檢測測序：對于你的結(jié)構(gòu)需要進行測序證明目的基因是正確的起始以便表達。如果你是將基因克隆進入了pFastBacTMHT,證明的基因進入了N末端標簽的讀框中。長期保存：一旦你證明了測序的正確，確定克隆的純度并制作甘油菌長期保存。推薦儲存質(zhì)粒DNA在-20度1、在含有100ug/ml的LB平板上對原始的克隆進

35、行劃線培養(yǎng)2、挑單克隆在1-2ml含有Amp的LB撫育3、培養(yǎng)至穩(wěn)定期4、在0.85ml的培養(yǎng)物中混合0.15ml的過濾甘油，轉(zhuǎn)到冷凍小管5、-80度儲存重組質(zhì)粒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)化至UDH10BacEcoli介紹：一旦你有了你的pFastBacTM結(jié)構(gòu)，你就可以準備轉(zhuǎn)化純化的質(zhì)粒DNA進入DH10Ba?Ecoli,轉(zhuǎn)變成為桿粒。你可以使用藍/白斑選出含有重組桿粒的克隆。Bac-toBac表達系統(tǒng)提供高效DH10BacM感受態(tài)細胞。陽性對照：每個pFastBacTM質(zhì)粒都提供相應的陽性對照用來作為陽性轉(zhuǎn)染和表達對照（下表）。根據(jù)pFastBacTrVecctor的使用，我們推薦在你的DH10Bac轉(zhuǎn)染試

36、驗中作相應的對照。pFastBacVectorControlPlasmidpFastBac"!pFastBacl-GuspFastBacHTpFastBacHT-CATpFastBacDualpFastBac*Dual-Gus/CAT所需材料：開始之前你需要有以下材料* 純化的pFastBacTM結(jié)構(gòu)（200pg/ul儲存于PH8.0的TE）* 陽性表達對照* 高效DH10Ba（TM感受態(tài)細胞（表達系統(tǒng)提供，每個轉(zhuǎn)化試驗使用1管細胞）* pUC19（與DH10BaL起提供，用來做對照）* LB平板，包含Kan,Gen（慶大），Tetracycline（四環(huán)素），Bluo-gal（鹵代

37、口引喋基-beta-D-半乳糖甘）和IPTG。（每個轉(zhuǎn)化3個板，使用新鮮平板，推薦見下文）* LB板含有100ug/mlAmp（用于pUC19轉(zhuǎn)化對照）* S.O.C介質(zhì)* 15ml圓底塑料管* 42度水域和37度搖床及37度培養(yǎng)箱。你需要準備LB瓊脂糖平板，包含50ug/mlKan,7ug/mlGentamicin,10ug/mltetracycline,100ug/mlBiuo-gal,40ug/mlIPTG,用來進行DH10BacM轉(zhuǎn)化株的篩選?？梢詮奈夜绢A訂抗生素，Bbluo-gal,IPTG,在后面有制備平板的指導。如果你正準備的LB平板使用的是事先混合好的，我們推薦使用Luria

38、BrothBase代替LB。使用LB板將會降低顏色敏感度，并可能降低克隆的數(shù)量。注意：在藍/白斑篩選中使用Bluo-gal代替X-Gal。Bluo-gal產(chǎn)生的藍斑顏色要比X-Gal深。準備轉(zhuǎn)化：對于每個轉(zhuǎn)化，你都需要一小瓶感受態(tài)細胞和三個平板。*42度水域平衡*37度烘板30分鐘*室溫放置SOC質(zhì)*對于每個轉(zhuǎn)化試驗預冷一個15ml管子轉(zhuǎn)化過程：按照以下過程用高效DH10BacM感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化pFastBacTM結(jié)構(gòu)。我們推薦做陽性對照的轉(zhuǎn)化來幫助你證明你的結(jié)果。1、整管高效DH10BacM感受態(tài)細胞冰上解凍。2、每個轉(zhuǎn)化試驗，輕輕地混合，將100ul高效DH10BacM感受態(tài)細胞倒入預冷的1

39、5ml管子3、向細胞中加入適量的質(zhì)粒DNA輕輕混合。千萬不要上下吹吸混合* pFastBacTM結(jié)構(gòu)：1ng(5ul)* pFastBacTM對照質(zhì)粒：1ng* pUC19對照:50pg(5ul)4、冰上撫育30分鐘5、42度熱激45秒6、立即冰上2分鐘7、加入900ul室溫的SO*養(yǎng)基8、pFastBacTM轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)4小時。pUC19轉(zhuǎn)化：37度225轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)1小時9、對于每個pFastBacTM的轉(zhuǎn)化：準備10折連續(xù)(不知道什么意思)用SO麗釋的細胞(10-1,10-2,10-3),每個稀釋用100ul鋪一個LB平板，平板包含50ug/mlKan,7ug/mlGent

40、amicin,10ug/mltetracycline,100ug/mlBiuo-gal,40ug/mlIPTG。對于pUC19轉(zhuǎn)化：用SO*養(yǎng)基1:100稀釋細胞，鋪100ul稀釋物在含有100ug/mlAmp的LB平板。10、37度撫育48小時。分析篩選的克隆(參見推薦)。注意：我們不推薦早于48小時挑單克隆，因為這樣可能會難于區(qū)分藍白斑。重要的：微型Tn7插入到微型attTn7附屬位點會干擾LacZa肽的表達，所以包含重組質(zhì)粒的克隆在藍色背景下是白色的，可能隱藏在未改變的質(zhì)粒中。選擇白斑分析。真正的白斑克隆比較大；因此為了避免選擇成假陽性，選擇最大的，最獨立的白斑。避免挑出現(xiàn)灰色的或者在中

41、間的菌落，因為他們可能是包含空質(zhì)粒的細胞核重組細胞的混合。驗證顯性：1、挑10個白色的克隆，重新劃線在新鮮LB平板(50ug/mlKan,7ug/mlGentamicin,10ug/mltetracycline,100ug/mlBiuo-gal,40ug/mlIPTG)。37度過夜培養(yǎng)。2、在包含Bluo-Gal和IPTG的重新劃線的平板上選出單克隆證明是白色的顯性，嫁接至有50ug/mlKan,7ug/mlGentamicin,10ug/mltetracycline的液體中3 、使用我公司的試劑盒抽提重組質(zhì)粒DNA選擇性的，你可以使用附錄提供的操作步驟。這個過程源于抽提大的質(zhì)粒DNA(>

42、;100kb),適用于分離質(zhì)粒DNA4 、分析重組質(zhì)粒DNAffi明成功轉(zhuǎn)化到了桿粒中。我們推薦使用PCR分析卞f粒DNA注意：適用瓊脂糖凝膠電泳可以證明轉(zhuǎn)化的成功與否，他可以分出高分子量的DNA這個方法要比PCR分析可信度低，因為高分子量DN蝠很難見到的。使用PC的析重組質(zhì)粒介紹：重組桿粒DNAM大于135kbo既然限制性分析很難完成這么大的DNA>析，我們推薦使用PC的析鑒定重組桿粒中的目的基因。桿粒包含M13正負引物位點，位于LacZa互不區(qū)域的微型attTn7位點兩側(cè)，可以完成PCR僉驗。本BacmidDNAM13&40)M13FowardReverse節(jié)提供使用M13引

43、物的PCR僉驗指導。TransposedpFastBacsequence使用M13弓I物進行PC的析：使用PCRt證明你的目的基因在重組桿粒中，你可能會:使用M13Forward使用M13Forward(-40)和M13Reverse弓I物(-40)或M13Reverse引物于你的插入片段雜交成聯(lián)合物PrimerSeqiienteCatidogiio.M13Forward(70)dGTTTTCCCAGTCACGAC3rN540-02Ml3RjeveisedlCAGGAAACAGCTATGACN530-02DNA聚合酶：你可能會使用任何DNA聚合酶在你的PCR式驗中，包括PlatinumTaq酶

44、。如果希望PCRT物4kb,我們推薦使用聚合酶混合物。例如高保真的PlatinumTaq酶得到PCR產(chǎn)物：使用下面過程擴增重組桿粒DNA適用M13正反引物和PlatinumTaq酶。如果你使用M13F或M13R與一個你的基因特意引物混合，你需要自己決定擴增的條件。如果你使用其它的聚合酶，依照供應商提供的建議。注意：如果你的才1入片段4kb擴增條件需要被優(yōu)化.1、每個樣品，在0.5ml微型管子中裝入50ul的量進行PCR反映重組桿粒DNA(100ng)1ul10XPCRBuffer5ul10mMdNTPMix5ul50mMMgC21.5ulPCR弓I物(1.25ul/10uM)2.5ul蒸儲水3

45、8.5總體積50ul2、一滴礦物油覆蓋3、一下參量進行擴增StepTimeTemperatureCyclesInitialDenaturation3minuter93INDenaturation45seconds9425-35XAnnealing45&etond>55Extension.5minutes72FinalExtension772IX4、從反應產(chǎn)物吸取5-10ul進行瓊脂糖電泳分析你將會看到：如果轉(zhuǎn)化發(fā)生了，而且你使用的是M13正負引物擴增，你將會在電泳上看到下列PCR產(chǎn)物大小SampleSizeofPCRProductBaanidalone-300bpBacrnidt

46、ransposedwithpFastBac7'"!-2300bp+sizeofyourinsertBacinidtransposedwithpFastBacnEl-Gus-4200bpBaciiiidtransposedwithpFastBacHI-2430bp+sizeofyourinsertBacmidtransposedwithpFastBac“HT-CAT3075bpBacinidtransposedwithpFastBac''Dual-25oObp+胃izeofyou:insertBaaiiidtranspoGudwithpFastBac"

47、Dtial-Gus/CAT-5340bp如果你使用的是M13和你的特異引物進行的擴增，你需要決定PCR產(chǎn)物是否是希望的。12頁的圖有助于你計算。重組桿狀病毒的產(chǎn)生轉(zhuǎn)染昆蟲細胞:介紹：一旦你證明了你的重組桿粒含有你的目的基因，就可以準備進行昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染了，以產(chǎn)生重組桿狀病毒。本章提供指導和建議以便完成昆蟲細胞的轉(zhuǎn)染準備質(zhì)粒：你可以使用任何方法準備純化的重組桿粒DNA桿粒DNA、須沒有酚和NaCl的污染，他們會殺死細胞，鹽類會干擾脂類復合物，降低轉(zhuǎn)染效率。我們推薦使用本公司產(chǎn)品提質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染方法：推薦使用一個陽離子脂質(zhì)體，例如Cellfectin試劑進行轉(zhuǎn)染。此試劑用來提供給表達系統(tǒng)使用。Cell

48、fectin試劑：不做翻譯Cellfectin5Reagentisa1:1,5（M/M）BposomeforniulationofthecationiclipidN,N：,N三Nffl-Tetramethyl-XN1,Nn,N-tetrapalmitylspermine（Kvl-TFS）anddloleoylphosphatidylethaiioLmiine（DOPE）innieinbiine-filteredwater-CellfectiniReagentliasbeenfoundtobesupeiiarfortransfectionofandotherinsectcells.昆蟲細胞系：推

49、薦使用Sf9和Sf21進行轉(zhuǎn)染。HighFive?andMimic?Sf9不推薦因為他們轉(zhuǎn)染效率低下。不過，如果你有了你的桿狀病毒株，你可以進行HighFive?andMimic?Sf9表達試驗。轉(zhuǎn)染介質(zhì)：為了高效的轉(zhuǎn)染，我們推薦在無Grace的昆蟲細胞培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染。注意Grace的昆蟲細胞培養(yǎng)基應該不含有FBS（血糖），因為蛋白在血糖和其補充物中會與Cellfectin試劑互作，影響轉(zhuǎn)染。注意：如果你在Sf-900nSFM中收獲了Sf9或Sf21,你可以在不含有Grace的培養(yǎng)基中完成轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后可以容易的將Sf-900nSFM轉(zhuǎn)變回去陽性對照：如果你有了從pFastBac對照質(zhì)粒中得到

50、的重組桿粒，我們推薦，包括這個陽性對照在你的試驗中和轉(zhuǎn)化中能夠評估你的結(jié)果。在這些桿粒中，包括3-葡糖甘酶（GuS）和/或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶（CAT將會在PH或者P10啟動子控制下表達。在轉(zhuǎn)染過后，表達的Gus和CATW以適當進行驗證。所需材料：開始之前需要有下列材料：* 從pFastBacTM結(jié)構(gòu)（500ng/ulTE溶解，PH8.0）中純化的重組桿粒DNA* 從合適的pFastBacTM對照結(jié)構(gòu)中純化的重組桿粒DNA* 合適培養(yǎng)基收獲的Sf9或者Sf21*Cellfectin試齊J（4度保存）*Grace's昆蟲細胞培養(yǎng)基，未被補充的（培養(yǎng)基不含有補充劑，F(xiàn)BS或者抗生素）*6孔培養(yǎng)

51、板或者其它組織培養(yǎng)用具*12X75mm滅菌管*培養(yǎng)昆蟲細胞的完全培養(yǎng)基計算出你的轉(zhuǎn)染試驗所需的Sf9細胞數(shù)量，進行擴增。轉(zhuǎn)染前確定細胞健康且繁殖能力97%轉(zhuǎn)染條件：我們通常使用下列條件在Sf9中擴增桿狀病毒株。對于你的轉(zhuǎn)染試驗這些條件應該作為一個起始點，你可以通過改變DN解口Cellfectin試劑的濃度以及細胞密度對條件進行優(yōu)化。ConditionAmountTissuecultureplatmsize(3-well(35miTi)plate(onewellpeibacmid)Numberofcellstotransfect9X105cellsAmounto£bacmidDNA1L

52、ig(canvdiyfrom1to2pg)AmountotReagentbulvaryfrom1.5to轉(zhuǎn)染步驟：適用下列步驟在6孔板進行Sf9細胞的轉(zhuǎn)染。如果你想在其它細胞培養(yǎng)用具中轉(zhuǎn)染細胞，你需要對你的條件進行優(yōu)化。記得使用無補充的Grace's培養(yǎng)基，他不含有FBS或抗生素1、在6孔板或35mmS織培養(yǎng)板，與每個孔2ml含有抗生素的培養(yǎng)基中（例如：2ml的SF900nSFMI&含50單位/ml青霉素和50ug/ml鏈霉素）接種9X105Sf9細胞。2、27度細胞最少接觸1小時3、對于每個轉(zhuǎn)染的樣品，準備桿粒DNACellfectin試劑混合在12X75mnt勺滅菌管中1）

53、將1ug純化的桿粒DNAW釋進入100ul未補充Grace培養(yǎng)基2）完全混勻Cellfectin試劑，翻轉(zhuǎn)混合5-10次。吸出6ulCellfectin試劑稀釋進100ul未補充Grace3）使用稀釋的Cellfectin試劑連接稀釋的桿粒DNA（總體積約210ul）。輕混合，室溫撫育15-45分鐘。4、在DNA/I旨肪混合體撫育過程中，從細胞中除去培養(yǎng)基并用2ml未補充Grace培養(yǎng)基清洗。棄去清洗培養(yǎng)基。5、向每個含有混合體的管子中加入0.8ml未補充Grace培養(yǎng)基，清混勻，將混合體加入到含有細胞的孔中。6、27度培養(yǎng)5小時7、棄去DNA脂肪混合體，向細胞中加入2ml全培養(yǎng)基（例如SF9

54、00SF的有抗生素）8、27度潮濕條件撫育72小時或者指導你開始能夠看到病毒感染的現(xiàn)象。提取P1病毒株。分離P1病毒株介紹：帶有芽抱的病毒應該在轉(zhuǎn)染以后釋放入培養(yǎng)基72小時。但是，如果你的轉(zhuǎn)染效率不好，細胞可能在轉(zhuǎn)染后的4-5天也沒有被病毒感染的跡象。轉(zhuǎn)染過后的72小時，你需要親自檢查細胞是否有感染信號（下表）一旦細胞出現(xiàn)感染，使用下列步驟從培養(yǎng)基中收獲細胞。感染細胞的特性：使用倒差顯微鏡在250-400X觀察感染細胞時，可以看到病毒感染的細胞具有以下特點：感染記號顯性描述早期（第一個24小時）細胞直徑增加可以看到直徑增大了25-50%細胞核增大細胞核可能充滿細胞晚期（24-72小時）細胞停止

55、增長與單個細胞相比，細胞不再增大出現(xiàn)顆粒體病毒芽彳刨亙號，出現(xiàn)小泡分離細胞從平板或曲頸瓶脫離很晚期（大于72小時）細胞消亡細胞出現(xiàn)消亡，單層細胞開始出現(xiàn)消亡制備P1病毒株：1、一旦從第8步得到轉(zhuǎn)染細胞，上述的晚期轉(zhuǎn)染現(xiàn)象出現(xiàn)，就可以從每個孔中收集含有病毒的細胞,并轉(zhuǎn)入滅過菌的15ml帶蓋管子。500Xg離心5分鐘除去細胞和大的碎片2、將上清轉(zhuǎn)到新的15ml離心管。這就是P1病毒株。4度避光儲存。儲存信息見下頁注意：如果你希望濃縮的病毒株，你可以在離心后，使用0.2um低蛋白吸附的濾器完成。病毒株的儲存：按下列條件儲存：1、避光，4度2、如果培養(yǎng)基不含血清，加入FBS至終濃度為2%血清可以作為蛋白酶底物。3、對于長期保存，重新擴增后保存整株病毒于-80度4、不要在4度時儲存經(jīng)常使用的病毒。重復凍融會降低病毒的滴度。下一步：得到你的純化P1桿狀病毒株之后，你可以：1、擴增毒株（下節(jié)詳細介紹）這個過程推薦得到最高滴度的毒株，而且在你的試驗中優(yōu)化結(jié)果